李家冬，王弘

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重組蛋白正確折疊與修飾的提高策略

李家冬，王弘

華南農(nóng)業(yè)大學食品學院廣東省食品質(zhì)量與安全重點實驗室畜禽產(chǎn)品精準加工與安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 (廣東)，廣東廣州 510642

隨著分子生物學的研究和不斷發(fā)展，基因表達技術(shù)有了很大的進步。到目前為止，人們已經(jīng)研究出多種表達系統(tǒng)用以生產(chǎn)重組蛋白，但沒有一種表達系統(tǒng)能夠完全滿足當前需要，各種活性肽和蛋白質(zhì)類藥物的需求逐年攀升，不僅對表達量有要求，更需要正確的翻譯后折疊、修飾，使表達蛋白和天然構(gòu)象更加接近，具有更高的活性和穩(wěn)定性。結(jié)合目前的研究工作從表達系統(tǒng)與宿主、分泌表達、共表達、融合表達和培養(yǎng)條件等方面綜述了其對重組蛋白正確折疊以及翻譯后修飾的影響，并提出可能改進的策略。

重組蛋白，表達系統(tǒng)，折疊，翻譯后修飾

在過去的研究中，科學家發(fā)現(xiàn)真核生物蛋白質(zhì)組的復雜性遠勝其基因組，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性和翻譯后修飾使蛋白質(zhì)組的復雜性進一步增加。同一編碼基因的蛋白質(zhì)可能因為折疊后結(jié)構(gòu)的不同而體現(xiàn)出不同的生物活性。同樣，蛋白質(zhì)翻譯后不同化學基團的修飾也是影響其發(fā)揮正常生物學功能的重要原因[1]。因此，在利用基因工程技術(shù)進行各種生物活性蛋白的獲取、改造進程中，如何保證目的蛋白正確折疊結(jié)構(gòu)，如何獲得翻譯后目標蛋白的有效修飾，一直是蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域持續(xù)研究的熱點。本文將從表達系統(tǒng)及宿主的選擇、表達方式以及表達條件等方面，分析其對外源蛋白正確折疊以及翻譯后修飾的影響，并提出可能改進的策略。

1 表達系統(tǒng)及表達宿主的選擇

目前，常用四大表達系統(tǒng)的表達特點已經(jīng)比較明確，因此，當針對外源蛋白的基本特點確定好表達系統(tǒng)后，表達宿主的選擇就顯得十分重要。常用宿主如表1所示。在采用不同的大腸桿菌進行青霉素酰胺酶表達時發(fā)現(xiàn)，以經(jīng)過改造的lon和ompT蛋白酶缺陷菌BL21(DE3)替代普通宿主大腸桿菌ATCC 11105，可溶活性蛋白具有明顯優(yōu)勢，其得到的產(chǎn)物活性是在ATCC 11105菌株中表達時的10倍[2]。當然，表達載體和表達宿主的匹配也需要根據(jù)外源蛋白的特點進行試驗篩選。比方說在避免包涵體的形成[3-4]方面，Suryanarayana等[5]把構(gòu)建的3種質(zhì)粒PA-pPROEXHTa、PA-pQE30和PA-pET32c分別轉(zhuǎn)入不同的宿主DH5α、BL21-DE3、DE3-pLysS、M15和XL-1 blue，最終發(fā)現(xiàn)只有PA-pQE30-XL-1 blue中的重組蛋白以可溶形式存在，其他重組株均有包涵體產(chǎn)生。

表1 常用表達宿主

Table 1 Frequently-used hosts for expression

Expression systemHosts Prokaryotic expression systemE. coli (BL21 series[9], Rosetta 2 series, Origami 2 series), Bacillus subtilis, Streptomyces Yeast expression systemPichia pastoris[10],Saccharomyces cerevisiae Baculovirus expression vector systemHigh Five[11], Sf9[12], Sf21[13], Tn-368, SFSWT-1, TN5B1-4, Ea4, Tn4h Mammalian expression systemCHO[14], 293[15], Myeloma cell[16], COS, MDCK

另外，二硫鍵的形成是某些外源蛋白的正確折疊和活性所必需時[6-8]，能促進二硫鍵形成的宿主菌，也可提高活性蛋白的表達。K-12衍生菌的Origami 2系列屬于硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase, trxB) 和谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase, gor) 兩條主要還原途徑雙突變菌株，可顯著提高細胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率，促進活性蛋白的可溶性表達。Nikolaivits等[17]在BL21和Origami 2中分別表達角質(zhì)酶，發(fā)現(xiàn)在Origami 2細胞質(zhì)中表達的產(chǎn)物熱穩(wěn)定性比BL21細胞中高73%。同樣地，Xu等[8]在表達南極擬酵母lipase B (Pal B) 時也發(fā)現(xiàn)在Origami B(DE3) 中的重組脂肪酶活性是BL21(DE3) 中的3倍，其原因可能就是由于Origami細胞質(zhì)中的氧化環(huán)境更利于二硫鍵的形成，促進了表達產(chǎn)物正確折疊。與此同時，利用定向進化，通過分離分子伴侶或折疊因子的變異體，可以實現(xiàn)宿主細胞對外源重組蛋白的特異性折疊。該策略被用于分離大腸桿菌GroEL突變株，并證明其對綠色熒光蛋白的折疊效率提高了8倍[18]。

不同的昆蟲細胞完成蛋白糖基化的能力不同。Sf9細胞一般只能產(chǎn)生高甘露糖或寡甘露糖型糖蛋白，High five細胞則比Sf9細胞更為復雜，甚至能完成一些末端唾液酸化[19-20]。TN5B1-4、Ea4和Tn4h細胞能產(chǎn)生復雜的半乳糖型多糖[21-22]。

另外，對昆蟲細胞進行糖基化改造，將哺乳動物糖基轉(zhuǎn)移酶基因插入野生桿狀病毒載體中，使昆蟲細胞能穩(wěn)定表達哺乳動物糖基化修飾酶類，已成為新的提高昆蟲表達系統(tǒng)糖蛋白表達能力的有效手段。Juliant等[23]將 N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(GNT-Ⅰ)基因、GNT-Ⅱ基因和β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因(β-1,4-GalTⅠ)添加至桿狀病毒基因組中，成功得到了具有半乳糖基化的抗體。此外，也有研究者通過構(gòu)建攜帶哺乳動物表達原件的重組病毒，使其能夠在哺乳動物細胞中表達[24]。

常用的幾種用于表達重組蛋白的哺乳動物細胞株有CHO細胞、COS細胞和293細胞等。不同的細胞對重組蛋白的修飾可能會稍有差別，如人CHO細胞在表達人白血病抑制因子時會出現(xiàn)N端氨基酸缺失，表達人組織因子旁路抑制劑時，會出現(xiàn)C端氨基酸的缺失，而這些情況在另外的一些細胞株中并未出現(xiàn)[25-26]。

2 分泌表達

大腸桿菌細胞質(zhì)的還原性環(huán)境可能因為抑制蛋白二硫鍵的形成，進而對外源表達蛋白的正確折疊和活性造成不利影響[6]。除了采用如前所述的改造宿主方式，為促進分泌型外源蛋白的可溶表達和正確折疊，可以嘗試將被表達的蛋白質(zhì)分泌到周質(zhì)腔或胞外，以減少還原性環(huán)境造成的不利影響[27]。當前體肽通過翻譯后Sec途徑進行運輸時，信號識別粒子 (SRP) 依賴途徑被證明有助于促進胞內(nèi)易聚集前體肽的分泌，避免包涵體的形成[28]。也有研究表明，細胞被膜上的Dsb蛋白酶家族可以促進蛋白的正確折疊[7]，從而提高外源蛋白的活性、穩(wěn)定性和可溶性[29]。許多因素，包括信號肽的類型、外源蛋白的大小及氨基酸組成等都會對蛋白轉(zhuǎn)運造成影響。研究表明，大腸桿菌分泌蛋白主要是分泌至周質(zhì)腔，這些蛋白的N端一般含有一段富含疏水氨基酸殘基的信號肽，能幫助蛋白穿過細胞膜進入周質(zhì)腔，信號肽被信號肽酶切除后，產(chǎn)生成熟的蛋白質(zhì)[30]。目前使用比較廣泛的有周質(zhì)腔蛋白pel B、外膜蛋白omp A和omp F、枯草芽胞桿菌木聚糖酶等多種天然分泌蛋白的信號肽。Cui等[31]用放線菌信號肽Kp-SP促進地衣桿菌α淀粉酶的分泌表達，得到的α淀粉酶活性是未分泌表達的10倍。同樣地，Mohajeri等[32]利用pelB使人內(nèi)皮抑素直接分泌到BL21(DE3) 周質(zhì)腔中，得到的可溶蛋白含量占細胞總蛋白的35%，避免了大量包涵體的產(chǎn)生。此外，不同的信號肽分泌能力不同，要根據(jù)目的蛋白的不同進行試驗篩選。Zhao等[9]在BL21(DE3) 中分別過表達由TorA和PelB引導的GadB，發(fā)現(xiàn)TorA促GadB分泌表達的效果比PelB好，得到的GadB活性更高。

真核細胞的分泌途徑是一個涉及多細胞器的復雜系統(tǒng)，參與前體肽的運輸和翻譯后修飾，因此，提高其分泌途徑中的各個環(huán)節(jié)能在一定程度上促進其翻譯后修飾，如N端信號肽能夠引導前體肽到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，使其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進行修飾，而促進前體肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的轉(zhuǎn)移對于成熟蛋白的形成具有很大的幫助[33]。

畢赤酵母有兩類信號肽可供選擇：外源蛋白自身具有的信號肽和來源于酵母的信號肽。外源信號肽引導表達的重組蛋白容易降解，而且效率較低，因此通常選擇酵母本身的分泌信號肽來指導外源蛋白的分泌，主要有蔗糖酶 (SUCZ)、酸性磷酸脂酶 (PHO1)、Killer毒素和α因子 (MFα1) 等[34]。同樣地，針對不同外源蛋白，不同信號肽其分泌能力不同。Zhang等[35]在畢赤酵母中分別用α因子和天然信號肽引導黑曲霉QU10的果糖基轉(zhuǎn)移酶分泌表達，3 d后發(fā)現(xiàn)α因子引導表達的產(chǎn)物活性是天然信號肽的6倍。

3 共表達

一般情況下，由于強啟動子的調(diào)控，外源蛋白在大腸桿菌中的表達水平往往會比較高，而宿主自身的促折疊因子無法滿足外源蛋白正確折疊的需要時，易形成包涵體。分子伴侶本身不是功能蛋白的組成部分，但是與外源蛋白共表達時能夠阻止分子內(nèi)和分子間不正確的相互作用，進而幫助蛋白質(zhì)正確折疊，在一定程度上能克服包涵體的形成[36]。

目前大腸桿菌表達系統(tǒng)中用于共表達以促進外源蛋白正確折疊并增加其可溶性的輔助蛋白主要有 Gro EL/ES、Dna K/Dna J/Grp E、硫氧還蛋白(Thioredoxin)、折疊酶(Foldase) 和引發(fā)因子(Trigger factor) 等，應根據(jù)外源蛋白的特點選擇不同的分子伴侶或折疊酶。例如在大腸桿菌中共表達Gro EL/ES能增加某些蛋白(人乙醛脫氫酶3A1[37]、腈水合酶[38]、人乳頭瘤病毒衣殼蛋白L1[39]和磷酸合成酶[40]等) 的可溶性，卻對其他一些蛋白(人酸性富含胱氨酸分泌型蛋白[41]、噬菌體P22結(jié)構(gòu)蛋白[42]) 無增溶效果。同樣地，Xu等[8]在大腸桿菌BL21(DE3) 和Origami B(DE3)中共表達Pal B (Trigger factor, Gro EL/ES, Dna K/J-Grp E和Dsb A)，發(fā)現(xiàn)只有共表達Dsb A時才能促進表達產(chǎn)物的活性。此外，當包涵體在周質(zhì)腔中形成時，共表達周質(zhì)腔蛋白酶可以提高周質(zhì)腔對外源蛋白的加工能力，促進外源蛋白折疊，減少包涵體的形成[27,43]。

二硫鍵外源蛋白正確折疊的限制因素之一就是二硫鍵的形成，而分子伴侶如PDI等能很好幫助二硫鍵的形成，從而防止蛋白聚合、減緩折疊速率等[44-45]。如Inan等[46]用畢赤酵母表達重組Na-ASP1蛋白(含20個半胱氨酸) 時發(fā)現(xiàn)，Na-ASP1基因與PDI基因共表達時可減少不可溶Na-ASP1的形成，且明顯提高其分泌水平，說明Na-ASP1在胞內(nèi)的折疊過程和可溶表達得到提高[47-48]。如果將幾種促折疊蛋白分子同時共表達，有可能獲得比單獨表達一種時更好的效果。Chen等[49]在畢赤酵母中將灰蓋鬼傘過氧化物酶與Erol-PDI共表達，得到的產(chǎn)物活性比單一共表達Erol或PDI高很多倍。

在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中仍然可以通過共表達提高外源蛋白的折疊修飾和可溶表達。細胞質(zhì)分子伴侶Hsp70不僅能促進胞內(nèi)前體肽的易位，而且能夠防止胞內(nèi)非特異性的分子內(nèi)疏水作用從而抑制前體肽的聚集，使前體肽能夠順利進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行翻譯后加工[33]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶BiP是一種免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，能幫助前體肽進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行修飾，從而促進其可溶性和分泌水平[50]。

哺乳動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)固有蛋白在蛋白的折疊和分泌進程中起到重要的作用，許多研究證實，提高細胞內(nèi)翻譯后修飾過程中相關(guān)蛋白的表達，如PDI、XBP-1、GRP78/BIP、ERp57、GRP94、CRT、CNX、GADD34、ATF4和CypB等，有助于提高外源蛋白的折疊修飾[51-52]。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或者不正確折疊蛋白積累時，會誘導XBP-1的生成，從而促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶的產(chǎn)生，提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體對蛋白的加工能力，進而提高外源蛋白的折疊修飾和分泌表達水平[16,53]。此外，Haredy等[14]發(fā)現(xiàn)在CHO細胞中過表達未折疊蛋白反應中的中心因子ATF4可以使IgG表達提高2.4倍，就是由于ATF4的過表達使外源蛋白在胞內(nèi)的折疊修飾得到增強，造成其表達量的提高。

4 融合表達

親和標簽多用于重組蛋白的檢測和純化，除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)，當親和標簽以融合蛋白的形式與外源蛋白一起表達時，能夠發(fā)揮分子伴侶的作用，促進外源蛋白折疊，提高外源蛋白的可溶性和穩(wěn)定性。常用的多聚組氨酸與外源蛋白融合后能給外源蛋白的分離純化帶來極大便利，但組氨酸的數(shù)目與融合部位對融合蛋白的表達水平及其溶解性有顯著影響[54]。其他可供選擇的融合蛋白還有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、泛素蛋白、DsbA和麥芽糖結(jié)合蛋白 (MBP) 等。

有研究表明，胞內(nèi)抗體的穩(wěn)定性比親和性更能影響其性能[55]，由于胞內(nèi)還原性環(huán)境不利于二硫鍵的形成，導致scFV不穩(wěn)定，異源表達scFV時，為了提高其穩(wěn)定性，很多研究者采用融合表達的方式。Bach等[56]在大腸桿菌中表達多種scFV，發(fā)現(xiàn)即使選用強啟動子，在trxB-菌株中表達，scFV的可溶表達水平依然很低，主要以包涵體形式存在，當在scFV的C端融合MBP時，MBP-scFvs的可溶性和穩(wěn)定性有了很大提高，且具有活性。Shaki-Loewenstein等在哺乳動物細胞內(nèi)表達scFV時也得到相同的結(jié) 論[57]。Xu等[8]把7種N端標簽 (GST, MBP, NusA, TRX, T7PK, Skp和Dsb A) 和PalB融合表達時，發(fā)現(xiàn)MBP和T7PK能顯著提高PalB的可溶性，而DsbA不僅能顯著提高表達產(chǎn)物可溶性，也提高了其活性。均說明了融合表達是一種促外源蛋白折疊的有效方法。

不同融合蛋白的促折疊效果不同，D?lken等[58]發(fā)現(xiàn)未融合表達時，畢赤酵母中人顆粒酶B (GrB) 大部分滯留在胞內(nèi)，形成不正確的折疊，當融合表達時，GrB能夠有效分泌至胞外，形成正確的折疊，且MBP的促折疊效果比GST要強。同樣地，Wang等[59]在畢赤酵母中構(gòu)建了4種蛋白融合MPHs：CHBD-MPH、GST-MPH、MBP-MPH和CBD-MPH，發(fā)現(xiàn)CHBD-MPH和GST-MPH表達產(chǎn)物的活性是未融合蛋白的13.6倍和11.9倍，而與CBD和MBP融合表達的MPH活性沒有明顯變化。

5 培養(yǎng)條件的影響

表達系統(tǒng)能夠成功得到所需外源蛋白的最重要的條件之一就是合適的培養(yǎng)條件，這些條件主要包括培養(yǎng)基成分、溫度、pH、誘導條件以及培養(yǎng)時間等。在培養(yǎng)基中添加CaCl2和谷氨酸可以提高某些外源蛋白的活性[60]，此外，Chhetri等[61]也發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌培養(yǎng)基中加入3%乙醇再進行ITPG誘導表達時候，可以提高外源蛋白表達量和穩(wěn)定性。

溫度對大腸桿菌的生長代謝影響很大。不少研究認為，低溫條件下蛋白質(zhì)合成的速率降低，疏水作用降低，與溫度相關(guān)的分子伴侶過量表達，多肽折疊的動力學改變，從而使具有正確折疊的蛋白含量增加[62]，同時，產(chǎn)生的前蛋白能夠及時運輸?shù)街苜|(zhì)腔或培養(yǎng)基中，以免聚集在內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，形成包涵體堵塞通道，阻礙蛋白的分泌[63]，但是溫度過低則會影響細胞膜的流動性，不利于胞內(nèi)蛋白的運輸。大腸桿菌的最適生長溫度為37 ℃，在該溫度下，雖然細胞膜流動性和蛋白合成速率有所增加，但胞內(nèi)前蛋白過多的堆積使包涵體形成增多，進一步影響細胞生理和蛋白運輸[64]。Ujiie等[65]在BL21(DE3)中表達南極假絲酵母lipase B (CALB)時，發(fā)現(xiàn)在37 ℃和30 ℃下，CALB僅以包涵體形式存在，當降低溫度到20 ℃時，活性蛋白主要以可溶形式分泌至胞外。

桿狀病毒表達系統(tǒng)中，培養(yǎng)基中血清的有無對重組蛋白的表達具有很大的影響。很多研究對在無血清和有血清條件下，病毒的生長和重組蛋白的表達進行了比較[66-67]，Joshi等[19]報道，血清對于外源蛋白的復雜糖基化具有促進作用。

6 結(jié)語

目前，活性蛋白尤其是真核活性蛋白在哺乳動物表達系統(tǒng)里面成功率較高，表達的重組蛋白最接近天然構(gòu)象，但是其不足也同樣明顯，如表達量低、成本高、周期長等。所以研究者一般首先希望能通過大腸桿菌表達系統(tǒng)進行表達，因為其成本低廉、培養(yǎng)操作簡便等優(yōu)勢是顯而易見的。由于酵母表達系統(tǒng)兼具兩者部分優(yōu)勢，既有一定的翻譯后修飾，同時也操作簡便、成本低，所以作者認為可以優(yōu)先嘗試酵母表達系統(tǒng)。構(gòu)建合適的表達載體——啟動子、信號肽、共表達序列等都是需要考慮的因素，并可以同時采用多種策略以實現(xiàn)累加效應加強促分泌折疊作用，如同時添加多個共表達元件、分泌表達和共表達同時進行等，優(yōu)化表達條件，進行表達。Su等[68]發(fā)現(xiàn)，當木聚糖酶在大腸桿菌中單獨異源表達時，即使存在信號肽pelB的引導，重組酶主要以包涵體形式存在，當其與角質(zhì)酶共表達時，重組酶也是存在于胞內(nèi)，且以包涵體形式存在，而當木聚糖酶與角質(zhì)酶和信號肽pelB一起共表達時，在pelB和角質(zhì)酶的雙重作用下，重組酶主要分泌到胞外培養(yǎng)基中且具有活性。本課題組將改造后的與來源于釀酒酵母的錨固蛋白表達載體pPIC9K (具α因子信號肽)，在畢赤酵母GS115表面成功展示了BmAChE，表達產(chǎn)物具有良好活性[69]，隨后又把Bmace與二硫鍵異構(gòu)酶共表達，所得BmAChE的表達量和活性更高。

外源蛋白的表達是一個復雜的過程，不同的外源蛋白，其表達過程也不一樣，任何一個環(huán)節(jié)都可能會對活性蛋白的表達產(chǎn)生不良影響，如何提高外源蛋白的翻譯后修飾和折疊是研究者面臨的一大難題，目前沒有一種表達方式是完全通用、適合所有外源蛋白表達、滿足人們的所有需求。因此，需要在研究過程中積累經(jīng)驗，及時汲取相關(guān)領(lǐng)域最新進展，找出關(guān)鍵因素，“對癥下藥”。

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(本文責編 陳宏宇)

Strategies to improve the folding and modification of recombinant proteins: a review

Jiadong Li, and Hong Wang

National-Local Joint Engineering Research Center for Processing and Safety Control of Livestock and Poultry Products (Guangdong), Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety, College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China

Gene expression technology has made great progress with the continuous developments and researches of molecular biology. Though many systems to produce recombinant proteins have been studied, none of them is available so far to satisfy the needs completely. With the increasing demands of bioactive peptides and protein drugs, expression quantity and correct posttranslational folding and modifications are also needed under the circumstance which can make proteins more close to native conformation and higher activity and stability. Based on our previous work, we summarized the factors affecting the folding and modifications of recombinant proteins correctly from five aspects, including expression system and hosts, secretory expression, coexpression, fusion expression, and the culture conditions, as well as improvement strategies.

recombinant proteins, expression systems, folding, posttranslational modification

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31271866), Province Natural Science Foundation of Guangdong Province (No. 2014A030311043), Science and Technology Planning Project of Guangdong Province (No. 2014A050503059), Science and Technology Planning Project of Guangzhou (No. 2014J4100185).

國家自然科學基金 (No. 31271866)，廣東省自然科學基金 (No. 2014A030311043)，廣東省科技計劃項目 (No. 2014A050503059)，廣州市科技計劃項目 (No. 2014J4100185) 資助。

September 5, 2016; Accepted: December 27, 2016

Hong Wang. Tel: +86-20-85288279; Fax: +86-20-85280270; E-mail: gzwhongd@163.com