玉竹不定芽的誘導(dǎo)與增殖研究

趙春莉　霍妍　劉子平

摘要：以玉竹[Polygonatum odoratum （Mill.） Druce]根莖、莖段、葉片為外植體，研究了玉竹不定芽的誘導(dǎo)和增殖體系。結(jié)果表明，最適宜外植體的滅菌時(shí)間為75%的乙醇處理10 s配合0.1%的HgCl2處理7 min，其污染率為13.3%；最適宜的外植體為根莖，成活率為90%；經(jīng)過7 d的4 ℃低溫處理的外植體，比未經(jīng)處理的分化率高出了24個(gè)百分點(diǎn)；在玉竹增殖培養(yǎng)中，最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L，最適宜增殖培養(yǎng)的蔗糖濃度為30 g/L，分化率達(dá)到了86.7%，并且植株生長(zhǎng)狀態(tài)良好，植株健壯。

關(guān)鍵詞：玉竹[Polygonatum odoratum （Mill.） Druce]；不定芽；根莖；增殖

中圖分類號(hào)：S567.23+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）19-3679-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.021

Abstract： The rhizomes，stems and leaves of Polygonatum odoratum （Mill.） Druce were used as explants to study the adventitious bud induction and propagation. The results showed that，the optimum time for sterilization of explants was ten seconds by 75% alcohol then treated seven minutes with 0.1% mercuric chloride，the pollution rate was only 13.3%. The survival rate of roots as optimum explants was 90%； after cold treatment for seven days of 4 ℃，differentiation rate of the explants was 24 percentage point higher than untreated explants. The optimum medium was MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L in the proliferation culture of P. odoratum （Mill.） Druce. The optimum sucrose concentration was 30 g/L，the differentiation rate reached 86.7%，and the plant growth status was stronger.

Key words： Polygonatum odoratum （Mill.） Druce； adventitious buds； rhizome； proliferation

玉竹[Polygonatum odoratum （Mill.） Druce]為百合科多年生草本植物，別名尾參、玉參、鈴鐺菜、甜根草[1]。其性微寒、味甘，具有潤(rùn)燥養(yǎng)陰、生津止渴的功效，并可用于口渴咽干、肺胃陰傷、內(nèi)熱消渴的治療[2]。玉竹的藥用價(jià)值十分豐富，其提純物能增強(qiáng)人體的免疫力，煎劑服有擴(kuò)張血管、抗衰老、抗心肌缺血、抗腫瘤的作用。玉竹不僅可以藥食兩用，還可以用于園林中，宜植于林下或建筑物遮陰處及林緣作為觀賞地被植物，也可盆栽觀賞[3-8]。由于玉竹的廣泛應(yīng)用，而野生玉竹的數(shù)量在逐年減少，且常規(guī)的繁殖方式繁殖速度慢，產(chǎn)量低，因此，探究玉竹快速的繁殖途徑非常重要。

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于玉竹的研究較少。寧慧等[9]在玉竹組織培養(yǎng)與快速繁殖的研究中發(fā)現(xiàn)，其易于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體為根狀莖，尤其具有潛伏芽的根狀莖段更有利于玉竹愈傷組織的誘導(dǎo)。由此可知，在玉竹的組織培養(yǎng)中，根狀莖較適于作為外植體。宋艷梅等[10]用玉竹的花蕾和根莖作為外植體、寧慧等[9]用玉竹的根狀莖作為外植體分別對(duì)玉竹進(jìn)行了組織培養(yǎng)。而張卓等[11]發(fā)現(xiàn)在玉竹愈傷組織的誘導(dǎo)中，6-BA、NAA、2，4-D均有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和不定芽的分化。本文對(duì)影響玉竹不定芽誘導(dǎo)和增殖的主要因素進(jìn)行了研究，包括最佳滅菌方案、最適外植體、最適激素濃度配比等的研究，旨在找出玉竹組織培養(yǎng)的最佳方案，以期達(dá)到工廠化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園林教學(xué)基地采集的玉竹完整植株，采集后選取無(wú)病蟲害、無(wú)機(jī)械損傷、生長(zhǎng)健壯的玉竹植株作為供試材料。

1.2 玉竹外植體的啟動(dòng)培養(yǎng)

1.2.1 外植體滅菌方法的篩選 將處理過的玉竹外植體先用流水沖洗表面浮土，接著用洗潔精清洗，再用流水沖洗3 h，最后用去離子水清洗干凈后，放入超凈工作臺(tái)上的無(wú)菌燒杯中，用75%的乙醇浸泡，無(wú)菌水沖洗5～6次，再用0.1%的HgCl2消毒，無(wú)菌水沖洗5～6次，每次停留3 min，期間不斷振蕩。外植體的滅菌處理見表1。

1.2.2 最適外植體的篩選 選擇玉竹的根莖、莖段以及葉片作為外植體，滅菌后，吸干表面水分，去除受損不健康的組織后，切取0.5～1.0 cm的小段，接種到MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理10個(gè)外植體，3次重復(fù)。給予相同的溫度與光照，培養(yǎng)30 d后觀察最適合組織培養(yǎng)的外植體，并記錄其成活數(shù)與成活率。

1.2.3 低溫處理誘導(dǎo)玉竹不定芽 取兩份等量的玉竹莖段外植體，一半在4 ℃下處理，一半在常溫下（未經(jīng)低溫處理），放置7 d后取出，分別接種到MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理10個(gè)外植體，3次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)其不定芽的分化數(shù)、分化率以及幼苗長(zhǎng)勢(shì)，從中篩選出更有利于不定芽誘導(dǎo)的材料。

1.3 增殖培養(yǎng)

1.3.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比 將新萌發(fā)的玉竹不定芽接種到繼代增殖培養(yǎng)基上，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)置不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA與NAA濃度配比（表2）。每種處理10個(gè)不定芽，3次重復(fù)，30 d后觀察并統(tǒng)計(jì)增殖芽總數(shù)、增殖系數(shù)以及幼苗長(zhǎng)勢(shì)。

1.3.2 蔗糖濃度的設(shè)置 將誘導(dǎo)出的不定芽接種到增殖培養(yǎng)基中，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的蔗糖，設(shè)置10、20、30、40 g/L 4個(gè)濃度梯度。30 d后觀察并比較不同蔗糖濃度對(duì)玉竹不定芽增殖的影響，統(tǒng)計(jì)并觀察其分化數(shù)、分化率以及生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.4 培養(yǎng)條件

在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中加入蔗糖30 g/L，瓊脂12～13 g/L，pH 5.5～6.0，培養(yǎng)溫度（23±2） ℃，光照時(shí)間24 h/d，光照度30～40 μmol/（m2·s），光源為日光燈。

1.5 數(shù)據(jù)計(jì)算

污染率=（污染的植株數(shù)/接種數(shù)）×100%；分化率=（分化芽外植體數(shù)/接種數(shù)）×100%；誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)芽外植體數(shù)/接種數(shù)）×100%；成活率=（外植體成活數(shù)/接種數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉竹外植體的啟動(dòng)培養(yǎng)結(jié)果

2.1.1 外植體消毒與滅菌方法的篩選結(jié)果 將清洗過的玉竹外植體按照表1的方法進(jìn)行消毒滅菌，由表3可知，培養(yǎng)30 d后，處理A1、A4、A8全部污染死亡；處理A7的污染率最低，污染數(shù)量最少，成活的外植體數(shù)量最多，效果最好（圖1）。

2.1.2 最適外植體的篩選結(jié)果 將玉竹的外植體（莖段、葉片、根莖）接種在MS培養(yǎng)基中，用表1中處理A7的方法進(jìn)行消毒滅菌。其中莖段切成1 cm左右的小段，并保留腋芽，切除大部分葉片，插入培養(yǎng)基中；葉片切成1 cm2左右的方形，并用刀片將葉片垂直葉脈方向切割，注意不要切斷葉片邊緣，將葉背接觸培養(yǎng)基，平鋪在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；根莖培養(yǎng)時(shí)，用剪刀減去根莖上的須根，切成0.5 cm左右的小段，切面接觸培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。由表4可知，培養(yǎng)30 d后，根莖外植體的成活率較高，達(dá)到了90.0%，并且生長(zhǎng)情況良好（圖2）。而莖段與葉片外植體的成活率較低，分別為43.3%和33.3%，未污染的外植體生長(zhǎng)較慢或不生長(zhǎng)（圖3、圖4）。由此可見，在玉竹的離體初代培養(yǎng)中，莖段是較好的外植體。

2.1.3 低溫處理對(duì)誘導(dǎo)玉竹不定芽的影響 由表5可以看出，玉竹在經(jīng)過4 ℃低溫處理后，其誘導(dǎo)不定芽的分化率有所提高，且幼苗的長(zhǎng)勢(shì)也有所不同。未經(jīng)低溫處理（圖5）的玉竹分化率為70%，在經(jīng)過低溫處理（圖6）后其分化率升高到了94%，高出了24個(gè)百分點(diǎn)。由此可見，低溫處理有利于玉竹不定芽的誘導(dǎo)和分化。

2.2 玉竹不定芽的增殖培養(yǎng)

2.2.1 不同濃度6-BA與NAA配比對(duì)玉竹增殖的影響 將誘導(dǎo)出的健壯無(wú)變異的玉竹不定芽移入到6-BA與NAA不同配比的培養(yǎng)基中，進(jìn)行不定芽的繼代增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)并觀察新增的不定芽。由表6可知，隨著激素濃度配比的不同，其增殖率與增殖系數(shù)也呈現(xiàn)不同的結(jié)果，且其幼苗長(zhǎng)勢(shì)也呈現(xiàn)出了不同的狀態(tài)。

在6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)，隨著NAA濃度的增加，玉竹的增殖率與增殖系數(shù)也逐漸增大，并且幼苗的長(zhǎng)勢(shì)也逐漸好轉(zhuǎn)。當(dāng)6-BA的濃度為0.5 mg/L，NAA濃度為0.8 mg/L時(shí)，玉竹幼苗的長(zhǎng)勢(shì)最好（圖7），并且增殖的幼苗全部為有效苗，植株健壯，葉色翠綠。在6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，隨著NAA濃度的增大，玉竹不定芽的增殖率與增殖系數(shù)也在不斷增大，玉竹幼苗的生長(zhǎng)情況由較差變?yōu)榱己?，其中在NAA濃度為0.4 mg/L時(shí)，生長(zhǎng)狀況較好，但出現(xiàn)了幼苗徒長(zhǎng)，增殖苗的有效率較低，所以，綜合因素考慮，6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L（處理B4）為玉竹增殖最佳的激素組合。

2.2.2 蔗糖濃度對(duì)玉竹增殖的影響 將誘導(dǎo)出的玉竹不定芽接種到不同蔗糖濃度的增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，增殖結(jié)果見表7。從表7可以看出，蔗糖濃度對(duì)玉竹的增殖起著不同的調(diào)節(jié)作用，隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的增加，玉竹的分化數(shù)與分化率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)蔗糖濃度為10 g/L時(shí)，玉竹幼苗不定芽的分化數(shù)較少，且植株生長(zhǎng)不健壯，葉色枯黃（圖8）；當(dāng)蔗糖濃度為20 g/L時(shí)，玉竹幼苗的分化數(shù)與分化率有所增加，但植株生長(zhǎng)情況一般，出現(xiàn)了植株徒長(zhǎng)的現(xiàn)象（圖9）；當(dāng)蔗糖濃度為30 g/L時(shí)，玉竹不定芽產(chǎn)生的數(shù)量最多，其分化數(shù)為26，分化率達(dá)到了86.7%，此時(shí)不定芽的生長(zhǎng)情況最好，植株健壯，葉色翠綠（圖10），且誘導(dǎo)出的不定芽均為有效苗；當(dāng)蔗糖濃度為40 g/L時(shí)，幼苗植株雖然生長(zhǎng)健壯（圖11），但其分化數(shù)與分化率有所下降，且幼苗生長(zhǎng)過快，不利于下一步的培養(yǎng)。由此可得出，蔗糖含量為30 g/L時(shí)更加有利于玉竹的增殖培養(yǎng)。

3 小結(jié)

在組織培養(yǎng)中，植株不同的部位作為外植體可能對(duì)培養(yǎng)效果有著至關(guān)重要的影響。試驗(yàn)取玉竹的根莖、莖段以及葉片作為外植體，在相同培養(yǎng)條件下根莖的成活率最高；在玉竹的初代培養(yǎng)中，根莖是作為其初代培養(yǎng)最適宜的外植體，這與寧慧等[9]的研究結(jié)果一致。

低溫處理對(duì)一些植物的誘導(dǎo)有時(shí)起著促進(jìn)作用，本研究中，將采集處理后的玉竹植株放入4 ℃冰箱中保存7 d，得到經(jīng)過低溫處理的分化率及幼苗的長(zhǎng)勢(shì)要好于未經(jīng)處理的植株。分析其原因可能是低溫時(shí)玉竹外植體提前分化出幼芽，還有可能是經(jīng)過低溫的處理后，玉竹本身攜帶的抑制發(fā)芽的物質(zhì)被打破，從而促進(jìn)了發(fā)芽。

糖是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的碳源，試驗(yàn)通過不同糖濃度的研究發(fā)現(xiàn)其添加的量同樣影響著玉竹的生長(zhǎng)發(fā)育，但研究表明糖濃度必須要維持在一定的范圍內(nèi)，才能起到很好的增殖效果。因此，在玉竹的離體快速繁殖中，為提高繁殖效率，在培養(yǎng)基的成分選擇中，不單單要考慮生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比，還可從蔗糖的使用濃度上著手。

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