高小寬，梁魁景，馬燁煒，李 露

三七提取物對(duì)貯藏期梨黑斑病的防治研究

高小寬，梁魁景，馬燁煒，李 露

（衡水學(xué)院生命科學(xué)系 河北衡水 053000）

以貯藏梨為試驗(yàn)材料，研究三七提取物對(duì)梨果實(shí)體內(nèi)損傷接種的影響，從而篩選出三七提取物最佳抑制濃度。結(jié)果表明：體內(nèi)損傷接種試驗(yàn)結(jié)果看出，各濃度的三七提取物明顯抑制了損傷接種梨黑斑病菌果實(shí)病斑面積的擴(kuò)展，降低損傷接種果實(shí)的發(fā)病率，其中濃度為4000mg/L的抑菌效果最好，抑制率達(dá)到53.63%，毒力最強(qiáng)，EC50為 1918.079mg/L。

三七提取物；貯藏期梨；黑斑病

本試驗(yàn)選用不同濃度的中藥三七提取物的有效成分，體內(nèi)試驗(yàn)篩選出提取物對(duì)梨黑斑病抑制的最佳濃度，以期為中藥三七提取物防治梨黑斑病提供依據(jù)，為新型生物防腐劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 三七提取物由西安匯森生物科技有限公司提供（表1）。其提取物生產(chǎn)工藝為原料植物經(jīng)粉碎后用70%乙醇提取3遍，液體合并過濾，經(jīng)濃縮、噴粉、干燥、粉碎過篩，成品包裝。

表1 三七提取物成分和性狀

供試植物病原菌為梨貯藏期黑斑病，采自衡水舊城村梨園帶病梨果，經(jīng)貯藏15d后取病組織分離得到梨黑斑病菌。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離、純化和鑒定 參照方中達(dá)方法[5]。用70%酒精擦拭病果表面，無菌水沖洗干凈后，切取一小塊染病組織，在超凈工作臺(tái)中移到PDA培養(yǎng)基上，于25℃保溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出分生孢子后進(jìn)行單孢分離，純化后在PDA培養(yǎng)基上保存待用。各菌株在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)至菌落直徑接近 2/3培養(yǎng)皿直徑時(shí)，用打孔器在菌落邊緣打取直徑5mm的菌餅。

1.2.2 PDA培養(yǎng)基制備 參照方中達(dá)方法[5]進(jìn)行。首先用天平稱量去皮的馬鈴薯200g，將其切成小方形塊，放入鍋中，加無菌水1000mL，煮沸30min。用紗布濾去馬鈴薯殘?jiān)?，將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂15～20g，加熱熔化加入葡萄糖20g。待葡萄糖溶解后，加入適量的水以補(bǔ)充加熱過程中損失的水分，定容至1000mL。分裝后，在0.103Mpa，121℃下，高壓蒸氣滅菌20min。

1.2.3 孢子懸浮液制備 取出預(yù)先培養(yǎng)好的備用病原菌，在無菌條件下，往培養(yǎng)好的菌種培養(yǎng)基上加入含有0.01%Tween80的無菌水10mL，用已消毒的毛筆將互隔交鏈孢孢子從培養(yǎng)皿上輕輕刮下，制成濃度為1x106CFU/mL的孢子懸浮液，懸浮液孢子計(jì)數(shù)采用在10×10倍顯微鏡下每視野30～35個(gè)分生孢子。

1.2.4 體內(nèi)損傷接種試驗(yàn) 參照曹建康方法[6]并修改。選取大小均一、無病蟲危害的梨果實(shí)，自來水洗凈后，70%酒精擦拭梨表面，用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌過的紙吸取殘留在果實(shí)表面水分，再用滅菌鐵釘（直徑3mm）在每個(gè)梨中部等距離刺3mm深的小孔3個(gè)，分別用0.4g/L、0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L和 0.025g/L五個(gè)濃度梯度的三七提取液浸泡10min，拿出后晾1.5～3h。提前培養(yǎng)好梨黑斑病病菌，用滅過菌的直徑為6mm的打孔器在菌落邊緣鉆取一定量菌餅，將菌餅貼在梨的傷口上，用保鮮膜（PE薄膜）包裹后放在托盤中。在室溫下貯藏，每天在相同時(shí)間用十字交叉法測(cè)量梨果的病斑直徑。計(jì)算果實(shí)表面病斑面積并分析記錄數(shù)據(jù)。每處理10個(gè)果子，重復(fù)3次。 1.3 處理試驗(yàn)數(shù)據(jù) 將三七提取物質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)設(shè)置為橫軸，將抑制率幾率值設(shè)置為縱軸并作圖，得出毒力回歸方程及有效抑制中濃度（EC50）值。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七提取物對(duì)貯藏期梨黑斑病的抑制

2.1.1 對(duì)病斑直徑擴(kuò)展的抑制 各濃度的三七提取物處理與對(duì)照相比均能顯著抑制損傷接種蘋果梨果實(shí)病斑直徑的擴(kuò)展，濃度越高抑制效果越明顯（圖1）。用4000mg/L、2000mg/L、1000mg/L、500mg/L和250mg/L五種濃度處理后果實(shí)的病斑直徑分別為對(duì)照的46.5%，49.6%，50.8%，61.3%，62.5%，且與對(duì)照間差異達(dá)顯著水平。

圖1 三七提取物對(duì)損傷接種蘋果梨病斑直徑的影響

2.1.2 體內(nèi)損傷接種的毒力測(cè)定 將試驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入Excel表格計(jì)算出提取物的毒力回歸曲線及 EC50值（表2）。三七提取物的EC50為1918.079mg/L。

表2 三七提取物對(duì)梨黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的毒力值

2.1.3 體內(nèi)損傷接種試驗(yàn)的抑菌率 通過每天測(cè)量梨的病斑直徑，得出五種濃度的三七提取物對(duì)體內(nèi)損傷接種果實(shí)的發(fā)病率均有一定的抑制活性，且提取物濃度越高，發(fā)病率越低（表3）。試驗(yàn)結(jié)果表明三七提取物的濃度為4000mg/L的抑制效果最好。

表3 三七提取物對(duì)梨黑斑病病斑生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

三七提取物對(duì)梨黑斑病的菌落生長(zhǎng)、菌絲伸長(zhǎng)和在體內(nèi)損傷接種試驗(yàn)中均具有不同程度的抑制效果。在體內(nèi)損傷接種試驗(yàn)中，4000mg/L的抑菌效果最好，抑制率達(dá)53.63%，毒力最強(qiáng)，EC50為1918.079mg/L。

體內(nèi)損傷接種實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不如體外抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果明顯，主要原因可能是由于浸泡時(shí)間過短導(dǎo)致三七提取物滲入果實(shí)組織的濃度不夠，也可能是由于用三七提取物浸泡后在進(jìn)行損傷接種的時(shí)間間隔過短，沒能有效激發(fā)果實(shí)的抗性。具體原因有待進(jìn)一步研究。

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10.19440/j.cnki.1006-9402.2017.06.004

2017-10-11

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：QN2016329）

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