干擾3T3-L1脂肪細(xì)胞生長激素受體對生長激素誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和分泌的影響*

錢慧琳， 黃 靚， 巢 汝， 周 凡， 屈順林， 張 弛

(南華大學(xué)心血管病研究所， 動脈硬化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 衡陽 421001)

干擾3T3-L1脂肪細(xì)胞生長激素受體對生長激素誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和分泌的影響*

錢慧琳， 黃 靚， 巢 汝， 周 凡， 屈順林， 張 弛△

(南華大學(xué)心血管病研究所， 動脈硬化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 衡陽 421001)

目的探討干擾3T3-L1脂肪細(xì)胞生長激素受體(GHR)對生長激素(GH)誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞核因子κB(NF-κB)激活及炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)和分泌的影響。方法采用RNA干擾技術(shù)抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞中GHR的表達(dá)；Western blot檢測GHR的蛋白表達(dá)；雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析GHR對GH激活的3T3-L1脂肪細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響；real-time RT-PCR和ELISA技術(shù)檢測GHR對GH誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)和分泌的影響。結(jié)果干擾3T3-L1脂肪細(xì)胞GHR的表達(dá)能夠顯著抑制生長激素誘導(dǎo)的細(xì)胞NF-κB的激活，并減少TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)和分泌。結(jié)論干擾3T3-L1脂肪細(xì)胞GHR可抑制GH誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子表達(dá)和分泌。

慢性低度炎癥； 脂肪細(xì)胞； 生長激素； 生長激素受體； 炎癥細(xì)胞因子

生長激素(growth hormone，GH)是體內(nèi)調(diào)節(jié)生長發(fā)育和糖脂代謝的重要激素。GH通過與細(xì)胞膜上的生長激素受體(growth hormone receptor，GHR)結(jié)合，激活胞質(zhì)內(nèi)的Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)，繼而活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子5(signal transducer and activator of transcription 5，STAT5)。STAT5發(fā)生細(xì)胞核移位，并與靶基因啟動子的特殊序列結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及免疫等多種生理功能[1]。研究發(fā)現(xiàn)，GH能夠拮抗胰島素的作用[2]。GH分泌異常還與肥胖、高胰島素血癥和胰島素抵抗等代謝功能紊亂密切相關(guān)[3]。另外，1型糖尿病患者血漿GH水平顯著高于正常人[4-5]。這些結(jié)果說明GH及其信號通路障礙可能是胰島素抵抗及糖尿病發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。

脂肪組織是人體必需的組成部分，它不僅參與能量代謝，而且還能夠分泌多種脂肪細(xì)胞因子、炎癥細(xì)胞因子及生長因子[6]。研究發(fā)現(xiàn)，GH可誘導(dǎo)3T3-F442A前脂肪細(xì)胞核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)激活，使NF-κB/p65亞單位磷酸化水平增加，并促進(jìn)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-4、IL-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、單核細(xì)胞趨化蛋白1 (monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)及巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)的表達(dá)[7]。脂肪細(xì)胞的這些變化可誘發(fā)脂肪組織慢性低度炎癥，促進(jìn)胰島素抵抗的形成。在此基礎(chǔ)上本研究進(jìn)一步探討了抑制GHR表達(dá)對GH誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄激活和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)及分泌的影響。

材 料 和 方 法

1材料

小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)提供；青霉素、鏈霉素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松、胰島素和重組人生長激素(hGH)購自Sigma-Aldrich；新生牛血清和高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自Gibco；si-RNA-GHR和siRNA-duplex購自O(shè)rigene；siLentFect脂質(zhì)試劑和iScriptTMReverse Transcription Supermix購自Bio-Rad；抗鼠GHR抗體購自Santa Cruz；抗鼠GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology；pNF-κB-Luciferase質(zhì)粒和pRL-TK 質(zhì)粒購自Clontech；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自Promega；Trizol購自Invitrogen；Power SYBR? Green PCR Master Mix購自Applied Biosystems；抗小鼠IL-6、TNF-α和IL-1β雙抗體夾心酶聯(lián)免疫試劑盒購自BioLegend。

2方法

2.13T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 采用本研究所已經(jīng)建立的方法[8]，用含10%新生牛血清、1×105U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)液，在 37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至80%～90%融合時(shí)，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1 μmol/L 地塞米松、1.67 μmol/L胰島素和10%新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液)培養(yǎng)48 h。然后更換細(xì)胞分化培養(yǎng)液(含1 mg/L胰島素和10%新生牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液)培養(yǎng) 5～7 d，每2 d更換分化培養(yǎng)液1次。3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟后90 %呈脂肪細(xì)胞表型，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2GHR基因沉默 參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[9]，通過siRNA沉默脂肪細(xì)胞GHR的表達(dá)。轉(zhuǎn)染采用siLentFect脂質(zhì)試劑，以siRNA-duplex作為對照。操作步驟按照試劑說明書進(jìn)行。細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后計(jì)數(shù)，然后按每孔1×105的密度接種至細(xì)胞24孔板中培養(yǎng)。將20 nmol/L siRNA-duplex與siLentFect脂質(zhì)試劑按體積比1∶1混合后加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，使siRNA-duplex終濃度為1 nmol/L。24 h后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后采用Western blot檢測siRNA-GHR對GHR的沉默效果，以GAPDH的表達(dá)量作為內(nèi)參照。

2.3NF-κB雙螢光素酶報(bào)告基因活性測定 分別將pNF-κB-Luciferase質(zhì)粒(50 ng)和內(nèi)參照pRL-TK 質(zhì)粒(10 ng)與siRNA-GHR(或siRNA-control)共轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞，48 h后采用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2h，將重組人生長激素加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，并使之達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞處理濃度，24 h后收獲細(xì)胞，按雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒技術(shù)手冊操作，記錄螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶激發(fā)值，以兩者的比值評價(jià)NF-κB報(bào)告基因的激活程度。

2.4Real-time RT-PCR分析炎癥細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平 Trizol法提取細(xì)胞總 RNA，并使用NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量。DNase I 消化 RNA 中可能污染的DNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用iScriptTMReverse Transcription Supermix，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。Real-time RT-PCR采用Power SYBR? Green PCR Master Mix，反應(yīng)在ABI 7500 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行。以GAPDH作為內(nèi)參照，反應(yīng)結(jié)束后通過分析 Ct 值，計(jì)算定量結(jié)果。所需的引物序列如表1所示。

表1 引物設(shè)計(jì)

2.5ELISA檢測細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平 細(xì)胞處理完畢后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)3 000g離心20 min，棄去沉淀后，取上清備用。采用ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 IL-6、TNF-α和IL-1β的水平。檢測步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1分析siRNA-GHR對3T3-L1脂肪細(xì)胞GHR的沉默效率

為確定siRNA-GHR對3T3-L1脂肪細(xì)胞GHR的沉默效率，將siRNA-GHR或siRNA-control轉(zhuǎn)染3T3-L1脂肪細(xì)胞24 h后，換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用Western blot檢測GHR的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與siRNA-control組比較，siRNA-GHR組GHR的表達(dá)水平下降了85.1%(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The protein expression of GHR was diminished after transfection with siRNA-GHR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssiRNA-control group.

圖1siRNA-GHR可顯著抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞GHR的表達(dá)

2抑制GHR表達(dá)對hGH激活的3T3-L1脂肪細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響

為觀察抑制GHR表達(dá)對hGH誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響，將siRNA-GHR或siRNA-control分別與質(zhì)粒pNF-κB-Luciferase和內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染3T3-Ll脂肪細(xì)胞，并將共轉(zhuǎn)染siRNA-control、pNF-κB-Luciferase、pRL-TK且未經(jīng)hGH處理的細(xì)胞組螢火蟲螢光素酶激發(fā)熒光值與海腎螢光素酶激發(fā)熒光值的比值設(shè)定為1，其它各組細(xì)胞的絕對比值與之相比較, 計(jì)算相對比值，結(jié)果顯示，隨著hGH處理濃度的增加，細(xì)胞NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性逐漸增強(qiáng)(即圖中siRNA-control組)；而抑制GHR的表達(dá)能夠顯著降低150 μg/L hGH及500 μg/L hGH對細(xì)胞NF-κ-B的轉(zhuǎn)錄激活作用(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. Dual-luciferase reporter system analysis revealed thatGHRknockdown resulted in attenuation of GH-stimulated NF-κB activation in 3T3-L1 adipocytes.Mean±SD.n=3.*P<0.05vssiRNA-control group.

圖2抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞GHR表達(dá)可降低hGH對NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活作用

3抑制GHR表達(dá)對hGH誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

將siRNA-GHR或siRNA-control轉(zhuǎn)染3T3-L1脂肪細(xì)胞24 h后，換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，接著用150 μg/L hGH處理細(xì)胞24 h后用real-time RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和MIP-1α等炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的變化，結(jié)果顯示，經(jīng)150 μg/L hGH處理24 h后，TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和MIP-1α mRNA的表達(dá)水平均較對照組顯著升高(P<0.05)；而抑制脂肪細(xì)胞GHR的表達(dá)后，再用hGH誘導(dǎo)的細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和MIP-1α mRNA表達(dá)水平均較siRNA-control+GH組顯著降低(P<0.05)，見圖3。

4抑制GHR表達(dá)對hGH誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子分泌的影響

我們進(jìn)一步用ELISA檢測了抑制GHR表達(dá)后hGH誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6 等炎癥細(xì)胞因子分泌的情況，結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)150 μg/L hGH處理24 h后，上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平較對照組分別上升了50.1%(P<0.05)、87.6%(P<0.05)和167.2%(P<0.05)；而抑制脂肪細(xì)胞GHR的表達(dá)后，再用hGH誘導(dǎo)的細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平較si-control+GH組分別下降了21.3%(P<0.05)、36.2%(P<0.05)和43.6%(P<0.05)，見圖4。

Figure 3. Knockdown ofGHRexpression attenuated mRNA expression of inflammatory cytokines induced by GH in 3T3-L1 adipocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-control+GH group.

圖3抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞的GHR表達(dá)可降低hGH誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

Figure 4. Knockdown ofGHRexpression attenuated the secretion of inflammatory cytokines induced by GH in 3T3-L1 adipocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-control+GH group.

圖4抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞GHR表達(dá)可降低hGH誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子的分泌

討 論

慢性低度炎癥與代謝綜合征、肥胖、動脈粥樣硬化和糖尿病等慢性病密切相關(guān)，而胰島素抵抗又是這些慢性疾病共同的病理生理基礎(chǔ)。胰島素抵抗與慢性輕度炎癥相互聯(lián)系、相互促進(jìn)，加速了疾病的發(fā)生和發(fā)展。慢性低度炎癥的產(chǎn)生涉及多種組織、器官和系統(tǒng)，發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織不僅是貯存能量的器官，還是人體最大的內(nèi)分泌器官，具有活躍的內(nèi)分泌功能。脂肪組織可通過生理性肥大將超出機(jī)體代謝所需的能源物質(zhì)以甘油三酯的形式儲存在細(xì)胞內(nèi)。然而，當(dāng)多余的能源物質(zhì)超過脂肪細(xì)胞的儲脂能力時(shí)，脂肪組織則會發(fā)生病理性肥大，表現(xiàn)為組織新生血管不足、供氧減少及內(nèi)分泌功能異?；罨?，導(dǎo)致大量脂肪細(xì)胞因子(瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素和網(wǎng)膜素等)、炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6等)的分泌，這些細(xì)胞因子反過來又作用于脂肪細(xì)胞，進(jìn)一步加重脂肪組織的功能障礙，形成脂肪組織慢性低度炎癥狀態(tài)[10]。也有研究表明脂肪組織既是胰島素作用的重要靶器官，又通過分泌多種脂肪細(xì)胞因子和細(xì)胞炎癥因子等調(diào)節(jié)胰島素的敏感性，降低炎癥水平[11]，而具體機(jī)制尚未明確。但是Kumar等[7]發(fā)現(xiàn)，GH可誘導(dǎo)3T3-F442A前脂肪細(xì)胞NF-κB的激活，并促進(jìn)多種細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)。本研究也發(fā)現(xiàn)3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)150 μg/L hGH處理24 h后，TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和MIP-1α mRNA的表達(dá)水平均較對照組顯著升高，這與Kumar等報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究通過RNA干擾技術(shù)，觀察了基因沉默GHR后，GH誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞炎癥因子分泌的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制GHR表達(dá)能夠顯著降低hGH誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和分泌。這說明GH促脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)是通過與細(xì)胞膜上的GHR結(jié)合，進(jìn)而激活胞內(nèi)NF-κB信號通路而實(shí)現(xiàn)的。

GH是體內(nèi)促進(jìn)生長發(fā)育和代謝的重要激素。生長激素通過與細(xì)胞膜上的GHR結(jié)合，激活胞質(zhì)內(nèi)的JAK2。JAK2使GHR發(fā)生磷酸化，并在JAK2和GHR共同作用下，活化STAT5。隨后STAT5發(fā)生細(xì)胞核移位，并與靶基因啟動子的特殊序列結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及免疫等多種生理功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[1]。Bartke等[12]的系列研究發(fā)現(xiàn)，GHR敲除小鼠的壽命顯著延長，并具有抗氧化應(yīng)激能力強(qiáng)、循環(huán)血炎癥細(xì)胞因子水平低、脂肪酸β-氧化活性增強(qiáng)和胰島素敏感性高等特點(diǎn)。然而，導(dǎo)致GHR敲除小鼠循環(huán)血炎癥因子水平顯著降低的發(fā)生機(jī)制仍不十分清楚。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在3T3-L1脂肪細(xì)胞中抑制GHR表達(dá)能夠抑制GH誘導(dǎo)的NF-κB的激活，并減輕炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌。這在一定程度上解釋了GHR敲除小鼠盡管其體脂率(體內(nèi)脂肪重量在總體重中所占的比例)較GHR雜合子小鼠顯著增加，但空腹血糖水平和胰島素敏感性等糖代謝功能仍顯著優(yōu)于GHR雜合子小鼠的原因。然而，在胰島素抵抗形成的緩慢進(jìn)程中，引起脂肪組織慢性低度炎癥狀態(tài)的誘因還有許多，如TNF-α和游離脂肪酸水平升高等，沉默細(xì)胞GHR基因表達(dá)是否仍具有抑制脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用還有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Knockdown of growth hormone receptor prevents growth hormone induced inflammatory cytokine production in 3T3-L1 adipocytes

QIAN Hui-lin, HUANG Liang, CHAO Ru, ZHOU Fan, QU Shun-lin, ZHANG Chi

(InstituteofCardiovascularDisease,KeyLaboratoryforArteriosclerologyofHunanProvince,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China.E-mail:zhangchi9966@163.com)

AIM: To investigate the effect of growth hormone receptor (GHR) knockdown on nuclear factor-κB (NF-κB) activity and inflammatory cytokine production stimulated by growth hormone (GH) in 3T3-L1 adipocytes.METHODSThe specific siRNA forGHRwas transfected into 3T3-L1 adipocytes to silenceGHRexpressions. The effects of GH on NF-κB activation and inflammatory cytokine production in 3T3-L1 adipocytes transfected with siRNA-GHR or siRNA-control were measured by dual-luciferase system analysis, real-time RT-PCR and ELISA.RESULTSThe protein expression of GHR was diminished after transfection withGHRspecific siRNA. Dual-luciferase reporter system analysis revealed thatGHRknockdown resulted in attenuation of GH-stimulated NF-κB activation in the 3T3-L1 adipocytes.GHRknockdown ameliorated the GH-induced production of inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1 and MIP-1α in the 3T3-L1 adipocytes.CONCLUSIONKnockdown ofGHRmight be efficacious to prevent GH-induced inflammatory responses in the 3T3-L1 adipocytes.

Chronic low-grade inflammation; Adipocytes; Growth hormone; Growth hormone receptor; Inflammatory cytokines

1000- 4718(2017)11- 2090- 05

2017- 05- 04

2017- 07- 13

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81100106; No. 81670424); 湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 15A166)

△通訊作者 Tel： 0734-8281586； E-mail： zhangchi9966@163.com

R363.21； R541

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.027