實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)在石蠟切片可疑結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

成克倫，高紹瑩，陳秀嬋，姜 森，馬慶慶，周永松，熊云剛，鄒陽(yáng)強(qiáng)

(貴州航天醫(yī)院 1．病理科；2.中心實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000)

健康科學(xué)基礎(chǔ)研究

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)在石蠟切片可疑結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

成克倫1，高紹瑩2，陳秀嬋1，姜 森1，馬慶慶2，周永松1，熊云剛1，鄒陽(yáng)強(qiáng)1

(貴州航天醫(yī)院 1．病理科；2.中心實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000)

目的探討實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(FQ-PCR)法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA在可疑結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法應(yīng)用FQ-PCR法，對(duì)50例可疑結(jié)核病的石蠟切片進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)。結(jié)果檢出35例結(jié)核分枝桿菌DNA陽(yáng)性，陽(yáng)性率70.0%；結(jié)合臨床、影像和檢驗(yàn)等資料綜合分析后，29例明確診斷為結(jié)核病，確診率為58.0%。結(jié)論FQ-PCR能檢出石蠟切片部分可疑結(jié)核病的結(jié)核桿菌DNA，從而確定感染病原體，有助于臨床有效診斷。

實(shí)時(shí)熒光定量；聚合酶聯(lián)反應(yīng)；石蠟切片；結(jié)核病

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病，可累及人體各個(gè)器官，以肺結(jié)核病和淋巴結(jié)結(jié)核病多見(jiàn)，近年來(lái)發(fā)病率有所上升。典型結(jié)核病病理上診斷容易，當(dāng)出現(xiàn)不典型病理改變呈可疑結(jié)核時(shí)診斷較困難。本文通過(guò)FQ-PCR法，探討可疑結(jié)核病石蠟切片結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)的可行性，為確診結(jié)核病提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料 收集貴州航天醫(yī)院2015年6月—2016年5月可疑結(jié)核病標(biāo)本50例，其中肺穿刺標(biāo)本29例，胸膜穿刺標(biāo)本12例，腸鏡活檢標(biāo)本3例，手術(shù)切除大標(biāo)本6例(肺1例、軟組織包塊1例、關(guān)節(jié)滑膜2例、淋巴結(jié)1例、皮膚1例)。標(biāo)本來(lái)源病例男32例，女18例，年齡25～75歲；臨床診斷結(jié)核15例。

1.2 方法

1.2.1 HE切片 標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片，厚4μm，HE染色。

1.2.2 FQ-PCR檢測(cè)切片準(zhǔn)備 小標(biāo)本連續(xù)切取10片，大標(biāo)本切取5片，厚5μm，置于1.5mL離心管中。

1.2.3 切片DNA提取 采用石蠟包埋組織DNA快速提取試劑盒提取DNA，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.2.4 FQ-PCR檢測(cè) 分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?為博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)為上海宏石醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品。取出擴(kuò)增反應(yīng)液置于冰盒上解凍，取2μLDNA提取后的樣本加入到18μL含有引物、探針和酶的擴(kuò)增反應(yīng)液管中進(jìn)行擴(kuò)增；同時(shí)設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照，用試劑盒提供的對(duì)照品進(jìn)行。PCR擴(kuò)增程序設(shè)定：37 ℃循環(huán)1次，時(shí)間300 s；94 ℃循環(huán)1次，時(shí)間180 s；94 ℃循環(huán)40次，時(shí)間15 s；60 ℃循環(huán)40次，時(shí)間30 s；50 ℃循環(huán)1次，時(shí)間10 s。同時(shí)選擇FAM和HEX通道，熒光采集點(diǎn)選擇60 ℃、30 s。

1.2.5 結(jié)果判斷 樣本擴(kuò)增曲線呈S型，且Ct值﹤40為陽(yáng)性；擴(kuò)增曲線不呈S型或Ct值為40(或無(wú)數(shù)值)為陰性。

2 結(jié)果

50例可疑結(jié)核病標(biāo)本中，44例病變呈肉芽腫性炎改變，壞死組織少或無(wú)壞死組織(見(jiàn)圖1)，F(xiàn)Q-PCR結(jié)核桿菌DNA陽(yáng)性31例。6例病變?yōu)閴乃澜M織，周圍為纖維組織而無(wú)肉芽腫結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖2)，F(xiàn)Q-PCR結(jié)核桿菌DNA陽(yáng)性4例。全部病例中，F(xiàn)Q-PCR結(jié)核桿菌DNA陽(yáng)性總數(shù)35例，陽(yáng)性率為70.0%(見(jiàn)表1)。陽(yáng)性擴(kuò)增曲線呈S型，且Ct值﹤40(見(jiàn)圖3)，陰性擴(kuò)增曲線不呈S型，或Ct值為40(或無(wú)數(shù)值)(見(jiàn)圖4)。結(jié)合臨床、影像和檢驗(yàn)等資料綜合分析后，29例明確診斷為結(jié)核病，確診率為58.0%。

圖1 可疑結(jié)核病的肉芽腫性炎 HE×100

圖2 可疑結(jié)核病的壞死組織 HE×200

標(biāo)本類型nCt值無(wú)數(shù)值40﹤40FQ-PCR-+肺穿刺293422722胸膜穿刺1222848手術(shù)切除611424腸鏡活檢320121合計(jì)5087351535

圖3 結(jié)核桿菌DNA陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(FAM/HEX)

圖4 結(jié)核桿菌DNA陰性擴(kuò)增線(FAM/HEX)

3 討論

世界衛(wèi)生組織(WHO)新出版的《2015年全球結(jié)核病報(bào)告》中顯示：2014年全球新發(fā)病人數(shù)為960/萬(wàn)，我國(guó)為94/萬(wàn)；患病率全球?yàn)?74/10萬(wàn)，我國(guó)為89/10萬(wàn)；發(fā)病率全球?yàn)?33/10萬(wàn)，我國(guó)為68/10萬(wàn)；全年有150萬(wàn)人死于結(jié)核病[1]。因此，目前結(jié)核病的診治仍刻不容緩。結(jié)核分枝桿菌為結(jié)核病病原菌，是一種生長(zhǎng)緩慢，抗酸染色陽(yáng)性的棒狀桿菌。它可侵犯全身各器官，引發(fā)多系統(tǒng)結(jié)核病，以肺結(jié)核最為多見(jiàn)。結(jié)核病的基本病理變化為滲出、增生和壞死，這三種病變往往同時(shí)存在而以某一種病變?yōu)橹鱗2]。在病理切片上最有診斷價(jià)值的是結(jié)核結(jié)節(jié)，典型結(jié)核結(jié)節(jié)中心為干酪樣壞死物即壞死徹底的凝固性壞死，周圍為類上皮細(xì)胞和數(shù)量不等的朗漢斯巨細(xì)胞，外圍可有淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。具有典型結(jié)核結(jié)節(jié)的病變病理診斷不難，但當(dāng)病變不典型即可疑結(jié)核時(shí)病理上很難確診，這些可疑結(jié)核病變一種呈肉芽腫性炎改變，無(wú)或少有壞死，需要與結(jié)節(jié)病、異物肉芽腫、麻風(fēng)和克羅恩病等多種可以呈肉芽腫改變的疾病鑒別。另一種為只有壞死組織，但無(wú)法判斷為干酪樣壞死，周圍為纖維組織無(wú)肉芽腫組織，需要與其它炎癥或腫瘤引起的壞死鑒別。另外，由于內(nèi)窺鏡和穿刺應(yīng)用越來(lái)越廣泛，所取標(biāo)本少有時(shí)不一定能反映病變?nèi)?，可疑結(jié)核小標(biāo)本量在不斷增多，也給診斷提出了更高要求。這種情況下，應(yīng)用一種什么方法來(lái)快速準(zhǔn)確幫助診斷和鑒別結(jié)核病，是許多病理工作者關(guān)心的問(wèn)題。傳統(tǒng)方法是對(duì)切片進(jìn)行抗酸染色，但福爾馬林固定的組織會(huì)使蛋白產(chǎn)生交聯(lián)，加之一些脫水劑的作用，可能會(huì)影響結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性染色[3]，導(dǎo)致陽(yáng)性率很低。研究[4]表明，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，已廣泛用于基因表達(dá)、病原體檢測(cè)等諸多研究領(lǐng)域，并被成功用于微生物快速定量檢測(cè)。在結(jié)核桿菌的檢測(cè)中，陽(yáng)性率高于其它方法[5]，本實(shí)驗(yàn)就是基于FQ-PCR技術(shù)來(lái)提高切片可疑結(jié)核的確診而進(jìn)行的。

本研究中，對(duì)50例病理切片可疑結(jié)核標(biāo)本應(yīng)用FQ-PCR進(jìn)行了結(jié)核菌DNA檢測(cè)，35例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為70%。結(jié)合臨床、影像和檢驗(yàn)等資料綜合分析后，29例可明確診斷為結(jié)核病，確診率為58%，高于文獻(xiàn)報(bào)道[6]，可能與標(biāo)本類型的選擇有關(guān)。檢測(cè)結(jié)果從而正確指導(dǎo)臨床及時(shí)治療，避免因誤診而造成結(jié)核病繼續(xù)存在和發(fā)展，表明該檢測(cè)方法具有實(shí)用價(jià)值，可部分彌補(bǔ)病理形態(tài)學(xué)診斷的不足，提高結(jié)核病的檢出率，在目前缺乏更有效的鑒別方法下，本法不失為一種有效而可靠的方法，具有推廣意義。FQ-PCR陽(yáng)性的病例首先應(yīng)該考慮結(jié)核病，但部分陽(yáng)性者也可能既往患過(guò)結(jié)核病或?yàn)檎Ь遊7]，因此需要結(jié)合全面資料進(jìn)行綜合分析，本組有6例陽(yáng)性患者，但缺乏特異性臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)異常，單憑FQ-PCR結(jié)果，還不能完全確診為結(jié)核，視為不確定性病例，需要隨診觀察。

FQ-PCR結(jié)核桿菌DNA檢測(cè)也存在假陽(yáng)性和假陰性，可能與以下因素有關(guān)[8]：(1)PCR反應(yīng)本身敏感性很高，有出現(xiàn)假陽(yáng)性可能；(2)既往結(jié)核病痊愈后殘留有死亡的結(jié)核桿菌或處于帶菌狀態(tài)，出現(xiàn)假陽(yáng)性；(3)標(biāo)本局限，未取到結(jié)核桿菌感染組織，出現(xiàn)假陰性；(4)標(biāo)本太少，操作過(guò)程中有丟失，出現(xiàn)假陰性。為提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，在操作過(guò)程中我們體會(huì)到要注意幾點(diǎn)：(1)穿刺和內(nèi)窺鏡等小標(biāo)本至少切片10片以上，多個(gè)標(biāo)本時(shí)切片要防止污染；(2)每次均設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照；(3)DNA提取嚴(yán)格按規(guī)定時(shí)間和步驟進(jìn)行，保證脫蠟干凈，獲取更多DNA；(4)PCR擴(kuò)增條件按試劑盒要求設(shè)定。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，無(wú)壞死或壞死很少的切片，陽(yáng)性率較低，這可能與增生病變中結(jié)核桿菌相對(duì)較少有關(guān)。

應(yīng)用FQ-PCR對(duì)結(jié)核桿菌DNA進(jìn)行檢測(cè)，由于使用的試劑和儀器不同，檢出率存在差異，故這項(xiàng)檢測(cè)有待于進(jìn)一步的創(chuàng)新優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀性，提高結(jié)核病病原體檢出率以更好地幫助確診。

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Applicationofreal-timeFQ-PCRinthediagnosisofthesuspectedtuberculosisinparaffinsection

CHENG Ke-lun1，GAO Shao-ying2，CHEN Xiu-chan1，JIANG Sen1，MA Qing-qing2，ZHOU Yong-song1，XIONG Yun-gang1，ZOU Yang-qiang1

(1.DepartmentofPathology；2.LabCenter，GuizhouAerospaceHospital，Zunyi563000，China)

ObjectiveTo evaluate the efficacy of real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) for the detection of tubercle bacillus (TB) DNA in the diagnosis of suspected tuberculosis.MethodTB DNAs in 50 paraffin sections with suspected tuberculosis were detected by using FQ-PCR.Results35 cases were detected to be TB DNA positive, with a positive rate of 70%. Combined with clinical, imaging, and laboratory data, 29 cases were diagnosed as tuberculosis, with a diagnosis rate of 58%.ConclusionFQ-PCR can be used to partially detect TB DNAs in suspected cases, thereby to determine the infectious pathogens and finalize diagnosis of the disease, which can provide an effective method for clinical examination.

real-time fluorescent quantitative；polymerase chain reaction；paraffin section； tuberculosis

10.3969/j.issn.1674-6449.2017.05.009

2017-01-10

成克倫(1964 - )，男，貴州桐梓人，本科，主任醫(yī)師。

R521

A

1674-6449(2017)05-0507-03