丁宇，楊磊，王晨光，田愷，劉鳳娟，于燕燕

（天津出入境檢驗檢疫局工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津300308）

食品級過氧化氫在細(xì)胞水平的毒理學(xué)研究

丁宇，楊磊，王晨光，田愷，劉鳳娟，于燕燕

（天津出入境檢驗檢疫局工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津300308）

過氧化氫作為強(qiáng)氧化劑的代表物之一，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，起到防腐、漂白、除臭等作用。而食品中殘留及非法添加的過氧化氫對消費(fèi)者健康存在著嚴(yán)重危害。近年來，細(xì)胞毒理學(xué)作為一門熱門學(xué)科，用于研究外源性物質(zhì)對生命細(xì)胞損傷作用規(guī)律及其機(jī)制，從而進(jìn)行食品安全性分析，具有準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)等特點，在食品安全檢測和研究領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化以及細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)研究食品級過氧化氫的危害。

過氧化氫；細(xì)胞毒理學(xué)；食品安全

過氧化氫（H2O2）以其優(yōu)良的氧化、漂白、消毒作用，廣泛運(yùn)用在各類化工、食品、紡織、醫(yī)藥、電子及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域[1]。近年來，隨著我國食品行業(yè)不斷發(fā)展，食品級過氧化氫在食品領(lǐng)域中的礦泉水、乳品、飲料、水產(chǎn)品、水果、啤酒等食品生產(chǎn)過程中廣泛運(yùn)用。由于利益驅(qū)使及監(jiān)管不足的內(nèi)外因素，導(dǎo)致其在食品工藝中存在超標(biāo)添加的問題，進(jìn)而引發(fā)各類食物中毒事件。例如利用過氧化氫加工雞爪、泡椒魚皮、漂白開心果等。按照我國近年所頒布的食品添加劑運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，過氧化氫在達(dá)到食品級別的要求下，可用于食品加工制備，不過在制成出售前，要求能及時清除，并嚴(yán)格檢測，只有在其含量達(dá)標(biāo)的情況下，才可以銷售。

在發(fā)達(dá)國家，過氧化氫的使用在劑量、使用范圍、都受到嚴(yán)格監(jiān)督。在我國，當(dāng)前百姓越來越關(guān)注健康問題，對于各類食品添加劑的殘留也越來越重視，眾多實驗證實，一旦人體攝入過量的過氧化氫，必定會造成身體的傷害，包括對細(xì)胞的損害，加速人體衰老、及引發(fā)器官癌變等[2]，尤其是其能產(chǎn)生過量的羥基自由基，將參與到人體內(nèi)的羥基化反應(yīng)及電子轉(zhuǎn)移，造成人體細(xì)胞的壞死或病變，從而危害人體健康，屬于毒性各類毒性中的最大自由基。

相關(guān)研究顯示，過氧化氫的檢測方式很多，包括化學(xué)滴定法、分光光度法、高效液相色說來法、熒光光度法、電化學(xué)分析法等[3-4]。近年來，隨著細(xì)胞水平毒理學(xué)檢測與研究逐漸興起，通過對外源性毒害因子所產(chǎn)生的致癌性，對機(jī)體細(xì)胞毒性和特異細(xì)胞毒作用、毒物代謝及其毒效應(yīng)的作用機(jī)制的等方式，來開展藥物篩選、食品安全性分析。此外，細(xì)胞培養(yǎng)還將對功能食品的效果成分展開毒性評價[5-8]?，F(xiàn)階段，有關(guān)細(xì)胞毒理學(xué)已在食品界獲得廣泛運(yùn)用，細(xì)胞毒理學(xué)透過離體培育的細(xì)胞不僅能用作研究目標(biāo)毒物對于靶細(xì)胞毒性和其毒物于細(xì)胞內(nèi)展開的生物轉(zhuǎn)化[9-10]。還可用作研究目標(biāo)毒物對靶細(xì)胞的功能，通過細(xì)胞毒理學(xué)有助于有效評價食品安全性，達(dá)到檢測食物中的毒素、重金屬及農(nóng)藥殘留、添食品加劑等[11-13]。

本文利用細(xì)胞毒理學(xué)中的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化以及細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)研究食品級過氧化氫的危害。

1 材料

1.1 材料與試劑

無鈣臺氏液：135 mmol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，1.0 mmol/L MgCl2，0.33 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，5.5 mmol/L葡萄糖，用NaOH溶液調(diào)至pH7.4；含鈣臺氏液：于無鈣臺氏液中加進(jìn)CaCl2至1.8 mmol/L；KB液：50 mmol/L聚谷氨酸，40 mmol/L KCl，20 mmol/L ?；撬幔?0 mmol/L KH2PO4，10 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L HEPES，0.5 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA），3 mmol/L MgCl2，以 KOH 溶液調(diào)pH7.4；膠原酶、蛋白酶：日本公司 Yakult公司；H2O2、5，5'-二硫雙（2-硝基苯甲酸）：Sigma Aldrich公司。

1.2 儀器

Facscan流式細(xì)胞儀：美國Dickinson公司；HHS電熱恒溫水浴鍋：天津市華北實驗儀器有限公司；FV300激光掃描共聚焦顯微鏡：日本Olympus公司；311A細(xì)胞培養(yǎng)箱：日本ESPC公司；3K15離心機(jī)：德國sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 心肌細(xì)胞分離

試驗選擇選用健康成年豚鼠（300 g～400 g），1%戊巴比妥鈉按進(jìn)行腹腔注射麻醉后，取出心臟并將主動脈連于Langendorff灌流裝置中，維持37℃恒溫及供氧條件以含鈣臺氏液連續(xù)灌流約3 min（沖洗心臟內(nèi)殘血，予以細(xì)胞更加充裕的氧），無鈣臺氏液灌流約6 min（解除心肌細(xì)胞內(nèi)橋粒與連接），以含0.05%膠原酶無鈣臺氏液灌流到心室肌組織被消化（解離細(xì)胞間結(jié)締組織）；以KB液灌流沖洗并剪碎其中的心室肌組織，再機(jī)械分散至單個細(xì)胞，接著以濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，再以0.002 5%蛋白酶孵育3 min；離心3次（每次3 min）；所得細(xì)胞存儲在KB液，將溫度調(diào)至4℃保存。

1.3.2 細(xì)胞鈣瞬變的測定

將制備而成豚鼠心肌細(xì)胞內(nèi)加進(jìn)二甲基亞砜（DMSO）溶液，將其稀釋至 25 μmol/L 的 Fluo-340 μL染色，此后將培養(yǎng)皿放置在37℃水浴箱內(nèi)，避光水浴30 min后，加進(jìn)無鈣液400 μL沖洗2次；通過激光掃描共聚焦顯微鏡，于視野下找出細(xì)胞（挑選出其中形態(tài)良好、染色程度最好的），以該顯微鏡展開實時監(jiān)測心肌細(xì)胞產(chǎn)生的熒光值變化并記錄下來，即為鈣離子的濃度變化。

參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長（λex）488 nm，發(fā)射波長（λem）520 nm。分別加進(jìn)濃度5 mmol/L的過氧化氫10、20、30μL，通過氧化氫終濃度：0.125、0.25、0.375 mmol/L，運(yùn)用Time Coursw程序進(jìn)行平面掃描，各試驗組均掃描60張，每張間隔10 s，持續(xù)性觀察各試驗組500 s內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度（FI）產(chǎn)生的變化情況。

1.3.3 細(xì)胞凋亡率

將心肌細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，隨機(jī)分成NC組，0.1、0.25、0.5 mmol/L H2O2處理組，分別作用 1、3、6、12 h，隨后通過（AO/EB）染色法展開檢測。用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行拍照，通過200個細(xì)胞計算凋亡率。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

將每10秒所對應(yīng)鈣離子熒光值減掉基線鈣離子熒光值，所獲得的數(shù)據(jù)作為某時鈣瞬變熒光強(qiáng)度，取其中50個時間點并計算平均值，代表鈣瞬變熒光強(qiáng)度值。透過統(tǒng)計學(xué)處理，正態(tài)分布計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，針對多樣本比較運(yùn)用單因素方差法展開分析，以P<0.05代表具統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 心肌細(xì)胞鈣瞬變

不同濃度H2O2對豚鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變影響見表1、圖 1。

表1 不同濃度H2O2對豚鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變影響Table 1 Different concentrations of H2O2induced Intracellular Ca2+transient

圖1 0.1、0.25、0.5 mmol/L H2O2對豚鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變Fig.1 Intracellular Ca2+transient induced by 0.1，0.25，0.5 mmol/L H2O2

由表1可見，在加入3種不同濃度（0.1、0.25、0.5 mmol/L）H2O2引起鈣瞬變增加，而且隨濃度升高而增加，統(tǒng)計學(xué)比較差異顯著（P<0.01）分別為84.07±19.68，269.82±59.61，478.09±87.15。心肌細(xì)胞作為終末分化細(xì)胞，正常情況下不存在明顯的凋亡。

2.2 細(xì)胞凋亡

H2O2各劑量組的細(xì)胞凋亡率和空白對照組展開比較，差異均具統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在作用時間1、3 h下H2O2組均伴隨H2O2濃度增大，豚鼠心肌細(xì)胞凋亡率隨之增大；作用到6 h時，0.25 mmol/L劑量組細(xì)胞凋亡率達(dá)到最高值23.3%，該峰值后細(xì)胞凋亡率便隨H2O2濃度增大而下降；作用12 h的H2O2組隨H2O2濃度增大，細(xì)胞凋亡率隨之增大，至0.25 mmol/L時凋亡率達(dá)18.9%的峰值，此后隨H2O2濃度增大反下降。

心肌細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，在正常情況下是無明顯凋亡的。不過疾病狀態(tài)之下，比如心肌梗塞、缺血、缺氧及再灌注損傷，心肌細(xì)胞將產(chǎn)生顯著凋亡；本結(jié)果證實低劑量（0.1、0.25、0.5 mmol/L）H2O2可明顯強(qiáng)化心肌細(xì)胞鈣離子濃度，同時還有著時間和劑量依賴性，從而可誘導(dǎo)產(chǎn)生心肌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而對整個人體健康造成危害[14-15]。

H2O2對豚鼠心肌細(xì)胞凋亡率影響見表2。

表2 H2O2對豚鼠心肌細(xì)胞凋亡率影響Table 2 Flow cytometry analyses of cell apoptosis induced by H2O2

3 結(jié)論

1）Ca2+屬于眾多細(xì)胞凋亡信號載體，對于細(xì)胞生存和凋亡存在重要作用[16-18]，本試驗通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察心肌細(xì)胞熒光值變化，代表鈣離子濃度變化，發(fā)現(xiàn)0.1、0.25、0.5 mmol/L H2O2能明顯增加心肌細(xì)胞的鈣離子濃度，并且呈時間及劑量依賴性。

2）豚鼠心肌細(xì)胞在 0.1、0.25、0.5 mmol/L H2O2影響下DNA凋亡率隨著暴露劑量增加而增加。

本試驗中的過氧化氫作為外源性活性氧，進(jìn)入人體內(nèi)后可作為信號，通過誘導(dǎo)線粒體的通透性轉(zhuǎn)為變孔開放，推動線粒體的鈣離子內(nèi)流，同時令細(xì)胞自身線粒體和其它線粒體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激反應(yīng)是透過影響電壓的依賴性鈣離子通道從而令非特異性細(xì)胞膜鈣離子通透性產(chǎn)生變動及產(chǎn)生鈉鈣離子交換等，進(jìn)而影響鈣離子（Ca2+）由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放[19]，進(jìn)而破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+穩(wěn)態(tài)，促發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)超負(fù)荷反應(yīng)[20]。由此可判定外源性過氧化氫透過心肌細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)受損，造成內(nèi)源性活性氧生成的增加，進(jìn)而出現(xiàn)氧化應(yīng)激，推動細(xì)胞內(nèi)鈣離子的重新分布，最終誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。

本文利用細(xì)胞毒理學(xué)中的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化以及細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)，研究食品級過氧化氫的對豚鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變以及細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制，為今后食品級過氧化氫檢測及毒理學(xué)研究提供參考。

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Toxicological Studies on Food Grade Hydrogen Peroxide at Cell Level

DING Yu，YANG Lei，WANG Chen-guang，TIAN Kai，LIU Feng-juan，YU Yan-yan
（Technical Center for Safety of Industrial Products of Tianjin Enter-Exit Inspection Quarantine Bureau，Tianjin 300308，China）

As one of the representative of strong oxidizing agent，hydrogen peroxide is widely used in the food industry.However，there is a serious harm to the health of consumers in the food residue and illegally added hydrogen peroxide.In recent years，as a hot subject，cellular toxicology has been used to study the law and mechanism of the damage of exogenous substances on living cells which has a good application prospect in the field of food safety detection and research.In this paper，the changes of cell morphology and cell apoptosis were used to study the harm of food grade hydrogen peroxide.

hydrogen peroxide；cell toxicology；food safety

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.038

丁宇（1980—），男（漢），高級工程師，研究生，研究方向：危險品檢測。

2017-03-23