經(jīng)皮種植體表面納米二氧化硅抗菌涂層的研究

王嘉 吳國鋒 孫冠陽 趙銥民 魏洪波

經(jīng)皮種植體表面納米二氧化硅抗菌涂層的研究

王嘉 吳國鋒 孫冠陽 趙銥民 魏洪波

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

目的研究純鈦表面制備可降解載藥二氧化硅納米顆粒的抗菌性能。方法通過非模版法制備可降解載慶大霉素的二氧化硅納米顆粒，采用納米粒徑分析儀和掃描電鏡對納米粒進(jìn)行特征分析；將載藥納米粒振蕩交聯(lián)至純鈦微弧氧化處理后形成的微米級形貌表面，用掃描電鏡進(jìn)行形態(tài)觀測；將處理前后的樣品與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)，體外抑菌圈法考察抗菌性能；對載藥二氧化硅納米顆粒的抗菌涂層進(jìn)行體外藥物釋放實驗。結(jié)果載藥納米粒為直徑(298.1±12.2) nm的圓球狀；通過振蕩交聯(lián)后固定在純鈦微弧氧化層火山口樣的結(jié)構(gòu)內(nèi)形成抗菌涂層；體外抑菌圈大小為(16.7±1.4) mm， 而對照組未觀測到抑菌圈； 載藥二氧化硅納米顆粒的抗菌涂層可有效釋放慶大霉素長達(dá)28 d。結(jié)論基于可降解二氧化硅納米粒制備的抗菌涂層可實現(xiàn)慶大霉素的緩控釋放，并對金黃色葡萄菌的生長起到抑制作用， 有望在今后應(yīng)用于種植體經(jīng)皮部位的設(shè)計。

納米二氧化硅顆粒； 藥物控釋； 經(jīng)皮種植體； 抗菌

惡性腫瘤、創(chuàng)傷及諸多先天因素造成了眾多的顏面缺損患者，目前利用經(jīng)皮純鈦種植體固位的贗復(fù)體修復(fù)是很多患者最理想的治療方式。但是，臨床常用的種植體經(jīng)皮段通常是光滑的，植入體內(nèi)主要形成機械扣鎖封閉，容易形成纖維包囊；并且由于經(jīng)皮部位直接暴露于外界環(huán)境，在種植體植入和愈合的過程中極易受到細(xì)菌的侵襲，使得經(jīng)皮生物學(xué)封閉遭到破壞，最終導(dǎo)致種植體失敗[1-2]。為了克服上述問題，有學(xué)者開始嘗試在種植體表面制備抗菌藥物緩釋涂層[3-6]，但仍存在例如藥物釋放時間過短、抑菌藥物易失效、操作過于繁瑣等問題。

模版法制備的二氧化硅納米顆粒具有良好的生物相容性、顆粒直徑可控和原料豐富等優(yōu)點，因而被廣泛應(yīng)用于藥物緩控釋系統(tǒng)中[7-9]。而采用非模版法[10]制備的可降解二氧化硅納米顆粒不但步驟簡便，而且產(chǎn)物仍保持上述優(yōu)點，目前尚未被應(yīng)用于種植體表面處理領(lǐng)域。本實驗擬制備裝載慶大霉素的可降解納米二氧化硅顆粒，然后采用明膠交聯(lián)法[11]將該納米顆粒固定在鈦種植體微弧氧化的火山口樣孔洞內(nèi)，形成抗菌緩釋涂層，進(jìn)行掃描電鏡觀測；并對該抗菌涂層進(jìn)行體外抗菌性能研究。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

無水乙醇、氨水、丙酮、戊二醛(CP，富宇精細(xì)化工，天津)；正硅酸乙酯、硫酸慶大霉素、A型明膠(Sigma-Aldrich，美國)；圓形純鈦片(直徑10 mm、厚2 mm，西北有色金屬研究院)；碳化硅砂紙(600～7000目)；β-甘油磷酸二鈉鹽五水(β-GP，瑞禧生物科技有限公司，西安)；乙酸鈣(CA，瑞禧生物科技有限公司，西安)；金黃色葡萄球菌(Sa，ATCC 25923，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔微生物實驗室)；營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)；一次性培養(yǎng)皿(Corning,美國)；PBS緩沖液(博士德生物工程有限公司，武漢)；磁力攪拌儀(DragonLab,北京)；超聲波細(xì)胞破碎儀(Sonics，美國)；高速冷凍離心機(Thermo Scientific,美國)；真空冷凍干燥機(SIM，美國)；納米粒徑分析儀(Beckmen Coulter，美國)；場發(fā)射掃描電鏡(S-4800，Hitachi，日本)； 漩渦振蕩儀(恒奧德儀器儀表有限公司，北京)；微弧氧化相關(guān)設(shè)備(西北有色金屬研究院)；細(xì)菌濁度計(悅豐儀器儀表有限公司，上海)；恒溫?fù)u床(KYC系列，富瑪實驗設(shè)備有限公司，上海)；透析袋(截留物質(zhì)分子量大于10 000，綠鳥科技發(fā)展有限公司，上海)；慶大霉素elisa kit(Resenbio)。

1.2 載藥二氧化硅納米顆粒的制備及特征分析

1.2.1 載藥二氧化硅納米顆粒的制備 精確稱量20 mg硫酸慶大霉素，溶解在3.4 ml 25% 氨水溶液中，將上述溶液滴加在75 ml無水乙醇中，最后緩慢加入200 μl正硅酸乙酯，磁力攪拌下劇烈反應(yīng)24 h。15 000 r/min高速離心分離收集制備好的納米粒，用去離子水反復(fù)清洗5次，真空冷凍干燥后備用。

1.2.2 載藥納米顆粒的粒徑分析 取2 mg 凍干后的載藥納米顆粒超聲分散在1 ml去離子水中，用納米粒徑分析儀進(jìn)行粒徑分析，重復(fù)3 次后計算均值。

1.2.3 載藥納米顆粒的表面形貌觀測 取2 mg 凍干后的載藥納米顆粒超聲分散在1 ml去離子水中，滴加10 μl于蓋玻片上，真空干燥后表面噴金，置于場發(fā)射掃描電鏡下進(jìn)行形貌觀測。

1.3 各實驗組鈦板試件的制備及表面形貌觀測

1.3.1 光滑組鈦板試件的制備 取純鈦板90 枚，在流水下依次用600、800、1000、2000、3000、5000、7000目碳化硅砂紙打磨拋光，然后用無水乙醇、丙酮和去離子水超聲清洗10 min，干燥后備用。

1.3.2 微弧氧化組鈦板試件的制備 按照0.04 mol/L β-GP和0.2 mol/L CA的配方制備電解液10 L，然后取上述干燥好的光滑鈦板60 枚放入電解液中，以純鈦片為陽極，不銹鋼鍋為陰極，采用脈沖直流電源進(jìn)行微弧氧化。電解參數(shù)為：電壓300 V,頻率600 Hz，占空比8%，時間5 min。制備完成后用無水乙醇和去離子水超聲清洗10 min，干燥后備用。

1.3.3 載藥涂層組鈦板試件的制備 精確稱量2 mg載藥納米二氧化硅顆粒，超聲分散于1 ml 0.1%明膠溶液中，然后用移液器吸取200 μl上述懸濁液滴加在微弧氧化組鈦板表面，將試件放在漩渦振蕩器上振蕩30 min；重復(fù)上述步驟，以使納米顆粒突破表面張力進(jìn)入微弧氧化的火山樣孔洞內(nèi)，4 ℃過夜干燥；將鈦板浸泡在2.5%明膠溶液中使明膠發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，再用無水乙醇漂洗3遍，干燥后備用[11]。

1.3.4 各實驗組鈦板試件表面形貌觀測 取各組實驗用鈦板試件5枚，表面噴金后放置在場發(fā)射掃描電鏡下進(jìn)行表面形貌觀測。

1.4 各實驗組鈦板試件體外抗菌性能的研究

1.4.1 金黃色葡萄球菌的培養(yǎng) 復(fù)蘇細(xì)菌于營養(yǎng)瓊脂平板上， 37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h后備用。

1.4.2 抑菌圈實驗 將復(fù)蘇的細(xì)菌用PBS緩沖液稀釋至細(xì)菌濁度計測定為108CFU/ml,再稀釋100 倍至濃度為106CFU/ml，用移液器吸取100 μl上述菌液滴加至營養(yǎng)瓊脂平板上，并涂布均勻。將鈷60 照射滅菌后的各實驗組鈦板各10 枚放置在涂有菌液的平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈并拍照。

1.5 載藥抗菌涂層鈦板的體外藥物釋放實驗

1.5.1 透析袋擴散法 將載藥抗菌涂層鈦板放置在裝有2 ml PBS緩沖液的透析袋內(nèi)，扎緊袋口后，再將透析袋轉(zhuǎn)移至放有48 ml PBS緩沖液的錐形瓶內(nèi)，密封后置于恒溫?fù)u箱內(nèi)恒速振蕩(37 ℃，150 r/min)。

1.5.2 藥物釋放研究 在預(yù)定的時間點從透析袋外緩沖液中取樣1 ml，并立即補充等量同質(zhì)同溫的PBS緩沖液。將取出的液體保存在4 ℃下，全部樣品取完后統(tǒng)一采取elisa kit法進(jìn)行藥物濃度測定，計算藥物釋放的劑量，并繪制釋放曲線。

2 結(jié) 果

粒徑分析顯示載藥納米顆粒的直徑為(298.1±12.2) nm。掃描電鏡下該納米顆粒為形狀均勻的圓球形，粒徑約為250 nm，與粒徑分析結(jié)果一致(圖 1)。

各實驗組鈦板試件的表面形貌見圖 1，光滑組表面僅可見少量方向相同的打磨痕跡；微弧氧化組表面凹凸不平，形成了火山口樣的孔洞，大小約為1～5 μm；載藥涂層組在火山樣的孔洞內(nèi)填滿了圓球狀的二氧化硅納米顆粒，高倍鏡下可以觀察到納米顆粒之間連接的明膠。

圖 1 試件表面形貌(SEM)

圖 2為各實驗組鈦板在涂有菌液的瓊脂平板上培養(yǎng)24 h后形成的細(xì)菌生長分布形態(tài)。光滑組和微弧氧化組鈦板周圍長滿了細(xì)菌；而微弧氧化組鈦板周圍由于慶大霉素的緩慢釋放，可以觀察到周圍形成的抑菌圈,直徑為(16.7±1.4) mm。

A: 載藥涂層組； B: 微弧氧化組; C: 光滑組

A: Antibacterial coating group； B: Titanium after micro-arc oxidation； C: Polished titanium group

Fig 2 Inhibition zone of the samples

圖 3為載藥抗菌鈦板中的慶大霉素在體外條件下的緩釋規(guī)律?？梢姂c大霉素隨著時間延長逐漸釋放，其緩釋時間可達(dá)28 d。

圖 3 載藥抗菌鈦板體外慶大霉素釋放曲線圖

Fig 3Invitrogentamycin release curve of antibacterial titanium specimen

3 討 論

3.1 種植體固位的贗復(fù)體修復(fù)失敗率高

良好的固位是贗復(fù)治療成功的基礎(chǔ)，因具備良好的生物相容性和力學(xué)性能，利用經(jīng)皮純鈦種植體固位已成為贗復(fù)最理想固位方式。但是由于種植體經(jīng)皮段直接面對外界環(huán)境，細(xì)菌可直接在種植體經(jīng)皮部位表面黏附增殖并形成生物膜[12-13]。生物膜形成后，細(xì)菌對宿主免疫系統(tǒng)和抗菌劑的抵抗力將大大增強，可以沿著種植體長軸繼續(xù)侵襲，破壞種植體與骨的結(jié)合界面，最終導(dǎo)致植體脫落，治療失敗[1-2]。并且一旦鈦種植體感染發(fā)生，徹底清除感染往往不可能。研究表明，因經(jīng)皮部位感染而導(dǎo)致的種植體失敗率為15%～20%，在有放療史的患者中，失敗率高達(dá)44.4%[14-16]。

3.2 目前常用的抗菌方法及缺陷

種植體表面藥物緩釋涂層能夠在種植體周圍局部形成高濃度的藥物環(huán)境，可以有效防止細(xì)菌的黏附定植及細(xì)菌生物膜的形成[3]。此前已有許多關(guān)于載抗生素、無機抗菌劑及抑菌肽涂層的文獻(xiàn)報道[4-6]，但是多集中在種植體與骨結(jié)合界面，對經(jīng)皮軟組織界面的相關(guān)研究甚少。且目前的抗菌藥物緩釋系統(tǒng)仍存在諸多問題，有的制備工藝過于復(fù)雜，在操作過程中可能導(dǎo)致藥物失效；無機抗菌劑的抗菌機制不明確，存在潛在的生物毒性；有的抗菌藥物釋放時間過短，不能有效預(yù)防細(xì)菌感染。

3.3 新型二氧化硅納米載體和抗菌藥物涂層的設(shè)計

二氧化硅納米顆粒因具有多種優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于藥物緩釋系統(tǒng)中[7],其降解產(chǎn)物為硅酸[17]，具有良好的生物相容性；并且原料豐富，價格低廉。本文通過在原料中加入慶大霉素的方法成功的制備出了載慶大霉素二氧化硅納米顆粒，由于這種方法未使用模版劑，因此在后續(xù)的實驗過程中不需要高溫焙燒或者萃取去除模版劑，這樣不但使得實驗步驟更加簡便，而且降低了藥物發(fā)生降解的可能性。該方法制備的納米顆粒，因內(nèi)部藥物濃度高，可在緩沖液體系中隨著藥物的擴散而逐漸降解[18]。并且通過調(diào)整各原料的比例，可以控制藥物的釋放速率和釋放劑量，以達(dá)到控釋的目的[10]。通過在純鈦鈦板表面進(jìn)行微弧氧化處理，其表面形成了直徑約1～5 μm的火山口樣微觀形貌，內(nèi)部可容納納米級的二氧化硅顆粒，本實驗采用振蕩交聯(lián)法[11]將納米粒用A型明膠固定在其中。當(dāng)明膠發(fā)生降解反應(yīng)時，載藥二氧化硅納米粒被逐漸釋放，可以進(jìn)一步延長藥物的作用時間[11]。

3.4 新型抗菌藥物涂層的抗菌效果

金黃色葡萄球菌是種植體經(jīng)皮部位感染最常見的病原菌[19]，因此本實驗中采取體外培養(yǎng)測定抑菌圈的方法測試了上述載藥二氧化硅明膠交聯(lián)涂層的抗菌性能，結(jié)果顯示，與光滑和單純微弧氧化對照組相比，新型抗菌涂層組鈦板周圍可見明顯的抑菌圈，而對照組未見，抑菌圈測量結(jié)果顯示直徑為(16.7±1.4) mm?？梢宰C明新型抗菌涂層組鈦板具備抑制細(xì)菌生長的性能，而光滑組和微弧氧化組則不能。這說明采用抗菌涂層處理可有效阻擋細(xì)菌入侵，減少軟組織反應(yīng)，為皮膚生長創(chuàng)造出一個良好的環(huán)境，從而促進(jìn)經(jīng)皮封閉，提高種植體成功率。

4 結(jié) 論

本文成功制備出一種新型可降解載藥二氧化硅納米粒，并應(yīng)用振蕩交聯(lián)法將其固定在純鈦微弧氧化處理后的火山口樣孔洞內(nèi)，形成抗菌涂層，實現(xiàn)了藥物的緩控釋放，并對金黃色葡萄菌的生長起到抑制作用，今后應(yīng)用于種植體經(jīng)皮部位的設(shè)計中，有望降低經(jīng)皮種植體的感染率，提高顏面贗復(fù)用經(jīng)皮種植體成功率。

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(收稿： 2016-09-18 修回： 2016-11-08)

Investigationofsilicabasedantibacterialcoatingonpercutaneoustitaniumimplants

WANGJia1,WUGuofeng2,SUNGuanyang1,ZHAOYimin1,WEIHongbo3.

1. 710032Xi'an,StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatologyamp;NationalClinicalResearchCenterForOralDiseaseamp;ShaanxiKeyLaboratoryofOralDiseases,DepartmentofProsthodontics,SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,China; 2.NanjingStomatologicalHospital,MedicalSchoolofNanjingUniversity; 3.StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatologyamp;NationalClinicalResearchCenterForOralDiseaseamp;ShaanxiEngineeringResearchCenterforDentalMaterialsandAdvancedManufacture，DepartmentofOralImplant,SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an

Objective: To study the antibacterial effect of self-decomposable silica nanoparticle coating on pure titanium percutaneous implant.MethodsGentamycin loaded silica nanoparticles were prepared using non-template method, the characterization of the particles was analyzed by size analyzer and field emission scanning electron microscope(FESEM). Then the drug-loaded nanoparticles were cross-linked onto the titanium after micro-arc oxidation treatment and observed by SEM. After that, antibacterial properties of the treated specimens against Staphylococcus aureus were investigated by measuring the diameter of bacterial inhibition zone. Finally, drug release of the antibacterial coating specimen was carriedinvitro.ResultsThe spherical silica nanoparticles were (298.1±12.2) nm in diameter. The nanoparticles were fixed within the holes of micro-arc oxidation titanium after oscillation and crosslink. While bacterial inhibition zone was not observed in the control group, there was a bacteriostatic area in the diameter of(16.7±1.4) mm around the antimicrobial coating specimen. The silica nanoparticles-loaded antibacterial coating specimen could effectively release gentamycin for up to 28 days.ConclusionAn antimicrobial coating based on self-decomposable silica nanoparticles can be prepared on titanium substrates, which can realize control release of gentamycin as well as retard bacterial growth. It is expected to apply in designing percutaneous implants in the future.

Silicananoparticles;Controlreleaseofdrug;Percutaneousimplants;Antibacterial

國家自然科學(xué)基金(編號： 81300918)

710032 西安, 軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心,陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室,第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科(王嘉 孫冠陽 趙銥民)； 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院， 南京市口腔醫(yī)院(吳國鋒)； 軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 陜西省口腔生物工程技術(shù)研究中心,第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔種植科(魏洪波)

魏洪波 E-mail： weihongbo101@gmail.com

R783.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.001