李蒙蒙, 崔麗潔, 錢忠英, 開國銀, 潘靜嫻

(上海師范大學 生命與科學學院 植物種質資源開發(fā)協同創(chuàng)新中心,上海 200234)

DNA分子標記在不結球白菜遺傳育種中的應用進展

李蒙蒙, 崔麗潔, 錢忠英, 開國銀*, 潘靜嫻*

(上海師范大學 生命與科學學院 植物種質資源開發(fā)協同創(chuàng)新中心,上海 200234)

概述了分子標記的分類和特點,以及在不結球白菜遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、數量性狀座位(quantitative trait locus,QTLs)定位和分子標記輔助育種等領域中的最新研究進展.總結了目前分子標記在不結球白菜遺傳改良和輔助育種中存在的若干問題,并對該研究領域提出了一些展望和建議.

分子標記; 遺傳育種; 不結球白菜

不結球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensisMakino),為十字花科(Brassicaceae)蕓薹屬(Brassica)蕓薹種(B.campestiris)蔬菜.原產于中國的江淮流域,在長江中下游及南方地區(qū)廣泛栽培,常年在蔬菜供應中占較大比重.由于其適應性強,生長周期短,營養(yǎng)豐富等特點,近幾年,不結球白菜逐漸被引種至中國北方,并開始在東南亞及歐美地區(qū)廣泛栽培,逐漸成為一種全球性的蔬菜[1].隨著市場需求的不斷增大,中國育種學家對不結球白菜進行了大量的遺傳基礎研究,并培育了許多具有優(yōu)良性狀的新品種[2-3].傳統的選育工作主要以農作物的表現型作為選育指標,通過對雜交后代的優(yōu)化選擇,最終得到能穩(wěn)定遺傳優(yōu)良性狀的個體.因此,傳統的選育方法并不能排除環(huán)境因素的影響,給選育工作帶來了許多不確定的因素.分子標記則是直接檢測DNA序列的多態(tài)性,避免了外界環(huán)境對表型性狀的影響,提升了遺傳分析及育種工作的準確性.除此之外,分子標記遍布整個基因組,多態(tài)性高,且由于其大多分布于非編碼區(qū),不會影響目的性狀的表達,所以在農作物的遺傳育種研究中發(fā)揮著不可替代的作用.

本文作者重點闡述了分子標記在不結球白菜遺傳多樣性檢測,遺傳圖譜構建,重要性狀的數量性狀座位(QTL)定位,及分子標記輔助育種等方面的應用.

1 DNA分子標記的分類

遺傳標記指在生物體內受基因調控的、可遺傳、可通過技術手段加以檢測和識別的任何變異性狀,在動植物的遺傳育種工作中發(fā)揮著重要作用.根據檢測方法的不同,遺傳標記大致可分為形態(tài)標記、細胞標記、生化標記和分子標記.前三種是在個體、細胞和蛋白水平對基因的表達產物進行檢測,是對核苷酸序列的間接反映,因此表現出多態(tài)性差、標記數目少、易受外界干擾等缺點.分子標記則是一類以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記,能直接反映DNA遺傳多態(tài)性.作為一種較為理想的遺傳標記,由于其不受季節(jié)、生長時期等條件的限制,并且具有數量無限、多態(tài)性高、共顯性遺傳等優(yōu)勢,已經廣泛應用于不結球白菜的遺傳育種研究中.

經過四十幾年的發(fā)展,DNA分子標記的種類已經達到了數十種之多.每一種DNA分子標記在多態(tài)性檢測、重復性、經費開支及應用領域等方面的優(yōu)勢不盡相同(表1).根據技術原理的不同,可以將廣泛應用于不結球白菜遺傳育種工作中的DNA分子標記大致分為三類:第一類是以DNA分子之間雜交為基礎的分子標記,主要代表是限制性片段長度多態(tài)性(RFLP).在生物進化過程中,分類地位相近物種間的同源序列由于發(fā)生部分DNA片段的插入、缺失、易位和倒位,從而使得該區(qū)域限制性內切酶的識別位點增加或者減少.RFLP就是利用限制性內切酶對DNA進行消化,通過比較產生DNA的多態(tài)性來檢測兩個體之間的親緣關系[4].第二類是以聚合酶鏈反應(PCR)擴增技術為基礎的分子標記,比較常用的包括隨機擴增多態(tài)性DNA (RAPD),簡單序列重復 (SSR)和擴增片段長度多態(tài)性(AFLP).RAPD是利用10bp的隨機引物對基因組DNA進行擴增,通過比較擴增產物的多態(tài)性來揭示基因組中相應區(qū)域的DNA多態(tài)性[5].在真核生物的基因組序列中存在由1～6個堿基組成的重復單位,SSR就是利用該重復單位在不同等位基因間重復次數不同的特性,根據序列兩端設計特異性引物對SSR序列進行PCR擴增并比較產物片段的多態(tài)性[6].AFLP則是利用限制性內切酶對基因組DNA進行消化,DNA的粘性末端加上人工接頭后,利用引物與接頭3′端的特異性識別的特點對酶切片段進行PCR擴增,最后通過比較產物的長度來檢測多態(tài)性[7].第三類是基于單核苷酸多態(tài)性的DNA標記,即單核苷酸多態(tài)性標記 (SNP).SNP是指同一位點的不同等位基因之間存在個別核苷酸的差異或者小的插入和缺失,可通過基因芯片技術進行檢測[8].

表1 常用的分子標記及其特點比較

2 DNA分子標記在不結球白菜的遺傳多樣性分析中的應用

2.1不結球白菜的起源與演化

中國作為蕓薹屬作物的起源中心,早在三國時期就有關于不結球白菜的描述和記載.但是,現階段由于沒有發(fā)現野生品種與描述起源的相關文獻,所以對于不結球白菜具體的起源地還存在著爭議.學者們主要通過查閱古典書籍,對不結球白菜的起源地提出了各種假說,由于其喜歡溫暖濕潤的氣候,且現階段大多在南方地區(qū)廣泛栽培,所以大多數學者認為不結球白菜起源于中國的南方并慢慢演化到全國各地[9-10].近幾年,隨著分子標記技術的在遺傳多樣性研究中的廣泛應用,學者們陸續(xù)使用各種分子標記對不結球白菜的起源與演化進行了研究.Wang等[11]收集了來自于中國、日本和泰國三個國家,總共68份普通白菜種質資源,ISSR分子標記檢測結果表明中國的遺傳多樣性最高,并且來源相同地理分區(qū)的種質,往往親緣關系較近.韓建明等[12-13]通過SRAP和RAPD分子標記技術,從分子層面對不結球白菜的發(fā)源地進行了研究,在64份來源不同的種質中,普通白菜的遺傳豐富度要高于其他品種,且中國的種質資源比亞洲其他國家豐富.就中國而言,江淮流域的遺傳多樣性明顯高于中國其他地域.劉冬媛等[14]利用SSR分子標記對不結球白菜的遺傳分化進行了分析,結果也發(fā)現中國的種質資源要比日韓等國豐富,且以江淮流域的遺傳多樣性最高.肖禾等[15]結合表型特征和RAPD標記技術對中國不同地域普通白菜的遺傳多樣性進行了分析,統計顯示普通白菜在江淮地區(qū)的遺傳多樣性最豐富.以上研究表明,作為不結球白菜的原產地,中國的種質資源豐富,遺傳多樣性要明顯高于周邊國家,且從分子層面說明中國的江淮地區(qū)可能是起源地.

2.2親緣關系及其分類

不結球白菜作為蕓薹屬蕓薹中的一個亞種,中國的植物學家們基于形態(tài)學及園藝學特征,對不結球白菜的不同品系進行了大量的分類工作.吳耕民最早在《中國蔬菜栽培學》一書中將不結球白菜分為長梗白菜類、油冬菜類、塌菜類和蕓苔類4個大類[16].中國農科院則依據植物學特征與栽培特點,在《中國蔬菜優(yōu)良品種》一書中將其分為白梗白菜類、青梗白菜類或油冬菜類、塌地白菜類和菜苔類.曹壽椿等[17]在外部形態(tài)特征的基礎上,進一步結合其生物學特性,將不結球白菜分為普通白菜、菜薹、薹菜、塌菜、分蘗菜和白菜型油菜6類.曹家樹等[18]根據種皮形態(tài)、葉部特征等外部形態(tài)對不結球白菜進行了系統分類,大致分為普通白菜變種、塌菜變種、紫菜墓變種、薹菜變種、菜心變種、分蘗菜變種.

由于中國不結球白菜的起源及演化過程較為復雜,且不斷引種及不同品種間雜交選育,僅僅根據植物的外部形態(tài)及生物學特征,并不能將不同類型的不結球白菜進行準確地區(qū)分.曹家樹等[18-19]對不同品種白菜類蔬菜進行了RAPD分析,結果顯示DNA擴增片段在不結球白菜的不同品系中表現出明顯的差異,為不同品系之間的分類提供了重要的分子證據.孫德嶺等[20]利用AFLP分子標記技術對不結球白菜品種之間的的親緣關系進行了分析,兩個薹菜品種雖然聚類于不結球白菜亞種中,但與其他常見不結球白菜品種親緣關系較遠.郭晶心等[21]對來自6個國家的白菜種質進行了親緣關系的研究,小白菜的聚類分析結果較為混亂,各品種之間的相似性較低,與表型多樣性分析結果有較大差異.單曉政等[22]用優(yōu)化后的SRAP體系對不結球白菜的各個品種進行了分類與鑒定,基于分子標記多態(tài)性分析的聚類結果與園藝性狀的分類結果基本相似,普通白菜、烏塌菜與薹菜分別聚為三大類.軒淑欣等[23]結合SSR標記技術與UPGMA聚類分析法對78份不結球白菜種質進行分類,其中51份普通白菜聚為一類,并且4份烏塌菜聚在I-2亞類群,說明兩者是不同的品種,該結果為不同栽培品種的分類提供了依據.以上研究通過分子標記檢測不同品系之間DNA的多態(tài)性,為明確和細化不結球白菜的分類提供了重要的分子證據.

3 DNA分子標記在不結球白菜輔助育種中的應用

3.1不結球白菜遺傳圖譜構建

遺傳圖譜又稱遺傳連鎖圖譜,是以染色體重組交換率為相對長度單位,并將遺傳標記按其遺傳距離以線性排列的方式依次標定在染色體上所得到的連鎖圖譜[24].構建遺傳圖譜是遺傳學研究中的重要環(huán)節(jié),高密度的連鎖圖譜在進行數量性狀定位、開展分子標記輔助育種以及功能基因克隆等研究領域發(fā)揮著重要作用.

不結球白菜遺傳圖譜構建工作起步較晚,耿建峰等[25]將不結球白菜“暑綠”進行游離小孢子培養(yǎng),并以獲得的112個雙單倍體(DH)株系為作圖群體成功構建了第一張不結球白菜遺傳連鎖圖譜.該圖譜總覆蓋長度為1 116.90 cM,包含了14條連鎖群和186個多態(tài)性標記.而后,Geng等[26]使用了一種考慮偏分離和缺失標記的新方法,對原圖譜進行了進一步的改進和糾正,新圖譜總長為1 923.75 cM,總共包含138個分子標記,總平均圖距為15.52 cM.到2011年,國內外學者已經成功構建了大量的遺傳圖譜(表2).為了縮短時間并提高效率,構建圖譜過程中大多選擇了F2代和DH群體作為作圖群體,而沒有選擇用構建年限較長的重組自交系.其中以雜種后代F2作為作圖群體時,大多選擇了使用種內的不同品種作為雜交親本,以此來保證親本間的DNA多態(tài)性.而在圖譜構建過程中常用的分子標記種類包括了RAPD,AFLP,ISSR,SSR,SRAP和InDel,多種標記技術的混合使用,有利于實現各種分子標記的優(yōu)勢互補,提高了圖譜的長度和密度.

表2 已報道的不結球白菜遺傳圖譜

3.2不結球白菜數量性狀的標記和定位

農作物的大多數經濟和農藝性狀都是數量性狀.不同于受主效基因控制的質量性狀,數量性狀是多對微效基因聯合效應的結果,因此在遺傳變異上呈現出一定的連續(xù)性,且表現型與基因型之間并不存在明顯的對應關系[34].再者數量性狀比較容易受環(huán)境條件的影響,因此基于個體表型的傳統育種方法并不能對作物株高、品質和產量和抗病性等數量性狀進行有效的選育.控制數量性狀的微效多基因往往相對集中地存在于一個染色體或多個染色體中的某一區(qū)段,QTL定位就是指借助DNA分子遺傳標記來確定與之連鎖的數量性狀基因在染色體上的位置,從而使某些經濟性狀的定向改良成為可能.

3.2.1 農藝性狀QTL定位與分析

耿建峰[35]在構建遺傳圖譜的同時,在8個不同生長時期中,檢測到了不結球白菜控制株高、開展度及葉型等重要農藝性狀的多個QTL位點.成妍[36]采用復合區(qū)間作圖法,一共檢測到分布在10個遺傳群上的47個與不結球白菜經濟性狀相關的QTL位點,并且控制相關表型性狀的QTL聚集分布.王倩[30]在其所建的不結球白菜遺傳圖譜上一共檢測到19個與抽薹開花等性狀相關的QTL位點,其中5個與控制現蕾天數相關,6個與抽薹天數相關,6個與開花天數相關,2個與抽薹指數相關.班青宇[29]利用不結球白菜不同品種間雜交得到的F2群體,通過對抽薹性狀的記錄和觀察,成功檢測和定位了4個與抽薹日數相關的QTL位點,5個與開花日數相關的QTL位點.

3.2.2 品質性狀QTL定位與分析

耿建峰[35]在連鎖圖譜上成功定位到了多個與不結球白菜品質相關的QTL位點,其中包含了控制可溶性蛋白QTL位點2個,控制干物質的QTL位點3個,控制葉片、葉柄重比的QTL位點4個.單曉政[37]在不結球白菜遺傳圖譜的第3和第4連鎖群上篩選出兩個與葉片維生素C性狀相關的QTL位點.班青宇等[38]在遺傳圖譜中的第5連鎖群成功定位到一個控制脯氨酸含量的QTL位點,在第3連鎖群定位到一個與可溶性蛋白含量相關的增效QTL位點,前者的加性效應和貢獻率為0.370%和8.320%,后者的加性效應和貢獻率為0.004%和8.120%.Wang等[39]在遺傳圖譜的A05,A08和A10連鎖群上檢測到了11個與光合色素含量相關的QTL位點,其中位點的最大貢獻率為38.000%.

3.2.3 抗病性狀QTL定位與分析

有關不結球白菜抗病性狀QTL定位的研究較少,陸鵬[31]利用不結球白菜抗蟲種質雜交所得的兩張遺傳圖譜,對不同白菜抗源抗小菜蛾基因進行了QTL定位,在‘599×114’組合遺傳圖譜的LG7、LG8和LG9連鎖群上檢測到3個與抗蟲相關的QTL位點,在‘508×114’組合遺傳圖譜中也成功定位了3個與抗蟲相關的QTL位點,分別位于LG1和LG10連鎖群上.

3.3 不結球白菜分子標記輔助育種

分子標記輔助育種(MAS)是指利用分子標記與決定目標性狀基因緊密連鎖的特點,通過檢測DNA分子標記而選育出具有優(yōu)良性狀的新品種.不同于直接對個體表型進行性狀篩選的傳統育種方法,DNA分子標記輔助育種是在分子水平上直接對決定性狀的基因型進行篩選,由此避免了環(huán)境等外界因素對個體表型性狀的間接影響,從而實現了對選育性狀的定向改良.此外,在幼體時期就能夠通過分子標記對性狀進行準確的選擇,從而可以大大提高育種進程并削減成本.

自交不親和性作為一種防止近親繁殖的遺傳機制,能夠有效地避免自交衰退,從而保持品種的遺傳多樣性[40].在不結球白菜的選育工作中,也常常把自交不親和性作為一個重要的選育目標.Shi等[41]以自交不親和品種SC104-1與自交親和品種SI13-2雜交F2群體為材料,結合混合分組分析法(BSA)獲得一個與自交不親和基因連鎖距離為7.53±0.11 cM的RAPD分子標記S1107-(900).葛婷婷等[42]以不結球白菜的近等基因系為群體材料,篩選得到3個與自交不親和基因連鎖的SSR分子標記sR6688,KBRH138G23和Na12E02,遺傳距離分別為12.91、5.35和3.08 cM,SSR引物驗證后,最終在Na12E02附近得到一個與自交不親和基因緊密連鎖的標記BrSS15,遺傳距離為0.49 cM.Li等[43]對不結球白菜隱性核雄性不育系WS24-3和雄性系WS135雜交產生的F2群體進行分析,在A2連鎖群上定位一個隱形核基因Bra2Ms,并在該區(qū)域發(fā)現了兩個共分離的分子標記SSRa2-951和SSRa2-960.賈永鵬等[44]利用自交親和系WS-199和自交不親和系WS-85構建了F2群體,采用BSA法和SNP芯片技術成功篩選出100個差異SNP位點,在相應區(qū)域設計引物并成功篩選到3個與自交不親和性相關的SSR分子標記BrA1-2,BrA1-3和BrA1-14.

抽薹開花是指在低溫且長日照等環(huán)境因素的誘導下,植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉變的過程.因此,農作物的過早抽薹甚至未熟抽薹將會對生產造成巨大損失.張波[45]在遺傳圖譜中成功篩選到一個與晚抽薹基因緊密連鎖的SSR分子標記LB.李向[32]在對不結球白菜DH群體進行連鎖分析時,在A02連鎖群上得到一個開花時間特異標記.Du等[46]利用BSA法從普通白菜中篩選到一個與晚抽薹基因遺傳距離為3.14 cM的RAPD分子標記S265(750).

抗病育種作為分子標記輔助育種的重要方向,目前已經篩選出多個與抗病性狀緊密連鎖的分子標記,為選育高產抗病的不結球白菜新品種提供了依據.冷月強[47]利用RAPD分子標記并結合BSA法,獲得了一個不結球白菜抗霜霉病基因緊密連鎖的分子標記AY121238.Wang等[33]將抗蕪菁花葉病毒基因TuRBCH01定位在R6連鎖群上,兩側的AFLP標記為E36M62-3和E44M48-1,間距為7.9和21 cM.彭海濤等[48]通過BSA法在不結球白菜的F2群體中篩選得到一個與蕪菁花葉病毒抗病基因連鎖距離為8.7 cM的SSR標記Ra3E05,而后轉化為SCAR標記SCRa2.張慧等[49]利用感病品種T青和抗病品種‘CR’雜交產生的F2群體,采用BSA法成功篩選到一個與根腫病抗病基因遺傳距離為9.72 cM的ISSR分子標記.

4 問題與展望

分子標記作為遺傳育種工作的重要工具,已經在不結球白菜遺傳多樣性評價、遺傳圖譜構建、QTL定位及分子標記輔助育種等研究中展現了巨大潛力,大大地提高了選育的準確性和有效性.與此同時,分子標記在不結球白菜遺傳育種研究中也存在以下幾點不足.1)不結球白菜的高飽和遺傳圖譜有待建成.已報道不結球白菜的遺傳圖譜較少,且半數以上的作圖群體都是選用不易保存的雜交后代,導致圖譜不能通用并且無法繼續(xù)飽和原圖譜,而多種分子標記混合使用雖然在一定程度上增加了標記的數量,但是并不能滿足高密度圖譜的需求;2)經濟性狀相關的QTL位點與分子標記輔助育種之間缺少聯系.由于缺少高密度遺傳圖譜,在很多時候并不能將與經濟性狀相關的QTL位點進行精確定位,使得篩選得到的分子標記并不能應用于輔助育種;3)與經濟性狀相關的QTL位點之間以及QTL位點與環(huán)境之間存在互做效應,在進行標記輔助育種過程中,由于圖譜密度及QTL位點的缺陷,使得分子標記篩選后的個體內QTL位點之間失去互做效應;4)應該充分發(fā)揮分子標記在農作物苗期對經濟性狀的預測作用,在苗期對不結球白菜的抗病性、晚抽薹等重要經濟性狀進行篩選,能有效提高選育進程并節(jié)約資金.隨著生物技術的發(fā)展和高通量檢測的普及,以SNP為代表的第三代分子標記逐漸興起,將為不結球白菜的遺傳育種研究提供新的契機.由于其在穩(wěn)定性及多態(tài)性等方面具有第一代和第二代分子標記無法比擬的優(yōu)勢,使得高密度圖譜的構建及功能相關分子標記的開發(fā)成為可能.隨著檢測及分析技術的不斷完善,SNP分子標記必將在遺傳改良和輔助育種工作中發(fā)揮重要作用.

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(責任編輯:顧浩然,馮珍珍)

ApplicationprogressofDNAmolecularmarkersinnon-headingChinesecabbagegeneticbreeding

Li Mengmeng, Cui Lijie, Qian Zhongying, Kai Guoyin*, Pan Jingxian*

(Development Center of Plant Germplasm Resources,College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

This paper reviews the classification and characteristics of DNA molecular markers in non-heading Chinese cabbage (Brassicacampestrisssp.chinensisMakino) genetic breeding,and its application in genetics diversity analysis,genetic map construction,quantitative trait locus (QTLs) mapping and molecular marker-assisted selection.Finally,some limitations of DNA molecular markers on genetic improvement and assistant breeding of non-heading Chinese cabbage are pointed out,and some suggestions are put forward,aiming to provide valuable information for genetic breeding of non-heading Chinese cabbage.

molecular marker; genetic breeding; non-heading Chinese cabbage

S 634.3

A

1000-5137(2017)05-0720-09

2017-08-31

上海市科委項目(17JC1404300,15430502700);上海植物種質資源工程技術研究中心項目(17DZ2252700)

李蒙蒙(1986-),女,碩士研究生,主要從事植物次生代謝產物分子方面的研究.E-mail:1562708056@qq.com

*

開國銀(1977-),男,博士,教授,主要從事植物分子生物學及次生代謝工程等方面的研究.E-mail:kaiguoyin@163.com;潘靜嫻(1963-),女,博士,副教授,主要從事功能基因組學方面的研究.E-mail:panjingx@shnu.edu.cn