響應曲面法優(yōu)化雷公藤農藥用總生物堿的閃式雙水相提取工藝

李安　田昌義　許沛　楊薇　吳德智

摘要：以雷公藤總生物堿提取率為指標，采用乙醇-硫酸銨閃式雙水相提取法對總生物堿提取工藝進行單因素及Box-Behnken響應曲面試驗優(yōu)化。結果表明，雷公藤總生物堿閃式雙水相提取的最佳工藝條件為提取時間126 s、（NH4）2SO4用量0.41 g/mL、液料比24 mL ∶1 g、pH值3，此條件下得到的雷公藤總生物堿提取率為（19.01±008）%。該工藝科學、合理、可行，為殺蟲活性物質雷公藤生物堿的產業(yè)化開發(fā)奠定了基礎。

關鍵詞：雷公藤；總生物堿；閃式提取；雙水相；Box-Behnken響應曲面試驗

中圖分類號： TQ453.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）19-0187-04

收稿日期：2017-03-29

基金項目：貴州省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（編號：201514440014）；貴州省教育廳教學改革項目（編號：2015QNXM08）。

作者簡介：李 安（1989—），女，重慶人，碩士，講師，主要從事天然產物開發(fā)及保健食品研究。E-mail：20140517@git.edu.cn。

通信作者：吳德智，博士，副教授，主要從事食品與藥品研究開發(fā)。E-mail：47722068@qq.com。 雷公藤系衛(wèi)矛科（Celastracese）雷公藤屬植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）的根，在我國資源豐富，具有較好的藥用和農用價值。其活性成分主要是二萜內酯類、生物堿類及三萜類化合物等，具有抗菌、抗炎、免疫調節(jié)等多種藥理作用，可治療類風濕性關節(jié)炎、系統性紅斑狼瘡等，臨床應用廣泛[1-2]。我國民間常利用雷公藤防治各種害蟲，其主要殺蟲成分為雷公藤總生物堿，對多種害蟲具有較強的胃毒、拒食、麻痹、觸殺和生長發(fā)育抑制等作用[3-8]。因此，雷公藤作為一種殺蟲植物具有較大的研究開發(fā)潛力。

閃式提取法作為一種新的提取方法，利用適當溶劑在數秒至幾分鐘內將物料快速破碎至適當粒度，通過高速攪拌、超強振動、負壓滲濾等功能實現提取[9]。閃式提取法具有操作清洗簡單、維護方便的特點，且較短的提取時間使得能耗減少，降低了生產成本。目前閃式提取法的研究已涉及中藥、食品、農副產品等領域，具有快速、高效、節(jié)能、環(huán)保等特點[10-11]，結合雙水相提取，有更好的分離性能，且有利于醇類的回收[12-13]。因此，本研究以雷公藤總生物堿提取率為指標，通過單因素和Box-Behnken響應曲面試驗優(yōu)化閃式雙水相提取工藝條件，對雷公藤農藥的研究及開發(fā)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雷公藤藥材，購自福建漢堂生物制藥股份有限公司；正己烷、無水乙醇等試劑均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司；雷公藤吉堿（自制，純度大于98%），用面積歸一法制得；甲醇（色譜純），購自美國天地有限公司。

1.2 儀器與設備

JHBE-50T閃式提取器，購自河南金鼎科技發(fā)展有限公司；FA1004B電子天平，購自上海越平科學儀器有限公司；UV-2550 型紫外-可見分光光度計，購自梅特勒-托利多（中國）；HH-1智能數顯電熱恒溫水浴鍋，購自杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)器，購自上海上天精密儀器有限公司；KQ5200DE型數控超聲清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雙水相體系的確定及閃式雙水相提取雷公藤總生物堿工藝 準確稱取100 g雷公藤根皮粉末（粉碎過100目篩），按試驗要求加入適量的乙醇-硫酸銨雙水相體系溶液，閃式提取。取上清液于60 ℃真空旋轉蒸發(fā)回收溶劑，所得濃縮液真空干燥，得雷公藤總生物堿提取物。由前期預試驗可知，當乙醇體積分數為40%、（NH4）2SO4用量為0.2～0.5 g/mL 時可以形成較穩(wěn)定的雙水相體系。因此，本試驗固定乙醇的體積分數為40%，進行其他工藝參數的考察。

1.3.2 雷公藤總生物堿含量的測定[14]

1.3.2.1 標準曲線的繪制 精確稱取適量雷公藤吉堿，加甲醇配制成濃度為304 μg/mL的對照品儲備液。精確量取10、15、2.0、2.5、3.0、3.5 mL雷公藤吉堿對照品儲備液置于 10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，在268 nm波長處測定其吸光度，得出以吸光度（D268 nm）為縱坐標、以雷公藤吉堿的濃度（x）為橫坐標的標準回歸方程為D268 nm=0.005 8x-0.008 73，r=0.999 2。雷公藤吉堿的濃度在 30.4～103.2 μg/mL 范圍內線性關系良好。

1.3.2.2 供試品溶液的測定 取雷公藤生物堿提取物，用30 mL、0.5 mol/L HCl溶液提取3次，合并酸液，用30 mL三氯甲烷萃取酸水液2次，棄去三氯甲烷層，在酸水中加入濃氨水調節(jié)pH值約為7，靜置，用濾紙過濾，加濃氨水調節(jié)pH值為9～11，再用90 mL三氯甲烷分3次萃取至水中無生物堿為止，合并三氯甲烷液，在旋轉蒸發(fā)儀中濃縮至干，加入5%HCl溶液并定容至 25 mL，即得雷公藤總生物堿供試品溶液。

1.3.2.3 生物堿提取率的計算 于紫外分光光度計上測定各提取物溶液在268 nm處的吸光度，根據線性方程得到總生物堿含量，并按下列公式計算雷公藤藥材中總生物堿的提取率：

總生物堿提取率=總生物堿含量（mg/L）×25 mL根皮粉質量（mg）×1 000×100%。

1.3.3 單因素考察閃式雙水相提取工藝[9-10] 本試驗針對提取時間（60、90、120、150、180 s）、（NH4）2SO4用量（0.2、03、0.4、0.5、0.6 g/mL）、液料比（12 mL ∶1 g、16 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、24 mL ∶1 g、28 mL ∶1 g）、pH值（1、2、3、4、5）4個因素，保持其中3個變量固定不變，對另一個變量進行單因素試驗，以雷公藤總生物堿提取率為指標，確定Box-Behnken響應曲面設計所需的水平范圍。試驗設計如表1所示。endprint

1.3.4 Box-Behnken響應曲面法優(yōu)選提取工藝 在單因素試驗的基礎上，選取提取時間、（NH4）2SO4用量、液料比、pH值對雷公藤總生物堿提取率影響較大的因素，采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken試驗，以總生物堿提取率為指標優(yōu)化提取工藝參數。

2 結果與分析

2.1 單因素考察閃式雙水相提取工藝

2.1.1 提取時間對雷公藤總生物堿提取率的影響 由圖1可知，隨著提取時間的增加，雷公藤總生物堿提取率呈先上升再穩(wěn)定后下降的趨勢。當提取時間為120～150 s時，總生物堿提取率穩(wěn)定在17.3%左右，當繼續(xù)增加提取時間，提取率反而出現下降?？赡苁怯捎陂W提過程中刀頭剪切作用產生的熱隨時間延長使溶液溫度升高，導致生物堿類結構遭到破壞而使總生物堿提取率降低。因此，選擇提取時間為90、120、150 s進行后續(xù)的Box-Behnken響應曲面試驗。

2.1.2 （NH4）2SO4用量對雷公藤總生物堿提取率的影響 由圖2可知，隨著（NH4）2SO4用量的增加，雷公藤總生物堿提取率呈現先上升后下降的趨勢。當（NH4）2SO4用量為 0.4 g/mL 時，總生物堿提取率最高，為16.5%。當繼續(xù)增加（NH4）2SO4用量時，可能破壞了雙水相體系，使得平衡遭到破壞，從而影響提取效率。因此，選擇（NH4）2SO4用量為03、0.4、0.5 g/mL進行后續(xù)的Box-Behnken響應曲面試驗。

2.1.3 液料比對雷公藤總生物堿提取率的影響 由圖3可知，隨著液料比的增加，雷公藤總生物堿提取率先上升后穩(wěn)定。當液料比大于24 mL ∶1 g時，總生物堿提取率穩(wěn)定在17.2%左右。因此，選擇液料比為20 mL ∶1 g、24 mL ∶1 g、28 mL ∶1 g 進行后續(xù)的Box-Behnken響應曲面試驗。

2.1.4 pH值對雷公藤總生物堿提取率的影響 由圖4可知，隨著pH值的增加，雷公藤總生物堿提取率先上升后下降。當pH值為3時，總生物堿提取率最高，為16.9%，主要是由于生物堿在酸性條件下易于溶出。因此，選擇pH值為2、3、4進行后續(xù)的Box-Behnken響應曲面試驗。

2.2 Box-Behnken響應曲面設計優(yōu)化雷公藤總生物堿閃式雙水相提取工藝

在單因素試驗的基礎上，采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken試驗，以總生物堿提取率為指標優(yōu)化提取工藝參數，試驗結果如表2所示。

采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken試驗，對各因素進行擬合，得到多元回歸方程為R提取率=-109.012 5+0.466 8A+47.866 7B+5.053 3C+17406 7D+0.075 0AB-2.708 3×10-3AC+1.666 7×10-3AD+1.187 5BC -0.750 0BD -0.075 0CD-1.738 9×10-3A2-102.750 0B2-0.102 5C2-2427 5D2。

對雷公藤總生物堿提取率的回歸模型進行方差及顯著性分析，結果如表3所示，該模型方程有顯著性影響（P<0.000 1），失擬項不顯著（P=0.423 2>0.05），說明在本試驗條件下，該回歸模型所考察的因素足以反映試驗中各提取工藝參數對總生物堿提取率的影響。判定系數R2=0986 4，R2adj=0.972 8，說明回歸模型與試驗值擬合均較好，可用于雷公藤總生物堿提取率的理論推測和分析，各因素影響力的大小表現為pH值>提取時間>液料比>（NH4）2SO4用量。由F檢驗可知，一次項中提取時間、液料比和pH值對總生物堿提取率具有極顯著影響（P<0.01）；交互項中（NH4）2SO4用量與液料比之間的交互作用對總生物堿提取率具有極顯著影響（P<0.01），提取時間與液料比、液料比與pH值之間的交互作用對提取率具有顯著影響（P<0.05）；在二次項中提取時間、（NH4）2SO4用量、液料比和pH值對總生物堿提取率均具有極顯著影響（P<001）；其他因素影響不顯著。這一結果與圖5中3D響應面圖反映的各因素間交互作用的影響結果相吻合。

由Design-Expert 8.0.6軟件得出雷公藤總生物堿閃式雙水相提取的最佳工藝參數為提取時間125.69 s、（NH4）2SO4用量 0.41 g/mL、液料比24.18 mL ∶1 g、pH值319，雷公藤總生物堿提取率的預測值為18.93%。為便于生產試驗需求，選擇提取時間為126 s、（NH4）2SO4用量為041 g/mL、液料比為24 mL ∶1 g、pH值為3進行驗證試驗，得出的雷公藤總生物堿提取率為（19.01±0.08）%，該值與預測值相近。因此，選取此條件為雷公藤總生物堿閃式雙水相提取的最佳工藝。

3 結論

響應面法已廣泛應用于化工、醫(yī)藥、食品、農林、冶金等各領域，具有試驗次數少、設計簡便等優(yōu)點。雷公藤及其近緣種和同科的其他植物早已有用于防治蔬菜害蟲的記載，其生物堿殺蟲譜廣，對多種害蟲有效，且作用方式復雜，藥效比較快，具有化學農藥速效的特點，而沒有化學農藥的缺點。本研究以具有廣譜殺蟲作用的雷公藤為主要原料，采用Box-Behnken響應曲面設計對其生物堿閃式雙水相提取工藝條件進行優(yōu)化。結果表明，雷公藤總生物堿提取的最佳工藝條件為提取時間 126 s、（NH4）2SO4用量0.41 g/mL、液料比 24 mL ∶1 g、pH值3，此條件下總生物堿提取率為（19.01±0.08）%，該提取工藝穩(wěn)定可行，提取率高，可為雷公藤總生物堿農用殺蟲的應用提供依據。

參考文獻：

[1]饒 毅，魏惠珍，陳銀芳，等. 中藥配伍應用于雷公藤減毒增效的研究進展[J]. 中國中藥雜志，2008，33（14）：1658-1661.endprint

[2]薛 璟，賈曉斌，譚曉斌，等. 雷公藤化學成分及其毒性研究進展[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（5）：726-733.

[3]Brinker A M，Ma J，Lipsky P E，et al. Medicinal chemistry and pharmacology of genus Tripterygium （Celastraceae）[J]. Phytochemistry，2007，68（6）：732-766.

[4]Corson T W，Crews C M. Molecular understanding and modern application of traditional medicines：triumphs and trials[J]. Cell，2007，130（5）：769-774.

[5]羅都強，張 興，馮俊濤. 殺蟲植物雷公藤研究進展[J]. 西北農業(yè)大學學報，2000，28（3）：84-89.

[6]周 琳，馬志卿，馮俊濤，等. 雷公藤生物堿制品對小菜蛾和菜青蟲的控制效果[J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版），2006，34（12）：169-173.

[7]周 琳，馮俊濤，馬志卿，等. 雷公藤總生物堿對粘蟲的生物活性[J]. 植物保護學報，2006，33（4）：401-406.

[8]周 琳. 雷公藤總生物堿對粘蟲幼蟲的毒力及對乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿的影響[J]. 華北農學報，2011，26（1）：215-218.

[9]孟慶舉，劉曉謙，楊 華，等. 閃式提取技術的研究進展[J]. 中國實驗方劑學雜志，2013，19（19）：349-355.

[10]蘇柘僮，劉 英，徐佳麗，等. 應用Box-Behnken設計優(yōu)化地榆皂苷的閃式提取工藝研究[J]. 中草藥，2012，43（3）：501-504.

[11]韓 帥，李淑燕，陳芹芹，等. 響應面分析法優(yōu)化閃式提取胡柚皮中黃酮類化合物工藝[J]. 食品科學，2011，32（10）：52-56.

[12]Karakatsanis A，Liakopoulou-Kyriakides M. Comparison of PEG/fractionated dextran and PEG/industrial grade dextran aqueous two-phase systems for the enzymic hydrolysis of starch[J]. Journal of Food Engineering，2007，80（4）：1213-1217.

[13]江 詠，李曉璽，李 琳，等. 雙水相萃取技術的研究進展及應用[J]. 食品工業(yè)科技，2007，28（10）：235-238.

[14]許可為，朱若凱，蔡 佳，等. 正交試驗優(yōu)選雷公藤藥材生物堿的提取工藝[J]. 江西中醫(yī)藥大學學報，2014，26（4）：64-67. 徐 婧，沈曉蘭，周 捷，等. 生物農藥茶多酚微乳劑的制備及其對稻瘟病菌的抑制效果[J]. 江蘇農業(yè)科學，2017，45（19）：191-195.endprint