雷公藤甲素在LPS誘導(dǎo)的急性葡萄膜炎中的抗炎作用*

蘇映雪， 王延?xùn)|， 甄棟欽， 曹 琛

(中山大學(xué)中山眼科中心， 眼科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510060)

雷公藤甲素在LPS誘導(dǎo)的急性葡萄膜炎中的抗炎作用*

蘇映雪， 王延?xùn)|△， 甄棟欽， 曹 琛

(中山大學(xué)中山眼科中心， 眼科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510060)

目的觀察雷公藤甲素對(duì)細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性葡萄膜炎(LIU)的抗炎作用。方法BALB/c小鼠24只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組和雷公藤甲素組，每組8只，雷公藤甲素組給予0.05%雷公藤甲素滴眼液，空白對(duì)照組和模型組均給予等體積的生理鹽水。連續(xù)給藥30 d后，除空白對(duì)照組外各組小鼠于玻璃體腔內(nèi)注射125 mg/L的LPS建立LIU模型。分別在造模后12、24、48和72 h后，對(duì)各組小鼠眼前節(jié)進(jìn)行裂隙燈檢查，并對(duì)眼組織進(jìn)行病理學(xué)觀察，同時(shí)提取眼組織蛋白，ELISA法檢測(cè)眼組織中細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)的水平。結(jié)果造模24 h后，與模型組相比，雷公藤甲素組能明顯減輕LIU引起的炎癥反應(yīng)并降低炎癥臨床評(píng)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。組織病理學(xué)也表明雷公藤甲素對(duì)小鼠前房、玻璃體腔內(nèi)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及視網(wǎng)膜水腫增厚有明顯的抑制作用。同時(shí)，ELISA結(jié)果顯示雷公藤甲素顯著下調(diào)眼組織中ICAM-1、IL-1β和MCP-1的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論雷公藤甲素可能通過(guò)下調(diào)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，從而減輕葡萄膜炎的眼部組織損傷，為葡萄膜炎的治療提供了新的免疫療法。

雷公藤甲素； 葡萄膜炎； 炎癥細(xì)胞因子

葡萄膜炎(uveitis)是一種累及葡萄膜、視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜血管及玻璃體的常見(jiàn)眼部炎癥性疾病，多發(fā)生于青壯年及少年兒童，在致盲眼病中有重要地位。葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，主要認(rèn)為革蘭氏陰性細(xì)菌感染是其發(fā)病的始動(dòng)因素。目前臨床上治療葡萄膜炎的主要藥物包括糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，雖然有一定療效，但長(zhǎng)期應(yīng)用常常會(huì)導(dǎo)致全身及眼部毒副作用，而且停藥后易復(fù)發(fā)，最終致使視功能下降或視力喪失[1-2]。因此，尋找安全有效的治療藥物是葡萄膜炎研究領(lǐng)域中一項(xiàng)迫切的任務(wù)。本研究采用細(xì)菌脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的葡萄膜炎(LPS-induced uveitis，LIU)模型為研究對(duì)象，探討雷公藤甲素(triptolide，TP)對(duì)急性葡萄膜炎的抗炎作用。

材 料 和 方 法

1主要試劑及儀器

0.05% TP滴眼液(中山大學(xué)中山眼科中心制劑室)；傷寒桿菌脂多糖(Sigma)；細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1，IL-1β)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1) ELISA試劑盒及蘇木素-伊紅染色劑(武漢博士德生物工程有限公司)。手術(shù)顯微鏡(Leica)；裂隙燈數(shù)碼圖像處理系統(tǒng)(Topcon)；熒光顯微鏡(Olympus)；酶標(biāo)儀(BioTek)。

2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)健康雄性BALB/c小鼠24只，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，6～8周齡，體重20 g左右。隨機(jī)分為空白對(duì)照(control)組、模型(LPS)組和TP(TP+LPS)組，每組8只。

3方法

3.1LIU模型的建立[3]及給藥 前期預(yù)試驗(yàn)選取0.0125%、0.025%和0.05%的TP滴眼液給藥30 d，發(fā)現(xiàn)0.05% TP滴眼液對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性葡萄膜炎具有抑制作用，因此，本實(shí)驗(yàn)選取0.05% TP滴眼液給藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。具體給藥方法是空白對(duì)照組和模型組均給予生理鹽水，TP組給予等體積的0.05% TP滴眼液，每間隔2 h給藥1次，每天共4次。連續(xù)給藥30 d后，除空白對(duì)照組外各組小鼠于玻璃體腔內(nèi)注射LPS(125 mg/L)2 μL，建立了LIU小鼠模型。

3.2裂隙燈觀察及評(píng)分 分別于造模后12、24、48和72 h對(duì)各組小鼠眼前節(jié)用裂隙燈顯微鏡觀察炎癥反應(yīng)，拍照并詳細(xì)記錄臨床體征。炎癥分級(jí)具體的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]：虹膜充血(0～3分)、前房滲出(0～2分)、前房積膿(0～1分)、瞳孔縮小(0～1分)，總分為7分。

3.3組織病理學(xué)觀察 造模24 h后，每組隨機(jī)麻醉處死3只小鼠，立即取出雙眼眼球，并將眼球置于4%多聚甲醛固定液中，4 ℃過(guò)夜。次日，依次進(jìn)行蔗糖梯度脫水包埋，制作眼球石蠟組織切片，厚度為4 μm，進(jìn)行HE染色，于熒光顯微鏡下拍照觀察，并在高倍鏡視野下統(tǒng)計(jì)虹膜睫狀體和玻璃體腔內(nèi)浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞數(shù)，取3張切片炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均值為該眼球炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)。

3.4細(xì)胞因子測(cè)定 將新鮮分離的虹膜睫狀體及視網(wǎng)膜組織置于液氮中研磨，每100 mg組織加入0.5 mL裂解液，冰浴下超聲充分破碎細(xì)胞，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，最后將樣品置于酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)為450 nm的吸光度A值，檢測(cè)造模24 h后組織中ICAM-1、IL-1β和MCP-1的水平。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1TP對(duì)LIU眼前節(jié)炎癥反應(yīng)的影響

裂隙燈下可見(jiàn)空白對(duì)照組小鼠眼部無(wú)葡萄膜炎體征；模型組在造模12 h后，眼前節(jié)出現(xiàn)典型的葡萄膜炎體征，包括虹膜充血、房水閃輝及前房炎性滲出等，24 h后炎癥反應(yīng)達(dá)到高峰，前房積膿明顯、瞳孔顯著縮小甚至瞳孔膜閉，量化評(píng)分為6.53±0.45，相對(duì)于正常組(0.11±0.01)明顯增高(P<0.01)，證明葡萄膜炎造模成功；TP組小鼠眼部偶見(jiàn)輕度的虹膜充血，前房見(jiàn)少量纖維素樣滲出，無(wú)前房積膿，量化評(píng)分為3.38±0.37，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。造模48 h后，眼前節(jié)炎癥反應(yīng)急劇下降，72 h后炎癥反應(yīng)幾乎完全消失，見(jiàn)圖1。

2TP對(duì)LIU眼組織病理形態(tài)的影響

眼球石蠟組織切片HE染色結(jié)果可見(jiàn)，空白對(duì)照組虹膜睫狀體和視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)完整正常，前房、視網(wǎng)膜及玻璃體腔內(nèi)均未見(jiàn)炎癥細(xì)胞；模型組虹膜睫狀體組織及前房?jī)?nèi)見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維素樣滲出，視網(wǎng)膜內(nèi)表面可見(jiàn)玻璃體腔內(nèi)炎癥絮狀滲出及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，視網(wǎng)膜水腫增厚并伴有血管炎癥反應(yīng)；TP組虹膜睫狀體和玻璃體腔內(nèi)僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，TP組虹膜睫狀體處炎癥細(xì)胞數(shù)減少69.17%，玻璃體腔內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)減少58.93%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 1. The typical signs and clinical score of uveitis in each group. A: control group; B: LPS group; C: TP+LPS group. Arrows indicate anterior chamber empyema. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsB.

圖1各組小鼠裂隙燈下葡萄膜炎體征及量化評(píng)分

Figure 2. The histological examination and inflammatory cell counting in each group. A: control group; B: LPS group; C: TP+LPS group. Arrows indicate inflammatory cells and neovascularization. Mean±SD.n=6 .**P<0.01vsB.

圖2各組小鼠眼球病理切片及炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)

3TP對(duì)LIU眼組織ICAM-1、IL-1β和MCP-1水平的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組相比，TP組虹膜睫狀體中ICAM-1、IL-1β和MCP-1水平分別降低42.78%、51.56%和48.06%，視網(wǎng)膜中ICAM-1、IL-1β和MCP-1水平分別降低34.58%、54.43%和45.58%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1、2。

表1各組小鼠虹膜睫狀體中ICAM-1、IL-1β和MCP-1水平的比較

Table 1. The levels of ICAM-1， IL-1β and MCP-1 in the corpus ciliare choroideae (Mean±SD.n=6)

GroupICAM?1(μg/g)IL?1β(ng/g)MCP?1(ng/g)Control6．82±0．960．87±0．041．46±0．13LPS35．53±2．154．17±0．20218．52±10．33TP+LPS20．33±1．24?2．02±0．03??113．49±8．15??

*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

表2各組小鼠視網(wǎng)膜中ICAM-1、IL-1β和MCP-1水平的比較

Table 2. The levels of ICAM-1, IL-1β and MCP-1 in the retina (Mean±SD.n=6)

GroupICAM?1(μg/g)IL?1β(ng/g)MCP?1(ng/g)Control3．76±0．550．57±0．021．03±0．08LPS22．41±2．352．37±0．43151．11±9．68TP+LPS14．66±1．28?1．08±0．06??82．23±10．22??

*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

討 論

葡萄膜炎以其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、患病率高和治療困難成為困擾患者和眼科醫(yī)生的一種疾病。且葡萄膜炎的誘發(fā)病因較多，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，且易反復(fù)發(fā)作，出現(xiàn)多種并發(fā)癥，并可能最終導(dǎo)致失明。雖然葡萄膜炎的具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚，但其最終致盲的因素歸結(jié)于炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的眼內(nèi)組織損傷。葡萄膜富含豐富的血管，為眼內(nèi)組織提供大部分的血液，也是炎癥細(xì)胞進(jìn)入眼內(nèi)的重要渠道。已有研究[5]發(fā)現(xiàn)葡萄膜炎患者由于血-房水屏障破壞，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管內(nèi)蛋白滲出，房水中和葡萄膜固有組織細(xì)胞表達(dá)大量的炎癥介質(zhì)(IL-1β、MCP-1、MIP-1、TNF-α等)，血-房水屏障周?chē)难装Y細(xì)胞暴露于細(xì)胞因子和趨化因子，從而進(jìn)一步引發(fā)炎癥細(xì)胞多種自分泌和旁分泌效應(yīng)，產(chǎn)生更多的炎癥介質(zhì)，而其中很多的炎癥介質(zhì)具有細(xì)胞毒性作用及致組織損傷作用，最終可導(dǎo)致眼內(nèi)組織損傷。

LIU是比較成熟的人類(lèi)急性前葡萄膜炎動(dòng)物模型，具有炎癥發(fā)生速度快、病程短、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性和穩(wěn)定性較好、易于觀察等特點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用。LPS通過(guò)激活Toll樣受體-4介導(dǎo)的先天免疫和適應(yīng)性免疫，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎癥細(xì)胞因子(ICAM-1、IL-1、MCP-1等)，最終引起炎癥，這可能是啟動(dòng)急性前葡萄膜炎的一個(gè)重要因素[6-7]。早有研究表明，葡萄膜炎發(fā)病過(guò)程中，ICAM-1介導(dǎo)白細(xì)胞和炎癥部位組織細(xì)胞的識(shí)別和黏附，導(dǎo)致眼部組織的免疫性損傷[8]。IL-1β主要介導(dǎo)致炎因子IL-1的生物學(xué)作用[9]。宋芹等[10]報(bào)道雷公藤多苷可能是通過(guò)降低血清IL-1β水平而達(dá)到治療白塞氏病葡萄膜炎的作用。MCP-1能誘導(dǎo)并活化單核巨噬細(xì)胞，同時(shí)也調(diào)節(jié)單核細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[11]。大量的研究也表明，MCP-1在人急性葡萄膜炎時(shí)顯著升高，并與臨床癥狀的嚴(yán)重程度相關(guān)[12-13]。這都提示了細(xì)胞因子ICAM-1、IL-1β和MCP-1是誘發(fā)急性葡萄膜炎的關(guān)鍵因素。

TP是從衛(wèi)矛科雷公藤中分離得到的活性最高的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，是雷公藤中的主要有效成分。TP的生理活性很強(qiáng)，具有明顯的抗炎、免疫抑制、抗腫瘤及抗生育等作用[14-15]。近年來(lái)研究證明，TP被廣泛用于治療對(duì)激素產(chǎn)生依賴(lài)性、反復(fù)發(fā)作的免疫性眼病，如葡萄膜炎、鞏膜炎、BehCet病等已取得滿意的療效[16]。目前臨床上常用的TP制劑為雷公藤多苷片、雷公藤總萜片等，但它們成分復(fù)雜，不易控制，降低了用藥的安全性，并存在口服產(chǎn)生的首過(guò)效應(yīng)、水溶性差、生物利用度低、有效治療量小、治療窗窄等缺點(diǎn)[17]。因此本研究將TP制成滴眼液制劑，給予眼部局部用藥治療，在發(fā)揮其對(duì)葡萄膜炎最佳治療效果的同時(shí)減少全身給藥帶來(lái)的副作用。小鼠眼部臨床表現(xiàn)顯示，與模型組相比，TP組能明顯減輕LPS誘導(dǎo)的葡萄膜炎體征，組織病理學(xué)也表明TP組能明顯抑制虹膜睫狀體和玻璃體腔內(nèi)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕視網(wǎng)膜水腫增厚，同時(shí)TP組虹膜睫狀體和視網(wǎng)膜中炎癥因子ICAM-1、IL-1β和MCP-1水平均明顯低于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究結(jié)果提示，TP可能通過(guò)下調(diào)炎癥因子ICAM-1、IL-1β和MCP-1表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的眼部炎癥反應(yīng)，最終改善葡萄膜炎。

綜上所述，0.05%TP滴眼液滲透性強(qiáng)，充分發(fā)揮TP的局部抗炎作用，明顯減輕葡萄膜炎的眼部組織損傷，從而為葡萄膜炎的治療提供了新的免疫療法。但TP滴眼液的開(kāi)發(fā)仍存在許多難點(diǎn)待攻克：(1)溶解性，即選擇合適的溶劑或?qū)P的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾來(lái)提高TP的溶解度；(2)抑菌，即添加合適的抑菌劑來(lái)避免使用過(guò)程中出現(xiàn)污染；(3)pH范圍，即調(diào)整合適的酸堿度來(lái)減少對(duì)眼部的刺激性；(4)處方和制備工藝。

[1] Brady CJ, Villanti AC, Law HA, et al. Corticosteroid implants for chronic non-infectious uveitis[J]. Cochrane Database Syst Rev, 2016, 2:CD010469.

[2] Agrawal R, Lee C, Phatak S, et al. Immunopharmacotherapy of non-infectious uveitis: where do we stand？[J]. Expert Opin Biol Ther, 2014, 14(12):1719-1722.

[3] Qiu YG, Shil PK, Zhu P, et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) activator diminazene aceturate ameliorates endotoxin-induced uveitis in mice[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2014, 55(6):3809-3818.

[4] Gu R， Lei B, Shu Q, et al. Glucocorticoid-induced leucine zipper overexpression inhibits lipopolysaccharide-induced retinal inflammation in rats[J]. Exp Eye Res, 2017， 165：151-163.

[5] Chen SC, Sheu SJ. Recent advances in managing and understanding uveitis[J]. F1000Res, 2017, 6:280.

[6] 李劍冰, 徐國(guó)興. 葡萄膜炎及其模型中相關(guān)細(xì)胞因子的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際眼科雜志, 2015, 15(7):1172-1175.

[7] 孟愛(ài)宏, 凌亦凌, 張霄鵬. p38 MAPK和STAT3參與CCK-8抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠促炎癥細(xì)胞因子生成[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2013, 29(6):1095-1101.

[8] 孟 晶, 陳 建, 蘇李辰, 等.山茱萸總甙滴眼液防治角膜移植免疫排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2003, 19(4):511-513.

[9] 郎艷松, 秘紅英, 劉美之, 等.通心絡(luò)聯(lián)合阿托伐他汀、阿司匹林對(duì)家兔動(dòng)脈粥樣硬化早期血管外膜炎癥因子表達(dá)的干預(yù)[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2015, 31(1):154-159.

[10] 宋 芹, 蘆濟(jì)州, 李 健, 等. 雷公藤多苷對(duì)白塞病患者血清白介素-1β、白介素-2、腫瘤壞死因子-α及干擾素-γ的影響[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2010, 30(6):598-600.

[11] 張 萍, 張愛(ài)榮, 洪淑惠, 等.單核細(xì)胞趨化因子-1介導(dǎo)單核細(xì)胞治療卵巢癌的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)病理生理雜志, 2008, 24(6):1114-1118.

[12] Wegscheider BJ, Weger M, Renner W, et al. Role of the CCL2/MCP-1 -2518A>G gene polymorphism in HLA-B27 associated uveitis[J]. Mol Vis, 2005, 11:896-900.

[13] Chu CJ, Gardner PJ, Copland DA, et al. Multimodal analysis of ocular inflammation using the endotoxin-induced uveitis mouse model[J]. Dis Model Mech, 2016, 9(4):473-481.

[14] Han R, Rostami-Yazdi, Gerdes S, et al. Triptolide in the treatment of psoriasis and other immune-mediated inflammatory diseases[J]. Br J Clin Pharmacol, 2012, 74(3):424-436.

[15] Wei D, Huang Z. Anti-inflammatory effects of triptolide in LPS-induced acute lung injury in mice[J]. Inflammation, 2014, 37(4):1307-1316.

[16] 張冰潔， 吳雅臻， 郝繼龍. 雷公藤內(nèi)酯醇的藥理作用機(jī)制及其在眼科應(yīng)用的研究展望[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2009, 24(29):3306-3308.

[17] 余雅婷, 朱衛(wèi)豐, 金 晨, 等. 雷公藤甲素的劑型改進(jìn)及給藥方式研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)新藥雜志, 2016, 25(12):1359-1362.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Anti-inflammatory effect of triptolide on LPS-induced uveitis

SU Ying-xue, WANG Yan-dong, ZHEN Dong-qin, CAO Chen

(StateKeyLaboratoryofOphthalmology,ZhongshanOphthalmicCenter,SunYat-senUniversity,Guangzhou510060,China.E-mail: wangydsyj@163.com)

AIM: To observe the anti-inflammatory effect of triptolide (TP) on lipopolysaccharide (LPS)-induced uveitis (LIU).METHODSBALB/c mice (n=24) were randomly divided into 3 groups: blank control group (treated with normal saline), model group (treated with normal saline) and triptolide treatment group (treated with 0.05% triptolide eye drops)， with 8 mice in each group. The mice in model group and triptolide treatment group were intravitreally injected with LPS after 30 d of drug treatment. The anterior chamber was assessed by slit-lamp examination at different time points after modeling. Ocular tissues were collected for histological examination. The protein levels of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), interleukin-1β (IL-1β) and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) in iridial and retinal samples were tested by ELISA.RESULTSCompared with model group, the inflammatory reaction and clinical score were obviously decreased in triptolide treatment group at 24 h after modeling (P<0.01). The histopathological observation indicated that infiltrating inflammatory cells were dramatically reduced in the anterior and posterior segments by triptolide eye drops. In addition, the expression levels of ICAM-1, IL-1β and MCP-1 were significantly decreased in the ocular tissues by treatment with triptolide (P<0.05).CONCLUSIONTriptolide prevents the injury of LIU by down-regulating inflammatory cytokines, and may be a new immune therapy for uveitis.

Triptolide; Uveitis; Inflammatory cytokines

1000- 4718(2017)11- 2099- 05

2017- 05- 24

2017- 07- 05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81500739)；廣東省中醫(yī)藥局科研項(xiàng)目(No. 20151168)；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項(xiàng)目(No. A2015170)

△通訊作者 Tel: 020-87331543； E-mail: wangydsyj@163.com

R773.9； R285.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.029