趙燁清+石莉+歐陽(yáng)臻+聞崇煒

摘要：恰當(dāng)?shù)募?xì)胞破碎工藝是獲取胞內(nèi)蛋白質(zhì)的必需環(huán)節(jié)，然而現(xiàn)有細(xì)胞破碎技術(shù)仍有較多不足。為了研究合適的細(xì)胞破碎方法，擬通過(guò)化學(xué)法與滲透壓法的聯(lián)用，建立化學(xué)-滲透壓法溫和高效破碎大腸桿菌細(xì)胞的新工藝。結(jié)果表明：（1）單用化學(xué)法處理大腸桿菌細(xì)胞，最高僅能釋放37.3%的胞內(nèi)蛋白質(zhì)，而化學(xué)-滲透壓法最高可以釋放842%的胞內(nèi)蛋白質(zhì)；對(duì)滲透壓處理環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化后，胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率提高至93.1%及以上；（2）以優(yōu)化的化學(xué)-滲透壓法釋放重組原動(dòng)蛋白2β（PK2β）工程菌細(xì)胞的胞內(nèi)蛋白質(zhì)，其中70.5%～80.2%重組PK2β呈可溶性，而超聲法處理的樣品中不含有可溶性重組PK2β，表明化學(xué)-滲透壓法不僅簡(jiǎn)便高效、成本低廉，而且有利于保留可溶性重組蛋白質(zhì)，而超聲破碎法會(huì)導(dǎo)致可溶性蛋白發(fā)生變性沉淀而增加蛋白質(zhì)分離的難度。綜合分析可知，化學(xué)-滲透壓法在基因工程及生物工程中具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：化學(xué)-滲透壓法；細(xì)胞破碎；溫和高效；胞內(nèi)蛋白質(zhì)；可溶性

中圖分類號(hào)： Q939.97 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）19-0146-04

收稿日期：2016-05-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81573529）；江蘇大學(xué)高級(jí)人才啟動(dòng)基金（編號(hào)：1281370001）；江蘇省2015年度普通高校研究生實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃（編號(hào)：SJLX15_0512）；江蘇大學(xué)第14批大學(xué)生科研立項(xiàng)項(xiàng)目（編號(hào)：14A441）。

作者簡(jiǎn)介：趙燁清（1992—），女，江蘇南通人，碩士研究生，主要從事食源性功能肽的研發(fā)工作。E-mail：18796020517@163.com。

通信作者：聞崇煒，博士，副教授，主要從事食源性功能肽的研發(fā)工作。E-mail：wenchw@ujs.edu.cn。 大腸桿菌（Escherichia coli，簡(jiǎn)稱E. coli）是基因工程與生物工程中表達(dá)重組蛋白質(zhì)最常用的宿主菌。重組蛋白質(zhì)通常被表達(dá)在E.coli胞內(nèi)，必須進(jìn)行細(xì)胞破碎后才能進(jìn)行相應(yīng)的分離純化[1]?，F(xiàn)有的細(xì)胞破碎方法分為機(jī)械法、化學(xué)法、物理法及生物酶法四大類，在實(shí)際應(yīng)用中這些方法仍有較多不足。例如，機(jī)械法破碎效率高，但是需要高速珠磨機(jī)、高壓勻漿機(jī)等貴重設(shè)備，同時(shí)由于發(fā)熱大，可能重組蛋白質(zhì)的生物活性[2-3]；化學(xué)法簡(jiǎn)便，但所用有機(jī)溶劑及變性劑也可能影響重組蛋白質(zhì)的生物活性[4-5]；物理法條件溫和，但破碎效率較低[6]；生物酶法條件溫和、破碎效率較高，但碎菌成本較高[7]。因此可見(jiàn)，開(kāi)發(fā)溫和且具有高破碎效率的簡(jiǎn)便工藝在基因工程及生物工程中有較高的應(yīng)用價(jià)值。

形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明，E. coli細(xì)胞壁是由脂多糖層、磷脂層與肽聚糖層組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，具備較強(qiáng)的抗拉伸與抗剪切能力。滲透壓法利用滲透壓差破碎細(xì)胞，條件溫和，可以很好地保留蛋白質(zhì)的生物活性，但是作用力較弱，不足以完全破碎E. coli細(xì)胞壁，目前僅用于釋放出周質(zhì)空間的蛋白質(zhì)[8]。本試驗(yàn)擬研究將化學(xué)法與滲透壓法聯(lián)用（本研究均簡(jiǎn)稱為化學(xué)-滲透壓法），從而實(shí)現(xiàn)既高效徹底破壞E. coli細(xì)胞壁，又完全釋放胞內(nèi)蛋白質(zhì)，同時(shí)能保留蛋白質(zhì)生物活性的可能性。本研究為該法處理E. coli BL21（DE3）、重組原動(dòng)蛋白2β（PK2β）工程菌的試驗(yàn)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

E. coli BL21（DE3）為筆者所在研究室保存，重組質(zhì)粒pET-28-PK2β為筆者所在研究室構(gòu)建，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化獲得相應(yīng)重組工程菌[9]。

蛋白胨、酵母膏，購(gòu)自O(shè)xoid公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、考馬斯亮藍(lán)、卡那霉素、二硫蘇糖醇（DTT），購(gòu)自BBI公司（Bio Basic Inc.）；溴酚藍(lán)，購(gòu)自AMRESCO公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）（生物技術(shù)級(jí)），購(gòu)自Merck公司；丙烯酰胺（超級(jí)純）、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺（超級(jí)純）、乙二胺四乙酸（EDTA，分析純），購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；Triton X-100（化學(xué)純），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、過(guò)硫酸銨、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺、乙醇、冰醋酸等其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉（進(jìn)口分裝），購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)SpectraTM Multicolor Broad Range Protein Ladder，購(gòu)自MBI公司，含有10、15、25、35、40、50、70、100、140、260 ku的條帶。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大腸桿菌培養(yǎng)和收集 E. coli BL21（DE3）采用一步法培養(yǎng)：將E. coli BL21（DE3）甘油菌凍存液按1‰比例接種到新鮮LB培養(yǎng)基（含1%蛋白胨、0.5%酵母膏、1% NaCl）中，37 ℃、250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)15 h。培養(yǎng)液于10 000 r/min離心5 min，棄上清，菌體保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

重組PK 2β的E. coli BL21（DE3）工程菌采用兩步法培養(yǎng)：取3 μL重組工程菌凍存液接種到3 mL新鮮LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)15 h獲得種子。隨后將種子液按照1%比例接種到新鮮LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、250 r/min繼續(xù)培養(yǎng)至D600 nm達(dá)到0.6左右，加誘導(dǎo)劑后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)液于10 000 r/min離心5 min，棄上清，菌體保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 常規(guī)化學(xué)-滲透壓法 包括化學(xué)法預(yù)處理、滲透壓法2個(gè)環(huán)節(jié)，具體操作如下：（1）稱取適量?jī)龃鍱. coli菌體，按每30 mg菌體分別加入1 mL EDTA碎菌液或2.5 mL Triton X-100 碎菌液，4 ℃混勻過(guò)夜，然后于10 000 r/min離心 5 min，收集菌體備用；（2）取上述化學(xué)法預(yù)處理所得菌體，按每30 mg菌體加1 mL高滲液的比例重懸，室溫放置20 min，8 000 r/min 離心10 min，再按每30 mg菌體加1 mL低滲液的比例重懸，室溫放置20 min，8 000 r/min離心10 min；（3）繼續(xù)按步驟（2）重復(fù)處理殘留菌體2～4次。分別收集所得上清與沉淀菌體，待分析。endprint

化學(xué)預(yù)處理液含適量EDTA或Triton X-100，0.05 mol/L Tris·HCl（pH值8.0）及0.10 mol/L NaCl。低滲液含0.02 mol/L Tris·HCl（pH值 8.0）、0.002 5 mol/L EDTA（pH值8.0）。在低滲液中加20%蔗糖作為滲透壓穩(wěn)定劑，即得高滲液。

1.2.3 改進(jìn)化學(xué)-滲透壓法 具體操作流程同“1.2.2”節(jié)；化學(xué)預(yù)處理液成分同“1.2.2”節(jié)；低滲液成分同“1.2.2”節(jié)；高滲液中改用35%蔗糖或20%PEG 8000為滲透壓穩(wěn)定劑。

1.2.4 超聲破碎法 按吳蕾等所述流程[10-11]并略作修改：取50 mg菌體重懸于預(yù)冷的低滲液中，冰浴中用超聲破碎儀（購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司）處理（功率300 W，每次超聲破碎25 s，暫停25 s，超聲20次）。取適量樣品于 13 000 r/min 離心10 min，分出上清與沉淀，待分析。

1.2.5 蛋白質(zhì)電泳 按常規(guī)方法[12]進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，其中濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為10%。電泳結(jié)束后凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色后的凝膠用成像系統(tǒng)拍照保存待分析。

1.2.6 胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率計(jì)算 樣品中蛋白質(zhì)含量與電泳對(duì)應(yīng)條帶及染色后條帶深淺呈線性關(guān)系，因此可通過(guò)分析染色后條帶的灰度值計(jì)算蛋白質(zhì)含量[13]。SDS-PAGE凝膠圖像用Quantity OneTM v 4.5軟件（購(gòu)自Bio-Rad Laboratories Inc.）進(jìn)行各條帶的灰度值分析定量，按照以下公式計(jì)算胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率：胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率=上清蛋白灰度值×上清稀釋倍數(shù)上清蛋白灰度值×上清稀釋倍數(shù)+沉淀蛋白灰度值×沉淀稀釋倍數(shù)×100%。

1.2.7 大腸桿菌菌落形成單位（colony forming unit assay，簡(jiǎn)稱CFU）檢測(cè) 參照Sahoo等所述流程并略作修改：用含有1.5%瓊脂粉的新鮮LB固體培養(yǎng)基（含 50 μg/mL 卡那霉素）制備平板，將對(duì)照菌液與化學(xué)-滲透壓法處理所得菌液適當(dāng)稀釋后涂平板，于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng) 16 h，取出平板，計(jì)算所得菌落數(shù)量[14-15]。

1.2.8 大腸桿菌形態(tài)觀察 E. coli細(xì)胞按鄒如意等所述方法[16]進(jìn)行固定，用掃描電鏡技術(shù)（scanning electron microscope，簡(jiǎn)稱SEM）直接觀察E. coli細(xì)胞處理前后的形態(tài)，所用儀器為日立公司的S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，放大倍數(shù)為2 000倍。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)法預(yù)處理E. coli菌體

按“1.2.2”節(jié)所述，用10～30 mmol/L EDTA與0.25%～1.25% Triton X-100預(yù)處理E. coli菌體，結(jié)果表明，以上2種試劑分別可以釋放出2.42%～11.8%與12.5%～37.3%的胞內(nèi)蛋白質(zhì)，25 mmol/L EDTA與1.00% Triton X-100為各組的較優(yōu)處理（圖1）。EDTA與Triton X-100分別為溫和的螯合劑與表面活性劑，分別作用于細(xì)胞壁中的脂多糖層與磷脂層。由圖1還可以看出，Triton X-100的釋放率高于EDTA，可能因?yàn)镋DTA除去脂多糖層后，磷脂層仍保持完整，胞內(nèi)蛋白質(zhì)不易透過(guò)；而Triton X-100除去磷脂層后，脂多糖層有較多間隙，胞內(nèi)蛋白質(zhì)較易透過(guò)。

2.2 常規(guī)化學(xué)-滲透壓法破碎E. coli菌體

為了提高胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率，將化學(xué)法預(yù)處理法與常規(guī)滲透壓法聯(lián)用，以20%蔗糖為滲透壓穩(wěn)定劑，進(jìn)行3次滲透壓法處理。結(jié)果表明，化學(xué)法預(yù)處理提高了后續(xù)滲透壓法的破碎效率，不僅釋放出E. coli周質(zhì)空間的蛋白質(zhì)，而且釋放出大量胞內(nèi)蛋白質(zhì)。其中，EDTA+20%蔗糖處理可釋放出 16.9%～35.7%的胞內(nèi)蛋白質(zhì)；Triton X-100+20%蔗糖處理可釋放出37.6%～84.2%的胞內(nèi)蛋白質(zhì)；25 mmol/L EDTA與1.00% Triton X-100分別為各組的較優(yōu)處理（圖2）。形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明， E. coli 細(xì)胞具有外膜、 內(nèi)膜的雙層膜結(jié)構(gòu)，影響了高滲液與低滲液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，因此單用滲透壓法不能完全破碎細(xì)胞。而化學(xué)法預(yù)處理可以使外膜與內(nèi)膜產(chǎn)生缺陷，有利于隨后的高滲液、低滲液迅速進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞來(lái)不及發(fā)生相應(yīng)形變而被完全破碎。

2.3 改進(jìn)的化學(xué)-滲透壓法破碎E. coli菌體

改進(jìn)滲透壓穩(wěn)定劑與增加處理次數(shù)可以提高滲透壓法碎菌的效率，因此，分別配制含有35%蔗糖、20% PEG 8000、20% PEG 4000的高滲液進(jìn)行細(xì)胞破碎。如圖3所示：各高滲液的碎菌效率排序依次為35%蔗糖、20%PEG 8000>20% PEG 4000>20%蔗糖；5次滲透壓法碎菌效率比3次滲透壓法高6.9%～46.7%。

綜上所述，化學(xué)-滲透壓法的最優(yōu)條件為25 mmol/L EDTA預(yù)處理E. coli菌體，再以35%蔗糖或20% PEG 8000為滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行5次滲透壓法處理；或以1%Triton X-100預(yù)處理E. coli菌體，再以35%蔗糖或20%PEG 8000為滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行3、5次滲透壓法處理，胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率分別可以達(dá)到93.1%、100.0%。

2.4 改進(jìn)的化學(xué)-滲透壓法破碎重組PK2β工程菌

以上述改進(jìn)的化學(xué)-滲透壓法處理重組PK2β工程菌，對(duì)SDS-PAGE凝膠進(jìn)行定量分析表明，25 mmol/L EDTA +35%蔗糖、25 mmol/L EDTA +20% PEG 8000處理分別可以釋放96.4%、91.3%的胞內(nèi)蛋白質(zhì)；1% Triton X-100 +35%蔗糖、1% Triton X-100+20% PEG 8000處理分別可以釋放99.0%、94.3%的胞內(nèi)蛋白質(zhì)；以超聲破碎法處理重組工程菌，胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率為92.5%。因此可見(jiàn)，改進(jìn)的化學(xué)-滲透壓法的破碎效率與目前常用的超聲破碎法相當(dāng)。endprint

SDS-PAGE結(jié)果還顯示，化學(xué)-滲透壓法破碎工程菌后所得上清及沉淀中均含有重組PK2β，上清中含有的可溶性重組PK2β占總量的70.5%～80.2%；而在超聲破碎法中，處理相同樣品后，重組PK2β均在沉淀中，上清中未見(jiàn)可溶性重組PK2β（圖4）。由此表明，超聲破碎法不僅損傷重組蛋白質(zhì)[17]，同時(shí)會(huì)使可溶性重組蛋白質(zhì)變性沉淀，從而增加后續(xù)蛋白質(zhì)分離的難度。

以菌落形成單位（CFU）檢測(cè)與掃描電子顯微鏡（SEM）觀察化學(xué)-滲透壓法處理對(duì)工程菌細(xì)胞的影響。菌落數(shù)量檢測(cè)結(jié)果表明，化學(xué)-滲透壓法處理后樣品所產(chǎn)生的克隆數(shù)僅為對(duì)照組的1%以下，表明該方法可以完全破碎工程菌細(xì)胞。SEM結(jié)果顯示，破碎前大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)完整，而化學(xué)-滲透壓法處理后大腸桿菌幾乎完全被破碎，留下很多無(wú)定形細(xì)胞殘片；超聲法處理后大腸桿菌發(fā)生斷裂，留下很多短棒狀細(xì)胞殘片（圖5）。由此表明，化學(xué)-滲透壓法與超聲法的碎菌機(jī)制不同，從而產(chǎn)生不同的破碎效果。

3 討論與結(jié)論

溫和高效地破碎大腸桿菌細(xì)胞是獲取其胞內(nèi)蛋白質(zhì)的必經(jīng)流程，但現(xiàn)有的細(xì)胞破碎工藝仍有較多不足，影響了基因工程及生物工程的發(fā)展。為了便于后續(xù)分離及獲取有生物活性的重組蛋白，目前常用共表達(dá)分子伴侶蛋白質(zhì)、二硫鍵異構(gòu)酶或脯氨酸異構(gòu)酶，或構(gòu)建帶金黃色葡萄球菌蛋白A、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白malE、大腸桿菌硫氧還蛋白的融合蛋白以提高重組蛋白質(zhì)的可溶性[18-21]。本研究結(jié)果表明，即使有可溶性蛋白表達(dá)出來(lái)，超聲破碎法也可能導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)被變性沉淀， 從而使后續(xù)分離復(fù)雜化并

需要額外的復(fù)性環(huán)節(jié)。

本研究建立的化學(xué)-滲透壓法具有簡(jiǎn)便高效、成本低廉、易于操作及放大的優(yōu)點(diǎn)，可以完全破碎重組PK2β工程菌細(xì)胞，并且獲得70.5%的可溶性重組PK2β，為后續(xù)大量制備該蛋白提供了便利。同時(shí)該法也可用于破碎其他工程菌細(xì)胞，有利于保持其他可溶性重組蛋白質(zhì)的活性，因此在基因工程及生物工程中具有良好的應(yīng)用前景。

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