降解聯(lián)苯菊酯微生物菌劑的制備及其穩(wěn)定性測(cè)定

胡桂萍　石旭平　管幫富　張國(guó)彪　賀望興　曹揮華　龐博

摘要：為篩選適宜降解聯(lián)苯菊酯降解菌，采用正交試驗(yàn)對(duì)克雷伯氏菌LB-1固體發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行篩選，在篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)LB-1固體發(fā)酵條件、儲(chǔ)藏條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行菌劑穩(wěn)定性測(cè)定。結(jié)果表明，最佳載體配比為豆餅粉 ∶凹凸棒（90 ∶10）+10%麥麩+7%玉米粉+3%茶渣；菌劑LB-1制備的最佳接種量為15%，最適發(fā)酵溫度為 30 ℃，最適發(fā)酵時(shí)間為30 h，最適烘干時(shí)間為36 h，此時(shí)菌劑的有效活菌數(shù)和降解率均最高。同時(shí)菌劑在避光、溫度不高于25 ℃條件下90 d內(nèi)可以保持較高降解活性。聯(lián)苯菊酯微生物菌劑LB-1在優(yōu)化后固體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后降解性和穩(wěn)定性高，可為今后產(chǎn)品的商品化奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：克雷伯氏菌；農(nóng)藥降解；聯(lián)苯菊酯；固體發(fā)酵

中圖分類(lèi)號(hào)： S481+.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）19-0257-04

收稿日期：2016-04-29

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：20151BBA13042）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：201303094-08）。

通信作者：胡桂萍（1985—），女，福建龍巖人，博士研究生，助理研究員，研究方向?yàn)椴枞~副產(chǎn)物資源化開(kāi)發(fā)與利用和茶葉植保。E-mail：hugp__2007@163.com。 目前，以綠色、環(huán)保、有效為宗旨的農(nóng)業(yè)污染微生物修復(fù)，在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展生產(chǎn)中起著越來(lái)越重要的作用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者，對(duì)于農(nóng)業(yè)環(huán)境中的污染物，如重金屬、農(nóng)藥殘留、稀土等開(kāi)展大量微生物修復(fù)研究，已獲得數(shù)百種具有降污效能的功能微生物，對(duì)其作用機(jī)制也已得到廣泛深入的研究和報(bào)道，但是對(duì)其規(guī)?；a(chǎn)的應(yīng)用技術(shù)相關(guān)報(bào)道較少，主要是由于缺乏成熟經(jīng)濟(jì)的發(fā)酵生產(chǎn)工藝。目前，微生物降污劑、農(nóng)殘降解劑、重金屬修復(fù)劑通常采用液體發(fā)酵報(bào)道居多，固體發(fā)酵報(bào)道較少。其中，液體發(fā)酵設(shè)備要求高、周期短、發(fā)酵產(chǎn)物活性強(qiáng)，但成本較高、產(chǎn)品穩(wěn)定性較差、不易保存；而固體發(fā)酵雖產(chǎn)地需求大，發(fā)酵周期長(zhǎng)，但其發(fā)酵材料來(lái)源豐富，可以以大量農(nóng)作物廢棄物作為優(yōu)良的固體培養(yǎng)基，具有生產(chǎn)成本低廉的特點(diǎn)，發(fā)酵產(chǎn)品具有易保存及運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)[1]，因此固體發(fā)酵是未來(lái)重要的生物修復(fù)劑等功能微生物產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)。一般而言，菌劑的穩(wěn)定性包括從制備到使用期間活菌數(shù)的變化速度和程度，這是評(píng)價(jià)菌劑質(zhì)量的重要參數(shù)[2]，而對(duì)于降污劑菌制劑通常則以有效活菌數(shù)和降解效能為衡量發(fā)酵優(yōu)劣的核心指標(biāo)[3]。研究表明，在固體發(fā)酵過(guò)程中，除了溫度、含水量、pH值、傳質(zhì)等因素對(duì)發(fā)酵質(zhì)量關(guān)系密切[4-6]，基質(zhì)特性也對(duì)微生物固體發(fā)酵的質(zhì)量和產(chǎn)量起關(guān)鍵作用[7]。微生物固體發(fā)酵的基質(zhì)組成結(jié)構(gòu)，不僅關(guān)系微生物在發(fā)酵過(guò)程中供給的養(yǎng)分狀況，其顆粒大小等直接影響到微生物發(fā)酵過(guò)程中氧氣的供給速度和水分含量[8]。對(duì)功能微生物發(fā)酵成分和發(fā)酵條件的優(yōu)化不僅可以減少發(fā)酵成本，而且可提高發(fā)酵產(chǎn)物的數(shù)量和質(zhì)量，使得功能微生物的研究不局限于理論研究，加速其應(yīng)用推廣。

微生物降解菌對(duì)環(huán)境中的污染物、有毒有害物質(zhì)均有很好的修復(fù)和改良作用，具有很好的應(yīng)用前景。但是，目前微生物降解菌主要局限于菌種生物特性和降解特性及機(jī)理方面，而在實(shí)踐中應(yīng)用的案例鮮見(jiàn)報(bào)道，缺少切實(shí)可行的發(fā)酵技術(shù)。因此，本研究根據(jù)前期研究結(jié)果獲得聯(lián)苯菊酯降解菌，克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）LB-1[9]，從聯(lián)苯菊酯降解菌株實(shí)際應(yīng)用方面出發(fā)，使用廉價(jià)農(nóng)產(chǎn)品原料和農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物，豆餅粉、麥麩、玉米粉并首次添加茶渣作為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行菌株固體型菌劑制備材料及保存條件進(jìn)行研究，從而為聯(lián)苯菊酯降解菌克雷伯氏菌LB-1產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株LB-1為克雷伯氏菌，保存于江西省蠶桑茶葉研究所微生物菌種庫(kù)。

1.2 藥品和試劑

聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度99.8%（由福建省農(nóng)業(yè)廳農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心提供），丙酮、石油醚、無(wú)水硫酸鈉。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基[10]：10.0 g蛋白胨；5.0 g酵母提取物；10.0 g NaCl，加水定容至1 L，pH值為7.0～7.2。配制相應(yīng)的固體培養(yǎng)基須加入1.5%瓊脂粉。

基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽（MSM）培養(yǎng)基[11-12]：1.5 g Na2HPO4·12H2O，1.5 g KH2PO4，1.0 g NH4NO3，0.2 g MgSO4·7H2O，0.01 g CaCl2·2H2O，0.001 g FeSO4·7H2O，0.050 g酵母提取物，加蒸餾水定容至1 L，pH值7.0～7.2。

1.4 不同混合載體的篩選

將麥麩、鋸末、茶渣、玉米粉、豆餅粉按一定比例（質(zhì)量百分比）配成混合載體，121 ℃滅菌2 h，冷卻后按1 ∶1（體積比）接種LB-1種子液。25 ℃通風(fēng)發(fā)酵培養(yǎng)24 h，通風(fēng)烘干48 h，研成粉末，定時(shí)取樣測(cè)定。結(jié)果用有效菌數(shù)表示，確定最佳混合載體配方組成。

1.5 載體組合優(yōu)化

以凹凸棒土和豆餅粉混合物為載體基料，分別以麥麩、茶渣、玉米粉作為添料按照質(zhì)量比添加到基料中，混合后，121 ℃ 滅菌2 h，冷卻后按照體積比（1 ∶1）的量接種LB-1種子液。25 ℃通風(fēng)發(fā)酵培養(yǎng)36 h，后烘干30 h，研成粉末，定時(shí)取樣測(cè)定。通過(guò)4因素3水平進(jìn)行優(yōu)化載體最佳組合配比（表1），結(jié)果用有效活菌數(shù)和降解率共同表示。

1.6 菌劑制備工藝條件優(yōu)化

以?xún)?yōu)化后的載體組合進(jìn)行菌劑制備最佳工藝條件優(yōu)化，分別通過(guò)單因素試驗(yàn)分析接種量（10%、15%、20%、25%、30%）、發(fā)酵溫度（20、25、30、35、40 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（18、24、30、36、42、48 h）、烘干時(shí)間（10、15、20、25、30 h）對(duì)菌劑有效活菌數(shù)和降解率的影響。endprint

1.7 菌劑儲(chǔ)藏條件的優(yōu)化

比較菌制劑分別在有光（透明玻璃瓶）、黑暗避光（避光棕色玻璃瓶）以及在不同儲(chǔ)藏溫度下放置30 d后的有效活菌數(shù)和降解率。

1.8 菌劑穩(wěn)定性驗(yàn)證

將制備好的菌劑分別在室溫25 ℃條件下保存，分別在處理后10、30、45、60、75、90、105、120 d取樣測(cè)定有效活菌數(shù)和降解率，檢測(cè)菌劑的穩(wěn)定性。

1.9 有效活菌數(shù)檢測(cè)方法

有效活菌數(shù)采用菌落計(jì)數(shù)方法，采用稀釋平板涂布法，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.10 降解率測(cè)定方法

菌劑對(duì)聯(lián)苯菊酯降解率的測(cè)定參照胡桂萍等方法[13]，挑取菌落計(jì)數(shù)后平板上的單菌落在LB培養(yǎng)基中活化24 h，然后用緩沖液清洗，制備菌懸液。然后按照10%的接種量，接入含有50 mg/mL的聯(lián)苯菊酯無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，150 r/min培養(yǎng)96 h后取30 mL添加農(nóng)藥的培養(yǎng)液，分別加入60 mL丙酮，采用超聲波提取法提?。?×15 min）。提取液經(jīng)鋪2層濾紙的布氏漏斗減壓抽濾，將濾液全部移入500 mL分液漏斗，加入60 mL石油醚，搖勻，振蕩30 min，靜置，分層，棄下層溶液，取石油醚層溶液，用20 g無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾至250 mL圓底燒瓶。分液漏斗和無(wú)水硫酸鈉用45 mL石油醚分3次洗滌，洗液并入燒瓶濾液中，50 ℃恒溫濃縮，將濃縮液全部轉(zhuǎn)入 10 mL 刻度試管，并用3 mL石油醚分3次洗滌圓底燒瓶，定容至5 mL，取2 mL經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜注射式過(guò)濾器過(guò)濾，濾液收集于試管中，以供GC檢測(cè)。

氣相色譜條件：Agilent 6890N（μECD檢測(cè)器），毛細(xì)管柱HP-5，5% Phenyl methyl Siloxane，30.0 m×320 μm×0.25 μm。程序升溫：柱箱溫度初始80 ℃，保持1 min，運(yùn)行時(shí)間為1 min，第一階段以10 ℃/min升溫到140 ℃，保持 1.000 min，運(yùn)行時(shí)間為8.000 min，第二階段以20 ℃/min升溫到280 ℃，保持18.000 min，運(yùn)行時(shí)間為33.000 min。進(jìn)樣口溫度220 ℃，檢測(cè)器溫度330 ℃。載氣為高純氮?dú)?20.0 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。在此條件下測(cè)得聯(lián)苯菊酯2個(gè)異構(gòu)體的保留時(shí)間分別為18.304 min。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=26 404x-22 012，確定系數(shù)為R2=0.995。其中x為聯(lián)苯菊酯濃度，y為峰面積。采用外標(biāo)法測(cè)定樣品中聯(lián)苯菊酯的含量，求出其降解率。

聯(lián)苯菊酯降解率=[1-（實(shí)測(cè)殘量/對(duì)照實(shí)測(cè)殘量）]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同混合載體的篩選

由表2可知，不同混合載體的篩選結(jié)果，茶渣和麥麩等6種載體按照排列組合組成A～F共6組混合載體，利用稀釋平板涂布相同條件下測(cè)定有效活菌數(shù)，可見(jiàn)A組合有效活菌數(shù)最高，為42.65億CFU/g，所以采用A組合當(dāng)中的豆餅粉、麥麩、茶渣、玉米粉、凹凸棒作為混合載體的組成成分。

2.2 載體配比對(duì)菌劑制備的影響

試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)4因素3水平設(shè)計(jì)，以L9（34）為正交試驗(yàn)方案，對(duì)選用的載體材料混合用量進(jìn)行了優(yōu)化，以1 ∶1（載體質(zhì)量 ∶菌體質(zhì)量）與發(fā)酵干料均勻混合制成小球狀，避光常溫（25 ℃）放置45 d后測(cè)定活菌生物量和存活率。以k值和R值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，k值大，表示在用一個(gè)因素中該水平對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響大，反則小之。R值大，說(shuō)明該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響大，反之小。結(jié)果（表3）表明，各因素的主次順序?yàn)槎癸灧?∶凹凸棒>麥麩接種量>玉米粉接種量>茶渣接種量，最佳配方為A3B2C3D3，即豆餅粉 ∶凹凸棒（90 ∶10）+10%麥麩+7%玉米粉+3%茶渣。

2.3 菌劑最佳制備工藝條件

單因素分析菌劑制備工藝條件得到，菌劑有效活菌數(shù)隨著接種量增加而上升，菌劑降解率在接種量為15%時(shí)為最高，而大于15%的接種量反而使降解率降低（圖1）。發(fā)酵溫度選擇在30 ℃時(shí)菌體在載體中生長(zhǎng)最旺盛，降解率也最高（圖2），溫度過(guò)高或者過(guò)低均會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)和降解率。發(fā)酵時(shí)間為30 h時(shí)，即可聞到一種甜醋味，此時(shí)的活菌數(shù)最高，降解率也最高（圖3），表明此時(shí)菌體生長(zhǎng)已達(dá)到最大化，發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易導(dǎo)致菌體缺乏營(yíng)養(yǎng)供給而細(xì)胞死亡，發(fā)酵時(shí)間不足則會(huì)使載體的吸菌量不夠，從而導(dǎo)致降解率低。制備好的菌劑選擇烘干時(shí)間36 h后粉碎，得到的菌劑細(xì)度好，活菌數(shù)量最高，降解率最高（圖4），烘干時(shí)間過(guò)短，菌劑的含水量大，不易保存，而烘干時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使菌體大量死亡，降解率變低。因此， 菌劑LB-1制備的最佳接種量為15%， 最適發(fā)酵溫度為30 ℃，最適發(fā)酵時(shí)間為30 h，最適烘干時(shí)間為36 h。

2.4 菌劑儲(chǔ)藏條件優(yōu)化

將制備好的菌劑分別在透明玻璃瓶和避光棕色玻璃瓶中保存，25 ℃ 放置10 d后取出測(cè)定菌劑的有效活菌數(shù)和降解率得到（圖5），透明玻璃瓶下（光照）菌劑的降解率和有效活菌數(shù)明顯低于避光棕色玻璃瓶中菌劑。另外，將制備好的菌劑儲(chǔ)藏在不同溫度下，避光放置30 d后進(jìn)行降解率和有效活菌數(shù)的測(cè)定（圖6），30 d后，儲(chǔ)藏溫度在0 ℃時(shí)，有效活菌數(shù)和降解率為最高；而儲(chǔ)藏溫度為0～25 ℃時(shí)，10 d后菌劑的有效活菌數(shù)高于88.00億CFU/g，降解率保持較高的活性，均高于70%；而當(dāng)儲(chǔ)藏溫度高于25 ℃時(shí)，10 d后菌劑的有效活菌數(shù)和降解率明顯下降。上述試驗(yàn)表明，在避光且儲(chǔ)藏溫度不高于25 ℃條件下，菌劑均可以保持較高的有效活菌數(shù)和降解活性。

2.5 菌劑穩(wěn)定性測(cè)定

菌劑在黑暗、25 ℃下儲(chǔ)藏90 d，菌制劑均可以保持較高的有效活菌數(shù)和較高的降解率（圖7），有效活菌數(shù)均高于 70億CFU/g，降解率高于78%；當(dāng)存放時(shí)間為105 d時(shí)，菌劑的有效活菌數(shù)開(kāi)始下降，降解率也隨著下降；當(dāng)存放時(shí)間為120 d時(shí)，菌劑的有效活菌數(shù)低于60億CFU/g，降解率也更低，約60%。說(shuō)明該菌劑在儲(chǔ)藏時(shí)間不超過(guò)90 d時(shí)，穩(wěn)定性好。endprint

3 討論

固體發(fā)酵技術(shù)是微生物實(shí)現(xiàn)環(huán)境降污和生物修復(fù)的重要工具，而發(fā)酵基質(zhì)是固體發(fā)酵效果影響的重要因素之一，因此選擇生產(chǎn)效率高、功能作用性強(qiáng)的基質(zhì)和載體是微生物固體發(fā)酵的重要前提[13-14]。良好的載體是保證菌株活力的有效措施，對(duì)陽(yáng)光具有吸收和分散作用，可以保護(hù)菌制劑免受紫外光線(xiàn)的照射；對(duì)水分的吸附，可以一定程度上緩沖干燥的環(huán)境條件，適宜載體可以?xún)?yōu)化并穩(wěn)定菌劑發(fā)揮效果的微生態(tài)環(huán)境。

本研究通過(guò)對(duì)現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中常用的發(fā)酵基質(zhì)和吸附劑，豆餅粉[15-16]、凹凸棒[17-18]、麥麩[19]、玉米粉[20]以及添加茶樹(shù)副產(chǎn)物茶渣，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化LB-1固體發(fā)酵基質(zhì)配方，其載體的最佳配比為 ∶豆餅粉 ∶凹凸棒（90 ∶10）+10%麥麩+7%玉米粉+3%茶渣。發(fā)酵基質(zhì)中添加茶渣，一方面是LB-1菌株來(lái)源于茶園環(huán)境中，而添加茶渣可以?xún)?yōu)化發(fā)酵基質(zhì)環(huán)境，使LB-1發(fā)酵環(huán)境與其原生境相仿，提高菌株的生長(zhǎng)量；另一方面茶渣含有纖維素，多糖，鈣、鉀、鎂常見(jiàn)元素，鐵、銅、錳、鋅、硒等微量元素，以及多種維生素和礦物元素，是一種良好的微生物基質(zhì)，有助于發(fā)酵菌株的快速生長(zhǎng)。目前，農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物作為生物發(fā)酵基質(zhì)可以有助于資源綜合開(kāi)發(fā)利用。如羅洋等也利用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物橘皮與麥麩進(jìn)行里氏木霉FS10-C固體發(fā)酵[21]。本研究中發(fā)酵基質(zhì)以凹凸棒作為載體，不僅降低制作成本，制作工藝簡(jiǎn)單，而且極大提高了菌劑的存活率和儲(chǔ)藏期，為L(zhǎng)B-1固體菌劑的實(shí)用生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

除了發(fā)酵基質(zhì)種類(lèi)、基質(zhì)配比外，菌株接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、烘干時(shí)間等均直接影響到固體發(fā)酵產(chǎn)物的數(shù)量和質(zhì)量。本研究通過(guò)對(duì)固體發(fā)酵條件初步分析得到，菌劑 LB-1 制備的最佳接種量為15%，最適發(fā)酵溫度為30 ℃，最適發(fā)酵時(shí)間為30 h，最適烘干時(shí)間為36 h且分別在這些條件下菌劑的有效活菌數(shù)量和降解率均表現(xiàn)較高活性。同時(shí)，對(duì)于儲(chǔ)藏方式進(jìn)行分析得到，制備好的菌制劑放置于避光條件，且溫度不高于25 ℃時(shí)，可以保證菌制劑具有良好的活性。另外，對(duì)菌制劑的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，得到菌制劑在90 d內(nèi)菌劑的質(zhì)量較好，90 d后菌制劑的有效活菌數(shù)和降解率均明顯降低，但這與當(dāng)前微生物肥料或者農(nóng)藥大于6個(gè)月有效期還有差距[8]。這可能與菌制劑的含水量、載體種類(lèi)和含量均有關(guān)系，因此，如何通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化制備工藝和調(diào)整發(fā)酵基質(zhì)配方來(lái)提高菌制劑產(chǎn)品的質(zhì)量和保質(zhì)期是下一步研究重點(diǎn)。

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