蟾蜍靈對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG及其成球細(xì)胞增殖和凋亡影響的研究*

劉 佳 孔令凱 孫舒嵐 李曉曦 張桂榮 樸浩哲△

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2.大連醫(yī)科大學(xué)腫瘤干細(xì)胞研究院，遼寧 大連116044；3.中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，遼寧省腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110042）

蟾蜍靈對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG及其成球細(xì)胞增殖和凋亡影響的研究*

劉 佳1孔令凱2孫舒嵐3李曉曦3張桂榮3樸浩哲3△

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2.大連醫(yī)科大學(xué)腫瘤干細(xì)胞研究院，遼寧 大連116044；3.中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，遼寧省腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110042）

目的觀察蟾蜍靈對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG及U87MG成球細(xì)胞增殖和凋亡作用的影響。方法取對數(shù)生長期的U87MG細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，分別向細(xì)胞懸液中加入不同濃度的蟾蜍靈，另設(shè)DMSO作為對照組，MTT檢測細(xì)胞存活情況；克隆形成2周后，觀察不同濃度蟾蜍靈對細(xì)胞增殖的影響；蟾蜍靈處理U87MG細(xì)胞12 h和48 h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況；Western blot檢測蟾蜍靈處理U87MG細(xì)胞48 h后凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP表達(dá)水平；分別用成球培養(yǎng)基和含有蟾蜍靈的成球培養(yǎng)基培養(yǎng)U87MG細(xì)胞7 d，顯微鏡下觀察細(xì)胞是否成球及其形態(tài)、成球體積大小變化和數(shù)量變化；成球的U87MG細(xì)胞加入不同濃度蟾蜍靈72 h后，PI避光染色1 h，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞死亡情況。結(jié)果加入蟾蜍靈處理的U87MG細(xì)胞生存率較空白對照組和DMSO組明顯下降，24 h、48 h和72 h的IC50分別為85 nmol/L、34 nmol/L和22 nmol/L。蟾蜍靈處理后克隆形成數(shù)量低于空白對照組。U87MG細(xì)胞經(jīng)蟾蜍靈處理后，細(xì)胞凋亡比例增加，并存在藥物濃度時(shí)間依賴性；凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP表達(dá)量較空白對照組增加；U87MG細(xì)胞在成球培養(yǎng)基中培養(yǎng)后可以成球；加蟾蜍靈干預(yù)后，細(xì)胞成球體積明顯比空白對照組小，且數(shù)量減少。PI染色觀察到隨藥物濃度增加，細(xì)胞球死亡比例增加。結(jié)論蟾蜍靈可以抑制U87MG細(xì)胞生長和增殖，并能促進(jìn)其凋亡；蟾蜍靈可以抑制膠質(zhì)瘤U87MG成球，并能殺傷干細(xì)胞。

蟾蜍靈 膠質(zhì)瘤 凋亡 腫瘤干細(xì)胞

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率最高的原發(fā)惡性腫瘤，具有病死率及復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，總體預(yù)后較差。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞中的一小部分，這些細(xì)胞負(fù)責(zé)腫瘤的轉(zhuǎn)移能力，并產(chǎn)生耐藥性［1］。如今，雖然經(jīng)過傳統(tǒng)治療后，部分腫瘤瘤體可以縮小，但多數(shù)在治療后會再次復(fù)發(fā)，這是由于腫瘤干細(xì)胞可以使腫瘤細(xì)胞再生所致［2-3］。因此，尋找殺傷腫瘤干細(xì)胞的藥物對治療惡性腫瘤起到至關(guān)重要的作用。蟾毒靈是中藥蟾酥的主要成分之一，是從中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍分泌的毒液中提取的［4］。蟾酥主要含蟾蜍靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基3種蟾毒單體，具有強(qiáng)心、麻醉和調(diào)節(jié)血壓的作用［5］，并且這3種單體都能影響腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］，其中以蟾蜍靈的抗癌活性最強(qiáng)，屬于強(qiáng)心苷類物質(zhì)［7］。強(qiáng)心苷類是強(qiáng)有力的腫瘤生長抑制劑［8］。因此，近些年蟾蜍靈的抗腫瘤作用機(jī)制成為研究熱點(diǎn)，結(jié)果證明蟾蜍靈對多種腫瘤細(xì)胞都有作用，如前列腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤等［9-15］。 蟾蜍靈在其他惡性腫瘤中作用相對明確，但在膠質(zhì)瘤上的作用研究較少，對膠質(zhì)瘤來源的腫瘤干細(xì)胞的作用還尚無報(bào)道。膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞經(jīng)成球培養(yǎng)基培養(yǎng)后可以成球，而成球后的細(xì)胞具有較強(qiáng)的干細(xì)胞性質(zhì)［16］。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察蟾蜍靈對膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞及其成球后細(xì)胞增殖和凋亡作用的影響。

1 材料與方法

1.1 研究材料

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG購自ATCC細(xì)胞庫，由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)傳代；蟾蜍靈購自Sigma-Aldrich公司，純度為98%，用二甲基亞砜（DMSO）充分溶解后，調(diào)整濃度為16 mmol/L儲存，使用前用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U87MG細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期的細(xì)胞待用，細(xì)胞每 2～3 日用含 EDTA 的胰酶以 1∶3～1∶5 傳代。

1.2.2 MTT檢測U87MG細(xì)胞生存率 取對數(shù)生長期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于3 個(gè) 96 孔板中，每孔約 5000 個(gè)細(xì)胞，100 μL/孔，細(xì)胞貼壁后， 分別向孔板中加入蟾蜍靈（0、10、20、40、80、160 nmol/L），另外設(shè)定DMSO對照組，共7組。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)立6復(fù)孔，于37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入10 μL MTT液混勻，培養(yǎng)3～4 h后，棄掉培養(yǎng)基，每孔各加100 μL MTT專用DMSO，混勻10 min充分溶解結(jié)晶后，用雙波長測定490 nm處吸光度（OD值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞生存率，制作標(biāo)準(zhǔn)生長曲線。

1.2.3 克隆形成觀察細(xì)胞增殖水平 正常消化細(xì)胞后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取每孔約1000個(gè)細(xì)胞鋪于6孔板，每孔2 mL，細(xì)胞過夜貼壁后，各孔加不同濃度蟾蜍靈（0、10、20 nmol/L），37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周左右，待出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗兩次，每孔加多聚甲醛1 mL固定液固定細(xì)胞15～20 min，固定結(jié)束后棄掉固定液，每孔加1 mL GIMSA染色液染色10～30 min后，用流水緩慢清洗掉染色劑，空氣中自然干燥。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液后接種于24孔板中，1 mL/孔，待細(xì)胞貼壁后分別向孔板中加入蟾蜍靈 （0、10、20 nmol/L），置于37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12 h和48 h后，用PBS小心清洗1次，每孔加入200 μL不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，1 min后加1 mL含血清培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打成細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5 min，棄上清。每個(gè)樣品加300 μL的Binding Buffer輕輕吹打混勻，加入 3 μl Annexin V 和 3 μL PI染色，混勻后避光15 min，300目過濾網(wǎng)過濾后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 Western Blot檢測凋亡蛋白表達(dá)水平 向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度蟾蜍靈 （0、20、40、80 nmol/L）48 h后，提取總蛋白制樣。向電泳槽中加入Running Buffer浸沒膠板。拔掉梳子后向膠板小槽中加樣開始電泳。電泳結(jié)束后，將夾好的轉(zhuǎn)模板放入電泳槽中，加入Trans Buffer，蓋上蓋子冰浴轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，NC膜用麗春紅染液染色，鉛筆標(biāo)記Marker，切膜。用預(yù)冷的PBS洗去染液。加入4 mL封閉液慢搖床上室溫封閉 1.5～2.5 h。 棄掉封閉液，用預(yù)冷的 PBS 洗 1～2 遍，加入一抗稀釋液，慢搖床上4℃孵育過夜（12 h）。次日早回收一抗。用預(yù)冷的TBST洗膜。加入二抗封閉液，常溫慢搖床上搖1 h。棄掉封閉液，再用預(yù)冷的TBST 2 μL洗3遍，最后用PBS清洗1次浸泡，凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.2.6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞成球 U87MG細(xì)胞正常消化后，用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄上清，用DMEM-F12重懸，再離心1次，棄上清，用成球培養(yǎng)基（無血清DMEM-F12培養(yǎng)基、10 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、2%的b27）重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后鋪板培養(yǎng)（低黏附孔板）7 d后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.7 蟾蜍靈對成球細(xì)胞的影響 U87MG細(xì)胞加入含有不同濃度蟾蜍靈（0、10、20 nmol/L）的成球培養(yǎng)基，置于低黏附細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)7 d，細(xì)胞成球后，電子顯微鏡下觀察細(xì)胞成球大小并計(jì)數(shù)成球數(shù)。成球后的細(xì)胞球加入不同濃度的蟾蜍靈（0、5、10、40 nnmol/L）處理 72 h 后，加入 PI（10 μg/mL）避光染色 1 h，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞球死亡情況 （細(xì)胞死亡部分顯示紅色熒光）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各時(shí)間點(diǎn)蟾蜍靈對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG生存率的影響

見表1，圖1。與空白對照組、DMSO組比較，U87MG細(xì)胞經(jīng)蟾蜍靈處理后的細(xì)胞生存率逐漸下降，并存在時(shí)間濃度依賴性，處理48 h和72 h后的細(xì)胞生存率明顯低于24 h組（P＜0.05）。

表1 各時(shí)間點(diǎn)蟾蜍靈對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG生存率的影響（%）

圖1 蟾蜍靈處理U87MG細(xì)胞后的細(xì)胞生長增殖情況

2.2 各時(shí)間點(diǎn)蟾蜍靈對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG增殖的影響

見圖 2。 蟾蜍靈（0、10、20 nmol/L）處理 2 周后的U87MG細(xì)胞增殖作用與空白對照組相比明顯被抑制，在10 nmol/L蟾蜍靈處理的U87MG細(xì)胞組就可看到細(xì)胞增殖有所減少，在20 nmol/L時(shí)抑制作用顯著。

圖2 U87MG 細(xì)胞經(jīng)不同濃度蟾蜍靈 （0、10、20 nmol/L）處理2周后，細(xì)胞克隆形成情況

2.3 各時(shí)間點(diǎn)蟾蜍靈對U87MG細(xì)胞凋亡的影響

見表2，圖3。蟾蜍靈處理后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG早期凋亡和晚期凋亡比例與空白對照組相比均有升高，其中48 h處理的凋亡比例高于12 h凋亡比例，并與藥物濃度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各時(shí)間點(diǎn)蟾蜍靈對U87MG細(xì)胞凋亡的影響（%）

圖3 蟾蜍靈對U87MG細(xì)胞凋亡的影響

2.4 蟾蜍靈對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG凋亡蛋白表達(dá)的影響

見表3，圖4。凋亡蛋白Casepase-3的裂解活化表達(dá)量在蟾蜍靈20 nmol/L時(shí)與空白對照組相比有少量增加，而在40、80 nmol/L時(shí)表達(dá)量明顯增加；裂解的PARP蛋白表達(dá)水平同樣隨蟾蜍靈濃度的增加而增加。

2.5 U87MG細(xì)胞成球

見圖5。U87MG細(xì)胞在普通培養(yǎng)基中正常貼壁生長，而在成球培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d后，顯微鏡下觀察到U87MG細(xì)胞在低黏附的細(xì)胞培養(yǎng)板中形成多細(xì)胞聚集的球體，懸浮于培養(yǎng)基中。

表3 各時(shí)間段蟾蜍靈對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG凋亡蛋白表達(dá)的影響（%）

圖 4 Western blot檢測蟾蜍靈 （0、20、40、80 nmol/L） 處理U87MG細(xì)胞48 h后凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3及Cleaved-PARP的表達(dá)水平

圖5 U87MG細(xì)胞經(jīng)成球培養(yǎng)基培養(yǎng)后成球

2.6 蟾蜍靈對成球細(xì)胞的影響

見圖 6。U87MG 細(xì)胞在加入蟾蜍靈（0、5、20 nmol/L）的成球培養(yǎng)基中成球培養(yǎng)7 d，細(xì)胞成球體積與空白對照組相比明顯減?。ㄈ?個(gè)視野，測量細(xì)胞球大小計(jì)算平均值，依次為空白對照組210 μm，5 nmol/L組105.5 μm，20 nmol/L 組 78 μm）， 成球數(shù)量也有減少；蟾蜍靈（0、5、10、40 nmol/L）處理細(xì)胞球 72 h 后PI染色結(jié)果顯示，細(xì)胞在不同濃度處理后的死亡情況不同，加入蟾蜍靈10、40 nmol/L后的細(xì)胞死亡比例與空白對照組及蟾蜍靈5 nmol/L組相比有明顯增加，并與蟾蜍靈濃度正相關(guān)。

圖6 蟾蜍靈對U87MG細(xì)胞成球的影響

3 討 論

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)病率最高的原發(fā)惡性腫瘤，多呈侵襲性生長，與正常腦組織界限不清，手術(shù)徹底切除腫瘤組織難以實(shí)現(xiàn)［17］，由于血腦屏障的存在，治療膠質(zhì)瘤的藥物很難起到百分之百的作用，但隨著科技的發(fā)展，新的給藥途徑的出現(xiàn)，未嘗不可達(dá)到提高局部藥物濃度、降低毒性的效果，如從供應(yīng)腫瘤血液的血管注入藥物，提高局部組織藥物濃度等［18］，因而，尋求新的具有良好抗膠質(zhì)瘤作用的藥物，仍具有重要意義。近年來中醫(yī)藥在治療膠質(zhì)瘤方面取得了一定的進(jìn)展，特別是中西醫(yī)結(jié)合治療在提高生存率，改善放化療后的毒副作用方面，顯示出其獨(dú)有的優(yōu)勢。筆者發(fā)現(xiàn)中藥蟾酥的提取物蟾蜍靈，在多種腫瘤細(xì)胞中有明確的抑制作用［9-15］。有研究表明Na+-K+-ATP酶很可能是蟾蜍靈抑制肝癌細(xì)胞增殖的靶點(diǎn)之一［19］。蟾蜍靈通過活化ERK通路Raf、MEK、ERK，抑制ERK通路的過度激活，從而抑制食管癌細(xì)胞的增殖遷移［20］。蟾蜍靈在很多腫瘤細(xì)胞中作用及機(jī)制相對明確，但在膠質(zhì)瘤上的作用報(bào)道較少，有研究報(bào)道蟾蜍靈可引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡與自噬，其機(jī)制可能是通過Caspase-3及PARP的裂解活化表達(dá)、下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、上調(diào)Bax蛋白表達(dá)、釋放細(xì)胞色素C來完成的，并提出二者與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有密切關(guān)系［15］。近年來，有研究證明蟾蜍靈能抑制胰腺癌和骨肉瘤來源的腫瘤干細(xì)胞的分化和增殖［21-23］，但蟾蜍靈對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用研究還未見報(bào)道。

筆者研究結(jié)果提示，蟾蜍靈處理膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞后，細(xì)胞生存率明顯低于空白對照組及DMSO組，存在濃度時(shí)間依賴性，并能抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這與Shuying Shen等［15］研究結(jié)果相符。筆者隨后按照先前研究［24］的方法進(jìn)行了膠質(zhì)瘤細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)，結(jié)果提示膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以成球。經(jīng)過蟾蜍靈處理后，成球體積及數(shù)量明顯減少；分離出的細(xì)胞球經(jīng)蟾蜍靈處理72 h后，PI染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡比率與空白對照組相比明顯升高，說明蟾蜍靈對膠質(zhì)瘤U87MG來源的腫瘤干細(xì)胞有明確的殺傷作用，并隨藥物濃度的升高殺傷作用增強(qiáng)。

總之，蟾蜍靈抑制U87MG細(xì)胞生長及增殖，并促進(jìn)其凋亡，對成球后的細(xì)胞也有一定的殺傷作用，這為蟾蜍靈在臨床治療膠質(zhì)瘤提供了新的理論依據(jù)，并為膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究提供了新的科研思路。

本實(shí)驗(yàn)研究存在一定的局限性，到目前為止我們只進(jìn)行了蟾蜍靈對膠質(zhì)瘤U87MG及其成球后細(xì)胞的殺傷現(xiàn)象研究，對于機(jī)制研究尚未進(jìn)行，另外還尚未在動(dòng)物模型中開展實(shí)驗(yàn)，其臨床療效還有待評估。筆者將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)深入。

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Effect of Bufalin on Proliferation and Apoptosis of Human Glioma Cell Line U87MG and U87MG spheroids

LIU Jia， KONG Lingkai， SUN Shulan， et al. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning， Shenyang 110032，Chinal.

Objective：To study the effects of bufalin on proliferation and apoptosis of human glioma cell line U87MG and U87MG spheroids.Methods：The logarithmic growth phase of U87MG cells were used to make cell suspensions.The cells were treated with different concentrations of Bufalin，and a DMSO control group was set up.Cell survival level of U87MG was detected by MTT.The effect of different concentrations of bufalin on cell proliferation for 2 weeks was measured by colony formation.U87MG cells were treated with Bufalin for 12 and 48h，and apoptosis was assessed by flow cytometric analysis using Annexin V and propidium iodide （PI） double-staining.Western blot detected the expression of cleaved-caspase-3 and cleaved-PARP in U87MG cells after treated with Bufalin for 48 h.The U87MG cells were cultured in serum-free medium with or without Bufalin for 7 days.Then whether U87MG cells can be spheroids，the morphology of the cells，the change of the size and quantity of the spheroids were observed by microscope.U87MG spheroids were infected with Bufalin for 72h and stained with PI away from light for 1 hour.Subsequently，cells were visualized by fluorescence microscopy that red fluorescencing cells were indicative of cell death.Results：The survival rate of U87MG cells which treated with Bufalin were significantly decreased than the control group and DMSO group ，and the IC50of 24 h，48 h and 72 h was respectively 85 nmol/L，34 nmol/L and 22 nmol/L.The number of clones treated with bufalin is lower than the control group，and the apoptosis ratio increased with the concentration and time dependent.The expression of cleavedcaspase-3 and cleaved-PARP were higher than control group.U87MG cells maintained in serum-free mediumcan generate spheroids.The spheroids after treated with bufalin were significantly smaller than the control group，as well as the number of spheroids.PI staining was observed that cell death ratio increased with the increase of Bufalin's concentration.Conclusion：Bufalin can inhibit the growth and proliferation of U87MG cells and promote apoptosis.Bufalin can also inhibit and kill the U87MG spheroids.

Bufalin；Glioma；Apoptosis；Cancer stem cell

R289.5

A

1004-745X（2017）11-1933-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.015

遼寧省臨床能力建設(shè)重大項(xiàng)目（LNCCC-B04-2015）

△通信作者（電子郵箱：pzpy@163.com）

2017-08-08）