高效液相色譜法檢查單硝酸異山梨酯緩釋片中的有關物質

高永寶,康雨佳,劉 暢，陳 燁

(1.遼寧省藥品認證中心,遼寧 沈陽 110007; 2.遼寧大學藥學院 遼寧省新藥研發(fā)重點實驗室,遼寧 沈陽 110036)

高效液相色譜法檢查單硝酸異山梨酯緩釋片中的有關物質

高永寶1,康雨佳2*,劉 暢2，陳 燁2

(1.遼寧省藥品認證中心,遼寧 沈陽 110007; 2.遼寧大學藥學院 遼寧省新藥研發(fā)重點實驗室,遼寧 沈陽 110036)

目的對中國藥典2015版第二部中單硝酸異山梨酯緩釋片有關物質檢查進行方法學驗證.方法采用高效液相色譜法,色譜柱:Diamonsil ODS- C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-水(25∶75);檢測波長:210 nm;柱溫:40 ℃.結果流動相不干擾測定.單硝酸異山梨酯、2-單硝酸異山梨酯和硝酸異山梨酯混合液在濃度范圍1.5～12.5 μg/mL內呈良好的線性相關性.方法精密度、重現性、專屬性、樣品溶液穩(wěn)定性均良好.主藥峰與雜質峰達到完全分離.結論中國藥典2015版第二部提出的方法簡便、準確、專屬性、重現性良好,可用于單硝酸異山梨酯緩釋片有關物質的檢查.

單硝酸異山梨酯;高效液相色譜;有關物質

0 引言

單硝酸異山梨酯(Isosorbide 5-mononitrate,5-ISMN)為抗心肌缺血藥硝酸異山梨酯(ISDN)體內主要活性代謝產物[1],其生物利用度高,個體差異小,特別適用于冠心病心絞痛的防治,療效優(yōu)于硝酸異山梨酯(ISDN)及硝酸甘油(GTN)緩釋劑,為新一代硝酸酯類藥[2].單硝酸異山梨酯用途廣泛,毒副作用小,療效肯定.通過擴張靜脈血管,降低前負荷,舒張動脈血管,降低左心室后負荷,從而降低心肌耗氧量.其可擴張冠脈血管,降低左室充盈壓,增加心內膜供血,改善左室順應性[3].單硝酸異山梨酯是目前臨床上治療各型心絞痛的首選藥物,特別是對不穩(wěn)定型心絞痛,治療效果更佳.在治療過程中,該藥作用時間長,無首過效應,不易產生耐藥性,不良反應少[4].經過多年的開發(fā)和研究,檢索中國食品藥品監(jiān)督管理總局網站,目前國內有注射劑、普通片劑、緩釋片,緩釋膠囊,普通膠囊、膠丸、滴丸、噴霧劑等多種劑型.美國藥典[5]、歐洲藥典[6]、英國藥典[7]和中國藥典[8]均收載了單硝酸異山梨酯的質量標準.故選用中國藥典2015版第二部中的單硝酸異山梨酯緩釋片有關物質檢測方法,本文對該方法進行方法學驗證并測定單硝酸異山梨酯緩釋片中有關物質的含量.

1 實驗材料

1.1 儀器

LC-10AT高效液相色譜儀(日本島津)、SPD-10Avp 檢測器、N2000色譜工作站、電子分析天平(德國梅特勒)、PHS-2F 數字pH計(上海雷磁)、UV-1750紫外分光光度計(日本島津).

1.2 試劑

單硝酸異山梨酯對照品、2-單硝酸異山梨酯對照品、硝酸異山梨酯對照品、單硝酸異山梨酯緩釋片(自制)、乙腈為色譜純、重蒸餾水.

2 實驗方法

2.1 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇-水(V甲醇∶V水=25∶75)為流動相;柱溫:40 ℃;流速:1.0 mL/min;檢測波長:254 nm.

2.2 試驗溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取本品20片,研細,精密稱取適量(約相當于單硝酸異山梨酯50 mg),精密稱定,置50 mL量瓶中,加流動相約35 mL,振搖約20 min,使單硝酸異山梨酯溶解,用流動相稀釋至刻度,搖勻,離心,取上清液,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液.

2.2.2 貯備溶液的制備

精密稱定單硝酸異山梨酯、2-單硝酸異山梨酯、硝酸異山梨酯對照品各10 mg,置100 mL量瓶中,加流動相振搖,使單硝酸異山梨酯、2-單硝酸異山梨酯、硝酸異山梨酯溶解并定量稀釋至刻度,制得每1 mL中各約含0.1 mg的混合溶液,作為貯備溶液.

2.2.3 對照品溶液的制備

精密量取貯備溶液0.5 mL于10 mL量瓶中,加流動相稀釋制成每1 mL中各約含5 μg的混合溶液作為對照品溶液

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

單硝酸異山梨酯峰的保留時間為4.9 min,,理論塔板數按單硝酸異山梨酯峰計算,應不低于2 000.

2.3.1 空白對照試驗

取不含主藥的流動相溶液20 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖.

2.3.2 定量限

精密稱取單硝酸異山梨酯、2-單硝酸異山梨酯、硝酸異山梨酯對照品適量,逐步稀釋,用流動相分別制成12 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL溶液,吸取上述溶液20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖.

2.3.3 檢測限

精密量取上述單硝酸異山梨酯溶液、2-單硝酸異山梨酯溶液、硝酸異山梨酯溶液適量,逐步稀釋,用流動相分別制成4 ng/mL、5 ng/mL、6 ng/mL溶液,吸取上述溶液20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖.

2.3.4 破壞試驗

取供試品適量,分別照下述方法進行極端條件下的色譜分離試驗:

①熱破壞(加熱至藥物部分變色);②酸破壞(加適量1 mol/L鹽酸溶液,水浴加熱1.5 h);③堿破壞(加適量1 mol/L氫氧化鈉溶液,水浴加熱1.5 h);④氧化破壞(加適量30%過氧化氫溶液,放置1 h);⑤強光破壞(強光下照射2 h).取樣品①～⑤(酸和堿破壞樣品需先調節(jié)pH為7),加流動相稀釋,濾過,取續(xù)濾液20 μL注入色譜儀.所得各色譜圖中各新生降解產物峰均能與單硝酸異山梨酯主峰良好分離.

3 結果與討論

3.1 系統(tǒng)適應性試驗

3.1.1 色譜柱選擇

選用常用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱,由圖1可以看出在該系統(tǒng)中保留時間為4.9 min左右,確定選用該色譜柱.

3.1.2 檢測波長的選擇

取本品適量,用水制成1 mL中約含量20 μg的溶液,由圖2可以看出，在190～500 nm波長內進行掃描,結果本品在254 nm有較大吸收,參照單硝酸異山梨酯質量標準,確定本品檢測波長為254 nm.

圖1 供試品保留時間

圖2 供試品紫外最大吸收波長

圖3 空白對照色譜峰

3.1.3 空白對照試驗

由圖3可以看出，空白組結果除溶劑峰外,無任何色譜峰,表明流動相不干擾測定,方法專屬性良好.

3.1.4 定量限

由圖4可以看出，其信噪比S/N均約等于10.故單硝酸異山梨酯的定量限為12 ng,2-單硝酸異山梨酯的定量限為15 ng,硝酸異山梨酯的定量限為20 ng.

圖4 單硝酸異山梨酯的定量限

3.1.5 檢測限

由圖5可以看出，其信噪比S/N均約等于3.故單硝酸異山梨酯的檢出限為4 ng,2-單硝酸異山梨酯的檢出限為5 ng,硝酸異山梨酯的檢出限為6 ng.

圖5 單硝酸異山梨酯的檢測限

3.1.6 破壞性試驗

由圖6可知，所得各色譜圖中各新生降解產物峰均能與單硝酸異山梨酯主峰良好分離.

3.2 含量測定

3.2.1 含量測定法

精密量取“2.2.1”項下供試品溶液,照高效液相色譜法(中國藥典2015年版四部通則0512)測定[9].

3.2.2 線性試驗

精密量取“2.2.2”項下貯備溶液0.15、0.3、0.5、0.75、1.0、1.25 mL于10 mL量瓶中用流動相分別稀釋至濃度約為1.5、3、5、7.5、10、12.5 μg/mL的溶液.精密量取20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖.線性相關性試驗結果:由圖7可以看出，單硝酸異山梨酯、2-單硝酸異山梨酯和硝酸異山梨酯混合液在濃度范圍1.5 μg/mL～12.5 μg/mL內呈良好的線性相關性.

圖6 破壞性試驗分離效果

圖7 線性試驗

3.2.3 精密度試驗

精密吸取“2.2.3”項下對照品溶液20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖,重復測定7次,結果單硝酸異山梨酯、2-單硝酸異山梨酯、硝酸異山梨酯峰面積RSD值分別為0.46%,0.56%,0.74%(n=7).

3.2.4 重現性試驗

精密量取“2.2.1”項下供試品溶液20μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖.連續(xù)測定6次,計算峰面積RSD.重現性試驗的RSD的值為0.74%<2.0%,說明該方法的重現性符合定量測定的要求.

3.2.5 有關物質穩(wěn)定性試驗

取“2.2.3”項下對照品溶液室溫下放置,于0、4、8、12、16、20、24 h后分別測定,結果單硝酸異山梨酯、2-單硝酸異山梨酯、硝酸異山梨酯的峰面積RSD值分別為1.33%,1.15%,1.21%.結果表明溶液在24小時內相對偏差小于2%,證明該溶液在24小時內是穩(wěn)定的.

3.2.6 有關物質試驗

取本品的細粉適量(約相當于單硝酸異山梨酯50 mg),精密稱定,置50 mL量瓶中,加流動相約35 mL,振搖約20 min,用流動相稀釋至刻度,搖勻,離心,取上清液,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液;另取硝酸異山梨酯對照品和2-單硝酸異山梨酯對照品,精密稱定,加流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL中各約含5 μg的混合溶液作為對照品溶液.照高效液相色譜法(中國藥典2015年版四部通則0512)測定,供試品溶液的色譜圖中,如有與硝酸異山梨酯峰和2-單硝酸異山梨酯峰保留時間一致的色譜峰,按外標法以峰面積計算,均不得過單硝酸異山梨酯標示量的0.5%.

結果,由圖8可以看出在有關物質檢查色譜圖中,主成分峰保留時間為6.8 min,硝酸異山梨酯保留時間為6.0 min,2-單硝酸異山梨酯保留時間為4.1 min,因而主成分峰與雜質峰達到了完全分離.

圖8 單硝酸異山梨酯有關物質保留時間

3.3 討論

本文對藥典提出的色譜方法進行全面的方法學驗證,結果表明此方法簡便、準確、專屬性、復現性等良好,可用于單硝酸異山梨酯緩釋片有關物質的檢測.

[1] Smith RV et al.microchemical J,1978,23:185.

[2] 劉兆平,劉亞玲,吳葆杰.新一代硝酸酯類藥單硝酸異山梨酯[J].世界臨床藥物,1990(4):218-221.

[3] 彭芳,陳植和,王德成.單硝酸異山梨酯藥動學和藥效學特點及機制探討[J].大理學院學報:醫(yī)學版,1999(3):75-77.

[4] 張曉霞,李妍,楊慧茹.單硝酸異山梨酯治療心絞痛不良反應的護理[J].中華全科醫(yī)學,2007,5(4):376-376.

[5] USP36-NF31 4005,4007,4009.

[6] European Directorate For the Quality of Medicines.EP 8.0:2542.

[7] British Pharmacopoeia 2013 Volume I & II Medicinal and Pharmaceutical Substances.

[8] 國家藥典委員會.中國藥典2015年版第二部[S].2015:692-693.

[9] 國家藥典委員會.中國藥典(四部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

(責任編輯李超)

DeterminetheRelatedSubstancesofIsosorbideMononitrateSustainedReleaseTabletbyHPLC

GAO Yong-bao1,KANG Yu-jia2*,LIU Chang2,CHEN Ye2

(1.CertificationCenterforDrugs,Liaoning,Shenyang110007,China; 2.DepartmentofPharmacyofLiaoningUniversity,NewDrugR&DKeyLaboratoryofLiaoningProvince,Shenyang110036,China)

Objective：Chinese Pharmacopoeia 2015 edition of the second part isosorbidedinitrate sustained-release tablets were related substances method validation .MethodsThe HPLC method was carried out,the column:Diamonsil ODS-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm);mobile phase:methanol-water (25∶75);detection wavelength:210 nm.ResultsThe mobile phase does not interfere with the determination.Isosorbidedinitrate,2 isosorbidedinitrate and isosorbidedinitrate mixture in a concentration range of 1.5 ～ 12.5 μg/mL showed a good linear correlation.The method precision,reproducibility,specificity,sample solution stability were good.Main drug peak and impurity peaks completely separated.ConclusionChinese Pharmacopoeia 2015 edition of the second portion of the proposed method is simple,accurate,specific,reproducibility,and can be used for single-isosorbidemononitrate sustained release tablets checks related substances.

IsosorbideMononitrate;HPLC;related substances

2017-01-23

高永寶(1966-)，男，高級工程師，從事原料藥新藥及其合成工藝研發(fā)、質量研究、GMP.

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康雨佳(1992-)，女，遼寧大學2014級藥物化學在讀碩士，從事藥劑藥分方面工作，E-mail：1220535228@qq.com.

R 917

A

1000-5846(2017)03-0251-06