非干擾條件下圈養(yǎng)大熊貓正常生理生化指標(biāo)的測(cè)定

羅 娌 蘭景超 劉 禮 黃文俊 廖禮慧 陳 欣 楊 智 王成東

(成都大熊貓繁育研究基地，成都，610081)稿件運(yùn)行過(guò)程

非干擾條件下圈養(yǎng)大熊貓正常生理生化指標(biāo)的測(cè)定

羅 娌 蘭景超 劉 禮 黃文俊 廖禮慧 陳 欣 楊 智 王成東*

(成都大熊貓繁育研究基地，成都，610081)稿件運(yùn)行過(guò)程

大熊貓；非干擾條件采血；生理生化指標(biāo)參考范圍；年齡組；性別

2006～2015年間，通過(guò)馴化，在非麻醉狀況下成功采集了114只大熊貓(♀58只，♂56只)2 399份血樣進(jìn)行了50項(xiàng)生理生化指標(biāo)檢測(cè)，建立非干擾條件下大熊貓正常生理生化指標(biāo)參考范圍。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)某些生理生化指標(biāo)隨著年齡的增長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著性差異；酶類指標(biāo)波動(dòng)范圍較大，個(gè)別指標(biāo)表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的變化趨勢(shì)；成年組雌性和雄性大熊貓生理生化指標(biāo)較幼年組、亞成年組和老年組表現(xiàn)出更多性別相關(guān)的差異，臨床上需按性別區(qū)別對(duì)待。受種群健康狀況改善、樣本數(shù)量和采樣方式改變的影響，現(xiàn)有的非干擾狀態(tài)下血液生理生化指標(biāo)更適用于成都圈養(yǎng)大熊貓種群健康水平的評(píng)估，有助于科研工作者保護(hù)這一特殊物種。

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)圈養(yǎng)的歷史可追溯到上世紀(jì)三十年代，在過(guò)去的八十余年間，大熊貓人工圈養(yǎng)種群從八十年代末的118只發(fā)展到現(xiàn)在的425只，大熊貓的健康關(guān)系到整個(gè)大熊貓種群的發(fā)展。近年來(lái)，在大熊貓行為學(xué)、繁殖學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等方面的研究均取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，大熊貓血液學(xué)水平成為臨床獸醫(yī)和動(dòng)物管理者評(píng)判大熊貓健康與否最基礎(chǔ)的指標(biāo)。由于受到種群數(shù)量和樣品收集方式的限制，系統(tǒng)報(bào)導(dǎo)大熊貓血液學(xué)研究結(jié)果的文獻(xiàn)非常有限。董全[1]、Mainks[2]、王強(qiáng)[3]、李光漢[4]等分別報(bào)導(dǎo)了不同機(jī)構(gòu)大熊貓的血液生理生化參數(shù)，由于受試大熊貓數(shù)量從3只到28只不等，個(gè)別受試動(dòng)物來(lái)自野外搶救屬于非健康狀態(tài)，所得到的生理生化指標(biāo)不能代表健康大熊貓種群的正常水平。李才武等[5]發(fā)表了120只圈養(yǎng)大熊貓血液生理指標(biāo)，由于其樣本的采集既包括麻醉狀態(tài)也包括非麻醉狀態(tài)，我們無(wú)法排除麻醉這一應(yīng)激對(duì)正常血液指標(biāo)產(chǎn)生的影響，同時(shí)該文章僅報(bào)導(dǎo)了生理指標(biāo)參考范圍，無(wú)血液生化指標(biāo)的結(jié)果。從現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)來(lái)看，未指出受試動(dòng)物是否在同一年齡段進(jìn)行多次采樣，如果重復(fù)使用一個(gè)或部分個(gè)體的多個(gè)血樣，最終得到的變化范圍將無(wú)法代表整個(gè)受試對(duì)象的真實(shí)水平。

為了建立非干擾狀態(tài)下大熊貓正常生理生化指標(biāo)參考范圍，成都大熊貓繁育研究基地自2006年開(kāi)始對(duì)圈養(yǎng)大熊貓進(jìn)行馴化，大熊貓自愿接受血液采集，排除應(yīng)激對(duì)血液學(xué)指標(biāo)的干擾。經(jīng)過(guò)9年的樣本收集，共采到114個(gè)健康個(gè)體2 399份血樣，對(duì)50個(gè)常用血液學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，建立了成都大熊貓繁育研究基地各年齡段大熊貓血液生理生化指標(biāo)正常參考范圍。通過(guò)對(duì)血液檢測(cè)指標(biāo)的分析發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)或性別的不同，某些指標(biāo)表現(xiàn)出顯著性差異，具有一定的生理意義。該研究結(jié)果有助于獸醫(yī)對(duì)大熊貓的健康狀態(tài)進(jìn)行有效評(píng)估，及早發(fā)現(xiàn)患病動(dòng)物，也為動(dòng)物管理者的日常飼養(yǎng)管理提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，同時(shí)可為其他大熊貓飼養(yǎng)研究機(jī)構(gòu)提供理論參考。

1 研究方法

1.1 受試動(dòng)物

114只受試動(dòng)物均飼養(yǎng)于成都大熊貓繁育研究基地，年齡從5月齡到32歲，具體性別、年齡分組見(jiàn)表1。所有動(dòng)物受試期間精神、食欲、大小便正常，視為健康個(gè)體。投喂的食物由竹子、竹筍、精料和蘋果構(gòu)成，其中竹子或竹筍投喂量超過(guò)每日投喂總量的90%。定期投喂驅(qū)蟲藥(害獲滅，0.2 mg/kg，1%伊維菌素?zé)o菌注射液，梅里亞國(guó)際貿(mào)易上海有限公司，噻吩嘧啶，6 mg/kg，Pfizer公司生產(chǎn))。每年注射犬瘟熱疫苗(Purevax?，梅里亞公司生產(chǎn))和狂犬疫苗(Nobivac?，英特威公司生產(chǎn))。大熊貓分組根據(jù)張志和等提出的0～18月齡為幼年大熊貓，1.5～5歲為亞成年大熊貓，5～20歲為成年大熊貓，20歲以上為老年大熊貓[6]。

表1 受試大熊貓年齡與性別分組

Tab.1 Age and sex groups of giant pandas

1.2 采樣方式

在馴化狀態(tài)下，從大熊貓右上肢或左上肢靜脈，用22號(hào)針頭和真空采血管進(jìn)行血液采集。血液分成2份，一份為EDTA抗凝，另一份無(wú)抗凝劑離心分離血清(1 500 rpm，15 min)。所有樣品送至成都市四一六醫(yī)院進(jìn)行生理、生化檢測(cè)。用于檢測(cè)血常規(guī)的機(jī)器為BC-5800 (邁瑞科技有限公司，中國(guó))。血生化檢測(cè)儀器為AU2700 (奧林巴斯，日本)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有測(cè)試數(shù)據(jù)使用SPSS 23(SPSS Inc.，芝加哥，美國(guó))和R 2.15.0 (R Core Development Team，2012)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2 399份血樣來(lái)自114個(gè)個(gè)體，每個(gè)個(gè)體在不同年齡段皆多次采樣。將同一個(gè)體在同一年齡段的所有血液檢測(cè)結(jié)果平均后得到的平均值作為該個(gè)體該年齡段的最終檢測(cè)結(jié)果。血液生理生化正常范圍通過(guò)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和個(gè)案數(shù)體現(xiàn)[7]。每個(gè)年齡組先計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，任何超過(guò)平均值±3X標(biāo)準(zhǔn)差的結(jié)果將作為極值不再納入之后的計(jì)算和檢驗(yàn)。對(duì)于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，而不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)將通過(guò)R進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)[8]。不同年齡段的兩兩比較通過(guò)LSD或者kruskalmc進(jìn)行分析。老年組參與血樣采集的雄性大熊貓個(gè)體數(shù)僅有2個(gè)，故不進(jìn)行同年齡組性別間差異性比較。

2 結(jié)果

本研究共檢測(cè)生理、生化指標(biāo)50項(xiàng)(表2)，部分生理生化指標(biāo)隨年齡增長(zhǎng)而表現(xiàn)出顯著性差異。由于成年大熊貓生理、生化指標(biāo)性別差異顯著，其結(jié)果單獨(dú)由表3例出。

成都大熊貓繁育研究基地大熊貓正常生理生化指標(biāo)變化范圍(表2)。

表2 幼年、亞成年、成年和老年組大熊貓生理生化指標(biāo)

Tab.2 Hematologic and biochemical reference of infant，subadult，adult and aged giant pandas

續(xù)表2

注：針對(duì)常用生理生化指標(biāo)進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，標(biāo)相同字母為差異不顯著，標(biāo)不相同字母為差異顯著(P<0.05)，未標(biāo)字母指標(biāo)未進(jìn)行差異性檢測(cè)

Note：Most common used hematologic and biochemical parameters were tested.No significantly difference was showed by same alphabet and significantly difference was showed by different alphabet.Unlabled hematologic and biochemical parameters didn’t tested

表3 雌性、雄性成年大熊貓生理生化指標(biāo)

Tab.3 Hematologic and biochemical reference of male and female adult giant pandas

續(xù)表3

續(xù)表3

注：*表示差異顯著P<0.05，**表示差異極顯著P<0.01

Note：*Showed signifcantly difference，P<0.05，**showed extremely signifcantly difference，P<0.01

3 討論

3.1 本文第一次詳細(xì)報(bào)導(dǎo)了非干擾情況下不同年齡段和不同性別圈養(yǎng)大熊貓的生理和生化指標(biāo)參考范圍。已有多篇報(bào)導(dǎo)指出應(yīng)激對(duì)血液生理生化指標(biāo)的影響[6，9-10]。通過(guò)比較麻醉與非麻醉大熊貓血液生理指標(biāo)后發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、平均血紅蛋白濃度和血小板壓積等指標(biāo)差異極顯著。所以在完全排除麻醉這一應(yīng)激原后，得到的數(shù)據(jù)更能真實(shí)地反映大熊貓血液學(xué)指標(biāo)的實(shí)際結(jié)果，為臨床獸醫(yī)評(píng)估動(dòng)物健康狀況提供了更加可靠的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 王強(qiáng)[3]、李光漢[4]和張志和[6]等曾報(bào)導(dǎo)過(guò)成都大熊貓種群血液正常生理生化指標(biāo)的參考范圍。本研究發(fā)現(xiàn)2006年后的生理生化指標(biāo)與2006年以前的數(shù)據(jù)相比，部分指標(biāo)表現(xiàn)出較大差異，主要表現(xiàn)在：(1)2006年以后各年齡組反映動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)水平的指標(biāo)如總蛋白、血清白蛋白、白蛋白/球蛋白、血紅蛋白等普遍高于之前的報(bào)導(dǎo)；(2)2006年以后反映的肝功指標(biāo)如總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素水平等顯著低于張志和等[6]所報(bào)道水平。各項(xiàng)血液生理生化指標(biāo)的改善與成都大熊貓基地自2006年以來(lái)所采取的一系列大熊貓健康管理措施密切相關(guān)。臨床上，整個(gè)圈養(yǎng)大熊貓種群發(fā)病率下降，新生幼仔存活率提高并能平穩(wěn)渡過(guò)發(fā)病率較高的亞成年期。2006年以后成都大熊貓繁育研究基地再無(wú)生長(zhǎng)發(fā)育不良的“僵貓”出現(xiàn)，整個(gè)種群健康水平明顯改善。

3.3 不同年齡組血液生理生化指標(biāo)比較

隨著年齡的增長(zhǎng)，反映其營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、肝功、腎功的幾個(gè)指標(biāo)總體變化規(guī)律為幼年最低，成年后則達(dá)到最高水平，老年后維持或略有下降。與熊科(Ursidae)其他熊類相比，大熊貓葡萄糖水平接近眼鏡熊 (Tremarctosornatus)水平[10]低于棕熊(Ursusarctos)[11]；總甘油三脂水平較黑熊(Ursusthibetanus)[12-13]和眼鏡熊[10]水平低；各種血清酶類的變化范圍都比較大，這是因?yàn)槊负苋菀妆桓蓴_，如應(yīng)激、劇烈運(yùn)動(dòng)、飲食、器質(zhì)性病變等。受試大熊貓的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平較其他大熊貓文獻(xiàn)所報(bào)道的水平都高，而與熊類相比，則高于眼鏡熊[10]和黑熊[12-13]，但低于棕熊[11]。導(dǎo)致成年大熊貓丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平升高的原因是否與成年大熊貓?zhí)幱诎l(fā)情期或妊娠期、育幼期相關(guān)，值得進(jìn)一步的研究。堿性磷酸酶能夠反映骨形成和成骨細(xì)胞代謝的活性。幼年動(dòng)物往往因?yàn)樘幱谏L(zhǎng)期而有較高的堿性磷酸酶、鈣和磷水平，隨著年齡的增長(zhǎng)，各項(xiàng)指標(biāo)水平則逐步下降，如黑熊[12-13]、棕熊[11]和北極熊(Ursusmaritimus)[14]等，大熊貓也有類似的變化趨式。受試大熊貓的血淀粉酶水平較張志和等[6]和王強(qiáng)等[3]報(bào)道的水平都高，但大熊貓并未表現(xiàn)出任何相關(guān)臨床癥狀。

隨著年齡的增長(zhǎng)，白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞所占比例逐漸下降，中性粒細(xì)胞比例不斷上升，成年后逐漸穩(wěn)定，與李才武等[9]所報(bào)道的結(jié)果并不一致。與此同時(shí)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血細(xì)胞壓積和平均紅細(xì)胞體積從幼年時(shí)期的最低水平逐步上升，成年后穩(wěn)定在一定水平，到老年后開(kāi)始下降。血小板水平與李才武等[5]和張志和等[6]報(bào)道的水平都更高。所有受試大熊貓均未表現(xiàn)出任何與血小板增多癥相關(guān)的臨床癥狀。造成這種差異的原因還需進(jìn)一步研究。

3.4 不同性別血液生理、生化指標(biāo)比較

在已經(jīng)進(jìn)行分組比較的生理、生化指標(biāo)中，我們發(fā)現(xiàn)大部分指標(biāo)在幼年和亞成年是沒(méi)有顯著的性別差異，而是到了成年期才表現(xiàn)出來(lái)。這提示我們性成熟對(duì)大熊貓的生理、生化指標(biāo)是有影響的。王強(qiáng)等[3]指出雌、雄性大熊貓生理生化指標(biāo)差異不顯著，這可能與受試動(dòng)物中只有15個(gè)個(gè)體有關(guān)。Mainks等[2]也指出成年雌性和雄性大熊貓?jiān)诩t細(xì)胞總數(shù)、血甘油三脂存在性別差異。劉太秀等[15]通過(guò)對(duì)育成黑熊的血液生理生化指標(biāo)的測(cè)定，也發(fā)現(xiàn)雌性和雄性黑熊部分生理生化指標(biāo)存在極顯著差異。在臨床上不同性別的成年大熊貓的正常生理、生化指標(biāo)需區(qū)別對(duì)待。

綜上所述，隨著大熊貓圈養(yǎng)種群的擴(kuò)大，其正常生理、生化指標(biāo)需要更新，通過(guò)非干擾條件下得到的數(shù)據(jù)更能反映大熊貓真實(shí)健康狀況，幫助動(dòng)物管理者對(duì)大熊貓的體況進(jìn)行正確評(píng)估，最終維持一個(gè)健康可持續(xù)發(fā)展的種群。

致謝：感謝成都大熊貓基金會(huì)對(duì)本研究的經(jīng)費(fèi)支持(項(xiàng)目編號(hào)：CPF08011)。感謝成都大熊貓繁育研究基地飼養(yǎng)員的辛勤工作，完成了每一只受試大熊貓的馴化，本研究才得已順利進(jìn)行；感謝James E Ayala 在馴化采血方面的大力支持；感謝劉頌蕊對(duì)本研究提供的寶貴建議；感謝Jacob Robert Owens對(duì)本研究中數(shù)據(jù)分析提供的無(wú)私幫助。感謝燕霞、陳杰對(duì)原始數(shù)據(jù)錄入的大力幫助。

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Giant panda；Non-stress sampling methods；Hematologic and biochemical reference；Age groups；Sex groups

Hematologic and Biochemical Reference of Captive Giant Pandas Based on Non-stress Sampling Methods

Luo Li Lan Jingchao Liu Li Huang Wenjun Liao Lihui Chen Xin Yang Zhi Wang Chengdong*

(Chengdu Research Base of Giant Panda Breeding，Chengdu，610081，China)

From 2006 to 2015，we collected 2 399 blood samples from 114 giant pandas (58 females and 56 males)，which were well trained and cooperative to blood sampling without anesthesia.We tested 50 physiological and biochemical criteria of these blood samples to set up the range of normal physiological and biochemical criteria of pandas under no stress.We documented significant differences in some hematologic and biochemical parameters by age group.Although enzyme values varied widely，some varied by age.Hematology and serum chemistry values for adult pandas showed more significant difference by sex compared with juvenile，subadult and old groups，so the clinical diagnosis of adult panda should consider the gender difference.We developed new references for hematology and serum chemistry values based on the improvement of giant panda groupings，larger samples and new sample collection methods.The data recorded using the new methods were more useful for evaluation of the health status of captive giant pandas at Chengdu and for improving the conservation of this iconic species.

2016-10-11

修回日期：2017-07-05

發(fā)表日期：2017-11-10

Q592.1

A

2310-1490(2017)04-580-07

提高圈養(yǎng)大熊貓種群健康和繁殖能力的技術(shù)研究(批文號(hào)：CPF08011)

羅娌，女，36歲，碩士研究生，副研究員；主要從事野生動(dòng)物保護(hù)與疾病研究。E-mail：luoli2002@163.com

*通訊作者：王成東，E-mail：wcdsyy@sina.com