豬瘟防控凈化技術(shù)研究

王琴/中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室

豬瘟防控凈化技術(shù)研究

王琴/中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室

一、豬瘟流行病學(xué)研究進(jìn)展

（一）豬瘟在國(guó)際上的流行情況

目前已宣布無豬瘟的有以下國(guó)家和地區(qū)：

澳大利亞 法國(guó) 墨西哥 斯洛伐克奧地利 德國(guó) 新喀里多尼亞 斯洛文尼亞比利時(shí) 新西蘭 西班牙 加拿大愛爾蘭 挪威 瑞典 智利意大利 巴拉圭 瑞士 捷克共和國(guó)日本 波蘭 荷蘭 丹麥列支敦士登 葡萄牙 英國(guó) 芬蘭盧森堡 羅馬尼亞 美國(guó) 巴西部分區(qū)域哥倫比亞部分區(qū)域

（二）我國(guó)政府高度重視豬瘟凈化

根據(jù)《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)則（2012-2020）》和《全國(guó)獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)則》確定的動(dòng)物疫病防治總體目標(biāo)與任務(wù)，豬瘟作為我國(guó)優(yōu)先防治和重點(diǎn)防范的16種動(dòng)物疫病之一，應(yīng)對(duì)我國(guó)豬瘟的凈化和防控提出指導(dǎo)性意見和具體的凈化策略。明確提出了以下兩點(diǎn)：豬瘟在2015年部分區(qū)域達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)，原種豬場(chǎng)達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)；2020年進(jìn)一步擴(kuò)大凈化區(qū)域，全國(guó)所有種豬場(chǎng)達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)。

二、豬瘟分子流行病學(xué)研究進(jìn)展

（一）研究概況

歷時(shí)37年，采集了1979-2016年的豬瘟研究數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)遍布中國(guó)大陸的31個(gè)省自治區(qū)，將近覆蓋了98%的國(guó)土面積，收集到中國(guó)大陸868條數(shù)據(jù)信息（包括中國(guó)臺(tái)灣?。?yōu)化并且標(biāo)準(zhǔn)化歐盟豬瘟病毒E2基因RT-nPCR方法擴(kuò)增豬瘟病毒E2基因主要區(qū)域的271bp的片段（與軍事獸醫(yī)研究所涂長(zhǎng)春教授合作）。

（二）C株疫苗的研究

通過C株疫苗對(duì)我國(guó)豬瘟流行毒株的免疫保護(hù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)來看，我國(guó)豬瘟流行毒株與疫苗株的同源性都在81.7%以上。

采用RID、7500RID、0RID三個(gè)免疫劑量免疫，根據(jù)結(jié)果可以看到疫苗的免疫期能持續(xù)578 d，在375d采用致死劑量的石門攻毒，可以做到完全保護(hù)。

（三）C株疫苗的研究意義

1.對(duì)闡明豬瘟病毒的遺傳變異特征和分布規(guī)律、疫情追溯、揭示病毒的遺傳進(jìn)化背景具有十分重要的科學(xué)意義。

2.結(jié)合動(dòng)物試驗(yàn)監(jiān)測(cè)現(xiàn)行使用疫苗的有效性，提出新的防治策略也具有重要作用。

3.發(fā)現(xiàn)中國(guó)豬瘟病毒流行株基因組穩(wěn)定，并證明現(xiàn)用豬瘟疫苗對(duì)我國(guó)流行毒株能有效保護(hù)，否定了多年認(rèn)為“由野毒株變異引起免疫失敗”的學(xué)術(shù)爭(zhēng)端，一旦監(jiān)測(cè)到野毒株低于77.2%，立即進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4.C株疫苗能抵抗全世界流行的三個(gè)基因型野毒的攻擊。

5.C株疫苗不僅為世界上一些國(guó)家消滅豬瘟作出了貢獻(xiàn)，至今對(duì)我國(guó)豬瘟控制的基本策略也是有效的。

6.對(duì)建立和豐富我國(guó)豬瘟流行病學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)也具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。因此，實(shí)施連續(xù)的不間斷的我國(guó)豬瘟分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)工作是豬瘟控制的重要手段，對(duì)于制定有效防控措施具有重要的指導(dǎo)意義。

（四）中國(guó)豬瘟控制成效

近年來，按照國(guó)家總體部署，堅(jiān)持預(yù)防為主，實(shí)施免疫與撲殺相結(jié)合的綜合防治措施，全國(guó)豬瘟疫情得到有效控制，疫情報(bào)告起數(shù)明顯下降，流行態(tài)勢(shì)日趨平穩(wěn)，感染率較低，防控工作取得顯著成效。

據(jù)監(jiān)測(cè)，2015年全國(guó)豬場(chǎng)個(gè)體感染率0.15%；OIE國(guó)家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室今年對(duì)中國(guó)重點(diǎn)檢測(cè)區(qū)域沒有監(jiān)測(cè)到陽(yáng)性疾病。

（五）中國(guó)豬瘟控制的新目標(biāo)和任務(wù)

2016年7月，農(nóng)業(yè)部財(cái)政部聯(lián)合印發(fā)了《關(guān)于調(diào)整完善動(dòng)物疫病防控支持政策的通知》，自2017年起從中央層面退出對(duì)豬瘟的財(cái)政補(bǔ)助。

2017年3月，農(nóng)業(yè)部印發(fā)《國(guó)家豬瘟防治指導(dǎo)意見（2017-2020年）》，標(biāo)志著正式將豬瘟免疫凈化付諸行動(dòng)，這是我國(guó)豬瘟防控政策歷史性的重大轉(zhuǎn)變。

三、豬瘟診斷技術(shù)研究進(jìn)展

1.豬瘟病原學(xué)診斷方法的原則

（1）診斷方法必須達(dá)到特異、敏感、快速、重復(fù)性好、結(jié)果易判定的標(biāo)準(zhǔn)；（2）早期確診，避免傳播風(fēng)險(xiǎn)；（3）持續(xù)感染呈現(xiàn)的非典型臨床表現(xiàn)和病理變化，需要靈敏的檢測(cè)方法；（4）全面的疫苗防控政策，需要鑒別感染豬與免疫豬；（5）與其他豬病的混合感染，也需要建立鑒別診斷技術(shù)。綜上所述就是必須依照實(shí)驗(yàn)室診斷方法，提升診斷水平。

2.豬瘟病原學(xué)診斷方法

（1）經(jīng)典的豬瘟病原學(xué)診斷方法：動(dòng)物接種試驗(yàn)（很少使用）、病毒分離技術(shù)、熒光抗體檢測(cè)技術(shù)（FAT）/免疫過氧化物酶檢測(cè)技術(shù)（IPT）、抗原捕獲-ELISA；

（2）分子診斷技術(shù)：PT-PCR技術(shù)（診斷和基因分型）、熒光定量RT-PCR技術(shù)（歐盟豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)）、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（NASBA，LAMP）；

（3）病毒中和實(shí)驗(yàn)：體外病毒中和實(shí)驗(yàn)（VNT）、熒光抗體病毒中和實(shí)驗(yàn)（NIF）（國(guó)際貿(mào)易指定試驗(yàn)）、過氧化物酶聯(lián)中和試驗(yàn)（NPLA）（國(guó)際貿(mào)易指定試驗(yàn)）、體內(nèi)病毒中和試驗(yàn)、豬瘟病毒兔體中和試驗(yàn)、豬瘟病毒豬體中和試驗(yàn)；

（4）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：豬瘟病毒簡(jiǎn)介ELISA抗體檢測(cè)方法（國(guó)際貿(mào)易指定試驗(yàn)，是我國(guó)第一個(gè)獲得新獸藥證書的豬瘟病毒ELISA抗體診斷試劑盒）、豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法（國(guó)際貿(mào)易指定試驗(yàn)）、豬瘟病毒化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)技術(shù)（ELISA）；

（5）其他常規(guī)診斷方法：豬瘟間接血凝試驗(yàn)（IHA）、免疫芯片技術(shù)。

3.豬瘟病毒化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)試劑盒

（1）化學(xué)發(fā)光酶免疫分析技術(shù)（CLIA）。CLIA是一種集靈敏的化學(xué)發(fā)光分析和特異的抗原抗體免疫測(cè)定技術(shù)于一體的檢測(cè)技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡(jiǎn)便、快速、安全穩(wěn)定和自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。中國(guó)獸藥監(jiān)察所OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室與萊普生合作，經(jīng)過2年的研究，采用一步競(jìng)爭(zhēng)法建立了豬瘟病毒化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)試劑盒。以真核表達(dá)的E2蛋白作為包被物包被聚苯乙烯發(fā)光板（抗原包被板），加待檢血清和E2蛋白單克隆抗體酶結(jié)合物后反應(yīng)30min，經(jīng)洗滌后加入發(fā)光底物，讀取發(fā)光值，回算出豬瘟抗體計(jì)量值，從而反應(yīng)出豬血清中豬瘟抗體含量，判斷陰陽(yáng)性結(jié)果。因此，待檢血清中豬瘟抗體的濃度與發(fā)光值成反比。

（2）靈敏性實(shí)驗(yàn)。豬瘟病毒化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)200份豬瘟抗體陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用I-ELISA和B-ELISA試劑盒進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)試劑盒的敏感性平均為95.8%，比I-ELISA和B-ELISA高出3～5個(gè)百分點(diǎn)。

（3）優(yōu)勢(shì)。豬瘟病毒化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)試劑盒是繼傳統(tǒng)ELISA技術(shù)之后發(fā)展起來的一項(xiàng)最新免疫測(cè)定技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)為進(jìn)一步優(yōu)化了顯色系統(tǒng)，用發(fā)光底物代替了傳統(tǒng)的TMB底物，提高了檢測(cè)的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，預(yù)測(cè)會(huì)取代傳統(tǒng)ELISA。該試劑盒的優(yōu)勢(shì)有：①標(biāo)記分子小，標(biāo)記物非常穩(wěn)定；②發(fā)光時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度高；③光信號(hào)線良好，動(dòng)力學(xué)范圍寬，超過6個(gè)數(shù)量級(jí)；④重現(xiàn)性好；⑤通過校準(zhǔn)設(shè)置，使試劑盒的檢測(cè)結(jié)果實(shí)現(xiàn)了相對(duì)定量；⑥實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)化；⑦方便快速。由于本試劑盒采用一步競(jìng)爭(zhēng)法，血清無需稀釋，使工作更加簡(jiǎn)便快速，檢測(cè)時(shí)間大大縮短。

4.豬瘟免疫失敗原因分析

豬瘟依然在我國(guó)散發(fā)存在，造成免疫失敗的原因主要有以下幾方面。

（1）豬瘟持續(xù)感染帶毒豬。

（2）個(gè)別豬體免疫功能異常。

（3）母源抗體對(duì)疫苗免疫的影響。

（4）免疫程序不科學(xué)。

（5）部分廠家豬瘟疫苗質(zhì)量。

（6）疫苗運(yùn)輸?shù)睦滏溝到y(tǒng)不完善。

（7）多種病混合存在。

（8）診斷方法不特異。

四、我國(guó)豬瘟凈化存在的挑戰(zhàn)

（一）豬瘟防治思路

1.以預(yù)防為主的防控方針。

2.以源頭控制、分類指導(dǎo)、梯度推進(jìn)為防治原則—種群凈化。

3.以養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）為防治主體。

4.以疫病凈化為防治重點(diǎn)，不斷完善養(yǎng)殖場(chǎng)生物安全體系。

5.嚴(yán)格落實(shí)免疫預(yù)防、監(jiān)測(cè)凈化、檢疫監(jiān)管、應(yīng)急處理、無害化處理等綜合防控措施。

6.積極開展場(chǎng)群或區(qū)域凈化工作，降低發(fā)病率，壓縮流行范圍，有效清除病原，逐步實(shí)現(xiàn)凈化。

7.加強(qiáng)區(qū)域管理，建設(shè)無豬瘟區(qū)和無豬瘟生物安全隔離區(qū)（無豬瘟企業(yè)）。

8.評(píng)估驗(yàn)收流程：示范場(chǎng)—縣級(jí)主管部門—地級(jí)主管部門—省級(jí)主管部門—國(guó)家疫控中心。

（二）我國(guó)豬瘟保障措施

1.加強(qiáng)組織領(lǐng)導(dǎo)，地方各級(jí)人民政府對(duì)轄區(qū)內(nèi)豬瘟防治工作負(fù)總責(zé)。

2.強(qiáng)化技術(shù)支撐，要依靠地方各級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，豬瘟實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)力量，發(fā)揮專家委員會(huì)作用，分析流行動(dòng)態(tài)，加強(qiáng)技術(shù)指導(dǎo)，提出政策措施建議，為防治工作提供技術(shù)支撐。

3.各級(jí)畜牧獸醫(yī)部門要與豬瘟實(shí)驗(yàn)室密切配合，積極開展監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查工作，發(fā)展病原學(xué)陽(yáng)性樣品應(yīng)及時(shí)送豬瘟實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析鑒定，及時(shí)掌握病原變異情況。

4.中國(guó)獸藥監(jiān)察所要加強(qiáng)豬瘟疫苗和診斷制品質(zhì)量監(jiān)管以及疫苗免疫效果評(píng)估。豬瘟實(shí)驗(yàn)室要及時(shí)借鑒國(guó)際疫情監(jiān)測(cè)及預(yù)警先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)，建立完善豬瘟疫情監(jiān)測(cè)預(yù)警模型和數(shù)據(jù)庫(kù)，持續(xù)跟蹤病原遺傳演化規(guī)律、病原分布、疫情動(dòng)態(tài)，分析疫苗毒株與流行毒株的匹配性，監(jiān)測(cè)疫苗的臨床免疫效果，加強(qiáng)新型疫苗和診斷試劑等技術(shù)研究，提出防控對(duì)策建議。

5.強(qiáng)化政策保障。

6.落實(shí)經(jīng)費(fèi)保障。

7.加強(qiáng)宣傳和國(guó)際合作。

（三）我國(guó)豬瘟凈化技術(shù)支撐

1.技術(shù)支撐。快速敏感的診斷技術(shù)已經(jīng)達(dá)到國(guó)際技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，并被國(guó)際上認(rèn)可，為凈化提供了技術(shù)支持。

2.理論基礎(chǔ)。通過對(duì)豬瘟分子流行病學(xué)的研究，病毒基因組穩(wěn)定，變異頻率低，只有一個(gè)血清型，對(duì)該病毒的清除是一個(gè)有利的條件。

3.疫情預(yù)警。建立完善豬瘟疫情監(jiān)測(cè)預(yù)警模型和數(shù)據(jù)庫(kù)，持續(xù)跟蹤病原遺傳演化規(guī)律、病原分布，疫情動(dòng)態(tài)，分析疫苗毒株與流行毒株的匹配性，監(jiān)測(cè)疫苗的臨床免疫效果。

4.技術(shù)保障。豬瘟疫苗依然是最優(yōu)秀的疫苗，為豬瘟的控制提供了技術(shù)保障。

5.標(biāo)記疫苗。是我國(guó)豬瘟疫苗的急需產(chǎn)品。

根據(jù)以上技術(shù)支持，建立了豬瘟綜合防控凈化模式，中國(guó)豬瘟凈化，將不再只是一句空談，是切實(shí)可以實(shí)現(xiàn)的。