薛學(xué)彬++房樹華++汪華君

[摘要] 目的 探討黃精多糖（PSP）體外抗氧化作用及其對小鼠炎癥性腸病是否具有保護(hù)作用。 方法 體外抗氧化實(shí)驗觀察PSP對羥自由基（·OH）的產(chǎn)生、·OH對紅細(xì)胞破壞作用及肝勻漿脂質(zhì)產(chǎn)生是否具有抑制作用；建立小鼠炎癥性腸病模型并給予PSP治療，觀察小鼠疾病活動度積分（DAI）評分，檢測小鼠結(jié)腸組織中MDA、SOD、MPO，并應(yīng)用Western blot對小鼠結(jié)腸組織中NF-κB蛋白表達(dá)進(jìn)行測定。 結(jié)果 PSP在體外對·OH的產(chǎn)生及·OH對紅細(xì)胞破壞具有抑制作用（P<0.01）、抑制肝勻漿脂質(zhì)過氧化過程（P<0.01），且其體外抗氧化作用具有劑量依賴性（P<0.05～0.01）；與模型組相比，PSP能降低DAI評分（P<0.01）、抑制結(jié)腸組織中MDA、MPO產(chǎn)生（P<0.05～0.01），增加SOD含量（P<0.05），并對NF-κB蛋白表達(dá)具有抑制作用（P<0.05）。 結(jié)論 黃精多糖具有體外抗氧化作用，其對小鼠炎癥性腸病的抑制作用可能是抑制NF-κB通路，通過減少M(fèi)DA、MPO產(chǎn)生和增加SOD含量實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞] 黃精多糖；炎癥性腸??；體外抗氧化能力；NF-κB通路

[中圖分類號] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）29-0027-04

Study on the antioxidant effect in vitro of polygonatum sibiricum polysaccharides and its effect on inflammatory bowel disease in mice

XUE Xuebin1 FANG Shuhua2 WANG Huajun3

1.Department of Drug and Equipment， Zhenjiang Second Peoples Hospital in Jiangsu Province， Zhenjiang 212000， China； 2.Department of Pharmacy， Zhenjiang First Peoples Hospital in Jiangsu Province， Zhenjiang 212000， China； 3.Department of Pharmacy， the Affiliated Hospital of Jiangsu University， Zhenjiang 212001， China

[Abstract] Objective To investigate the anti-oxidative effects of polygonatum sibiricum polysaccharides（PSP） in vitro and its protective effect on inflammatory bowel disease in mice. Methods In vitro anti-oxidative experiment was carried out to observe the effect of PSP on the generation of hydroxyl radical（·OH）， the effect of ·OH on the destruction of erythrocytes and whether lipid production of liver homogenate had inhibitory effect. The model of mice inflammatory bowel disease was established and was given PSP treatment. Mice disease activity score（DAI） was calculated， MDA， SOD and MPO in colonic tissue of mice were detected， and the expression of NF-κB protein in the colonic tissue of mice was determined. Results PSP showed inhibitory effect on the generation of ·OH in vitro and ·OH showed inhibitory effect on the destruction of erythrocytes（P<0.01）， which inhibited liver homogenate lipid peroxidation process（P<0.01）， and its in vitro anti-oxidant effect was dose-dependent（P<0.05-0.01）. Compared with the model group， PSP can reduce the DAI score（P<0.01）， inhibit the generation of MDA and MPO in colonic tissues（P<0.05-0.01）， and increase the content of SOD（P<0.05）. It also showed inhibitory effect on the NF-κB protein expression（P<0.05）. Conclusion Polygonatum sibiricum polysaccharide has antioxidant effect in vitro. Its inhibitory effect on mice inflammatory bowel disease may be the inhibition pathway of NF-κB， which is achieved by reducing the MDA， MPO production and increasing the SOD content.endprint

[Key words] Polygonatum sibiricum polysaccharides （PSP）； Inflammatory bowel disease； In vitro anti-oxidative ability； NF-κB pathway

近年來，炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）在我國發(fā)病率呈明顯增高趨勢。IBD是一種慢性非特異性炎癥，可造成組織損傷和功能障礙[1]。目前，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。已有研究表明，活性氧（reactive oxygen species，ROS）在免疫和炎性反應(yīng)通路中發(fā)揮了重要作用，其在IBD的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用[2]。

黃精多糖（polygonatum sibiricum polysaccharide，PSP）是黃精的主要生物活性成分之一，系中藥黃精中主要生物活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、降脂降糖、改善學(xué)習(xí)記憶、抗炎抑菌等功效[3-5]。但黃精多糖對IBD的作用尚未見研究報道。

本實(shí)驗擬考察黃精多糖體外抗氧化作用，建立小鼠IBD模型，觀察黃精多糖干預(yù)后，小鼠結(jié)腸中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、髓過氧化物酶（MPO）和核因子κB（NF-κB）的變化，探討黃精多糖對IBD小鼠是否具有保護(hù)作用及其機(jī)制，為黃精多糖的藥用價值開發(fā)與臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物、試劑與藥品

雄性昆明小鼠24只，SPF級，18～22 g（大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心）；黃精多糖（純度≥90%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號：ZL20160315012）；2，4-二硝基苯磺酸（dinitrobenzenesulfonic acid，DNBS，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，批號：A91321）BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶（SOD）（南京建成生物工程研究所）；髓過氧化物酶（MPO）（南京建成生物工程研究所）；β-actin一抗、NF-κB一抗、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠 IgG-HRP、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），其余試劑均為化學(xué)分析純。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 黃精多糖體外抗氧化實(shí)驗研究 參照文獻(xiàn)[6-8]，進(jìn)行PSP體外抗氧化實(shí)驗研究。分別采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測黃精多糖對羥自由基（·OH）產(chǎn)生的抑制作用（PSP濃度：20 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL）；硫代巴比妥酸（TBA）法檢測黃精多糖對家兔肝臟脂質(zhì)過氧化物的抑制作用（PSP濃度：5.65 μg/mL、28.25 μg/mL、56.50 μg/mL、113.00 μg/mL）以及黃精多糖對羥自由基引發(fā)家兔紅細(xì)胞膜破裂的抑制作用（PSP濃度：5.71 μg/mL、28.57 μg/mL、57.14 μg/mL、114.28 μg/mL）。

1.2.2 黃精多糖對IBD小鼠的作用研究

1.2.2.1 分組與模型制備 參照相關(guān)文獻(xiàn)[9，10]，將小鼠分為三組（空白對照組、模型組、PSP給藥組），每組8只，小鼠禁食不禁水24 h后，5%水合氯醛，400 mg/kg，ip，小鼠麻醉后，3.5F導(dǎo)管從肛門插入腸道深約4.5 cm，模型組及PSP給藥組灌注100 μL DNBS/乙醇溶液（含4 mg DNBS的50%乙醇溶液），空白對照組灌注100 μL50%乙醇溶液，倒立15 min，之后將小鼠放入籠中自然蘇醒。1 h后，PSP給藥組小鼠先給予PSP溶液2600 mg/kg灌胃，空白對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，之后，PSP或生理鹽水連續(xù)灌胃7 d，每日1次。

1.2.2.2 小鼠疾病活動評估 疾病活動情況的評估觀察小鼠進(jìn)食、飲水、活動等一般情況，稱量體重，觀察糞便性狀，參照Hamamoto標(biāo)準(zhǔn)，計算各組小鼠疾病活動度積分（disease activity index，DAI）。見表1。

表1 疾病活動度積分評分

注：*正常大便：軟硬適度，成形大便；松散大便：糊狀、半成形大便，但不粘附于肛門；稀便：黏附于肛門、稀水樣便

1.2.2.3 結(jié)腸組織MDA、SOD、MPO的檢測 最后一次給藥前禁食不禁水18 h，第7天給藥后1 h，將各組小鼠脫頸處死，打開腹腔，找到回盲部，自回盲腸后端1 cm向下取5～6 cm結(jié)腸，PBS沖洗內(nèi)容物，液氮速凍，-80℃保存，備用。參照MDA、SOD、MPO檢測試劑盒說明書，檢測結(jié)腸組織中MDA、SOD、MPO含量。

1.2.2.4 結(jié)腸組織NF-κB蛋白表達(dá)的檢測 取材方法同上，將結(jié)腸組織用Western及IP細(xì)胞裂解液后研磨，致組織樣品完全裂解，12 000×g 離心15 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，加入2×loading buffer，100℃煮沸5 min變性，分裝，-20℃保存。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，NF-κB一抗（1∶1000）4℃封閉過夜。1∶1000二抗常溫封閉2 h，ECL曝光顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

各組實(shí)驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，采用One-way ANOVA法進(jìn)行方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PSP體外抗氧化作用研究

PSP體外抗氧化實(shí)驗結(jié)果表明，PSP對·OH產(chǎn)生、·OH誘導(dǎo)家兔紅細(xì)胞破裂以及家兔肝勻漿脂質(zhì)過氧化均具有明顯抑制作用（P<0.01），且具有劑量依賴性（P<0.05～0.01）（表2～4、圖1）。endprint

2.2 小鼠疾病活動力評估

經(jīng)7 d PSP給藥后，記錄各組小鼠體征，計算各組小鼠疾病活動度積分（disease activity index，DAI）并進(jìn)行比較，可見經(jīng)DNBS灌腸后，小鼠出現(xiàn)體重減輕，稀便、便血（便隱血）增多，DAI評分升高。與空白對照組DAI評分0分相比，模型組DAI評分[（3.29±0.70）分]明顯升高（P=0.0000），提示小鼠出現(xiàn)明顯結(jié)腸炎癥；與模型組相比，PSP給藥組DAI評分[（1.57±0.90）分]顯著降低（P=0.008），提示PSP對小鼠結(jié)腸炎癥具有緩解作用。

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織中MDA、SOD、MPO的測定

經(jīng)7 d PSP給藥后，取各組小鼠結(jié)腸組織，檢測各組小鼠結(jié)腸組織中MDA、SOD和MPO含量，結(jié)果如表5所示，與空白對照組相比，模型組MDA、MPO明顯增多（P<0.01），SOD含量明顯減少（P<0.01）；與DNBS組相比，PSP給藥組MDA、MPO含量減少（P<0.05～0.01），SOD含量明顯增多（P<0.05）。

2.4 各組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB蛋白含量測定

經(jīng)7 d PSP給藥后，取各組小鼠結(jié)腸組織，Western-blot檢測小鼠結(jié)腸組織中NF-κB蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖2所示，與空白對照組[（12.09±5.31）%]相比，模型組NF-κB表達(dá)[（75.45±10.11）%]顯著增多（P=0.005）；與模型組相比，PSP給藥組NF-κB表達(dá)顯著減少（P=0.021）。

與空白對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05

圖2 NF-κB蛋白在小鼠結(jié)腸中的表達(dá)（x±s，n=8）

3 討論

2，4-二硝基苯磺酸（dinitrobenzenesulfonic acid，DNBS）是一種半抗原物質(zhì)，乙醇溶解腸黏膜表面的黏液，破壞腸黏膜屏障，使TNBS與腸道蛋白結(jié)合后成完全抗原，引起腸黏膜的免疫反應(yīng)，誘發(fā)結(jié)腸炎的發(fā)生。其發(fā)病機(jī)制、病理特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)均與炎癥性腸病相似，因此在對IBD治療藥物篩選與研究時，常用于動物模型的制備。

已有研究表明，氧化應(yīng)激損傷與IBD動物模型和IBD患者發(fā)病及疾病嚴(yán)重程度具有明顯相關(guān)性[11-15]。破壞結(jié)腸黏膜屏障功能、促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放、腸黏膜組織內(nèi)免疫調(diào)節(jié)紊亂等，同時炎癥介質(zhì)的釋放也會進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激損傷。因此將具有抗氧化作用藥物應(yīng)用于IBD的治療也是IBD藥物治療與研發(fā)的新途徑與新熱點(diǎn)。本實(shí)驗第一部分研究結(jié)果表明，PSP在體外對·OH的產(chǎn)生及·OH對紅細(xì)胞破壞具有抑制作用（P<0.01）、抑制肝勻漿脂質(zhì)過氧化過程（P<0.01），且其體外抗氧化作用具有劑量依賴性（P<0.05～0.01），提示PSP在體外具有良好的抗氧化活性，為其應(yīng)用于IBD的治療提供理論支持與實(shí)驗依據(jù)。

正常情況下機(jī)體內(nèi)活性氧簇（ROS）的產(chǎn)生與抗氧化保護(hù)機(jī)制處于平衡狀態(tài)。IBD患者腸黏膜層和黏膜下層中吞噬細(xì)胞大量增加，導(dǎo)致耗氧量增肌，引起黏膜細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷，同時生成具有更高活性的羥自由基（·OH），進(jìn)一步破壞腸道黏膜組織[16]。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，能引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合而失去活性，同時具有細(xì)胞毒性，能使腸黏膜組織損害進(jìn)一步加重。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，其在體內(nèi)水平的高低是機(jī)體抗氧化作用能力的重要體現(xiàn)。MDA與SOD是評價組織氧化損傷的重要指標(biāo)，其含量反映了組織中過氧化損傷程度與抗氧化能力的高低。MPO是一種催化過氧化物還原的酶，是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞氧依賴性殺菌系統(tǒng)的重要組分，同時也是氧化應(yīng)激的一個主要標(biāo)志物，可以催化產(chǎn)生次氯酸、酪氨?；⑾趸野彼岬妊趸a(chǎn)物。MPO水平與中性粒細(xì)胞激活程度具有顯著的相關(guān)性。MPO在結(jié)腸中的活性與組織中中性粒細(xì)胞浸潤程度呈線性相關(guān)[17]。當(dāng)細(xì)胞MPO水平升高時，可促進(jìn)炎癥效應(yīng)細(xì)胞的增殖與活化，使效應(yīng)細(xì)胞更易于穿越內(nèi)皮屏障到達(dá)局部炎癥組織，可進(jìn)一歩導(dǎo)致結(jié)腸炎癥的形成[18]。

本實(shí)驗結(jié)果表明，與空白對照組相比，模型組結(jié)腸組織MDA、MPO顯著增多（P<0.01），SOD含量顯著下降（P<0.01），提示在小鼠IBD模型中，結(jié)腸組織出現(xiàn)了明顯的氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)。與模型組相比，PSP給藥組能降低DAI評分（P<0.01）、抑制結(jié)腸組織中MDA、MPO產(chǎn)生（P<0.05～0.01），增加SOD含量（P<0.05），提示PSP能緩解IBD結(jié)腸炎癥反應(yīng)，可能是通過降低結(jié)腸氧化應(yīng)激損傷與炎癥反應(yīng)，提高結(jié)腸組織抗氧化能力實(shí)現(xiàn)的。

NF-κB是多條氧化應(yīng)激與炎癥信號通路中一個重要的匯聚點(diǎn)，是許多炎癥介質(zhì)在基因水平的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。已有研究結(jié)果表明，在IBD動物模型和患者中，NF-κB可以調(diào)節(jié)與IBD相關(guān)的促炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、IL-6及IL-12等的釋放，加重腸道的炎性反應(yīng)；提示NF-κB的激活在調(diào)節(jié)IBD的免疫及炎性反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[19-20]。當(dāng)結(jié)腸受到炎癥或內(nèi)毒素等刺激侵襲后，NF-κB被激活后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，促進(jìn)炎癥介質(zhì)MPO、TNF-α等的表達(dá)[21]。NF-κB與IBD的病變程度呈現(xiàn)明顯相關(guān)性，因此尋找NF-κB抑制劑也成為治療IBD的新熱點(diǎn)。本實(shí)驗結(jié)果表明，與模型組相比，PSP給藥組對NF-κB蛋白表達(dá)具有抑制作用（P<0.05），提示PSP可能會通過NF-κB通路減少氧化應(yīng)激損傷與結(jié)腸炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)黃精多糖具有體外抗氧化作用，其對小鼠炎癥性腸病的抑制作用可能是通過抑制NF-κB通路，減少M(fèi)DA、MPO產(chǎn)生，增加SOD含量，減少結(jié)腸氧化損傷，提高結(jié)腸抗氧化能力，減輕腸道炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗的發(fā)現(xiàn)為黃精多糖藥理作用的進(jìn)一步開發(fā)與研究及未來臨床應(yīng)用提供理論支持。endprint

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（收稿日期：2017-08-31）endprint