宋萍 李維杰 周新麗 劉寶林

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海 200093）

人肝癌細胞Hep?G2的冷凍干燥保存初探

宋萍 李維杰 周新麗 劉寶林

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海 200093）

冷凍干燥是長期有效保存細胞的手段之一。本文以肝癌細胞Hep?G2為研究對象，選取了不同體積分數(shù)的Me2SO、丙三醇及不同質(zhì)量濃度的PVP、復(fù)方保護劑進行冷凍干燥保存，篩選出最佳保護劑配方。此外，將細胞在不同摩爾濃度的海藻糖溶液中孵育，通過檢測細胞回收率、存活率和24 h貼壁率，探究胞內(nèi)海藻糖對細胞冷凍干燥的影響。結(jié)果表明：添加40%PVP（w/v）＋10%甘油（v/v） ＋15%FBS（v/v） ＋20%海藻糖（w/v）保護劑的細胞，在復(fù)水后回收率、存活率和 24 h貼壁率分別為29.58%、42．18%和18．71%，與對照組相比三項指標(biāo)均得到有效提高，該種保護劑的效果最佳；當(dāng)胞外海藻糖摩爾濃度為800 mmol/L時，凍干效果最好，肝癌細胞Hep?G2在復(fù)水后回收率、存活率和24 h貼壁率分別為27．81%，66．65%和33．68%，存活率和貼壁率顯著高于其他組。

冷凍干燥；凍干保護劑；細胞；存活率

長期有效的保存細胞在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域具有重要意義，并一直受到廣泛關(guān)注。目前常用的方法是低溫保存，但該種手段液氮耗費多，對設(shè)備要求高，運輸過程還可能因為震蕩而造成細胞破損，維護及保存條件也較為苛刻。且在低溫保存期間，細胞活力、免疫力等均有不同程度的下降，對研究樣本有一定的損傷。而細胞的真空冷凍干燥是先將細胞進行低溫凍結(jié)，再通過降壓直接將冰晶除去，從而達到干燥細胞的目的。相比于細胞的低溫保存，真空冷凍干燥有顯著優(yōu)勢：去除樣品中90%以上的水分，使樣品可以長期保存；避免微生物的滋長；質(zhì)量輕便，大大降低了運輸保存的難度；凍干后的樣品形態(tài)外觀基本沒有改變，極大的保存了細胞原有的活性和特性等。所以，利用凍干的方法保存細胞也受到了研究者的極大關(guān)注。肝癌細胞Hep?G2不但可以連續(xù)傳代不斷增殖，而且具有肝細胞的各種特異性功能以及體細胞的基本特征，實現(xiàn)冷凍干燥，對凍干保護劑配方選擇以及機理上的認知提供了一定的參考，更有利于今后拓展其他體細胞的凍干保存。

對于人體細胞凍干，目前報道較多的為人血液細胞、組織細胞的凍干。 I．Bakaltcheva等［1］嘗試對紅細胞凍干后，血紅蛋白恢復(fù)率高達95%?？茖W(xué)家在保護劑的選擇上發(fā)現(xiàn)，海藻糖對細胞膜和蛋白質(zhì)有著很好的抗逆保護作用［2－3］。 G．R．Satpathy 等［4］成功將海藻糖載入到紅細胞內(nèi)，且凍干后紅細胞的恢復(fù)率達到40%。對于人血小板的研究，早在1956年就開始進行嘗試，但效果并不理想［5］。W．F．Wolkers等［6］實驗發(fā)現(xiàn)，海藻糖可以通過內(nèi)吞作用進入到血小板內(nèi)。Zhang Shaozhi等［7］提出超聲波可以強化海藻糖進入血小板中，范菊莉等［8］使用超聲波對凍干血小板做預(yù)處理，達到了強化海藻糖負載入血小板中的效果，進一步為凍干血小板提供了參考。由于臍帶血中含有大量的造血干細胞，肖洪海等［9］首次實現(xiàn)了人臍帶全血和單核細胞凍干的研究。1953年，Stocker發(fā)現(xiàn)，角膜內(nèi)皮細胞是維持角膜透明的基礎(chǔ)，成功保存角膜內(nèi)皮細胞成為了研究熱點。楊宏偉等［10］通過光鏡、電鏡酶組織化學(xué)方法探討了凍干角膜內(nèi)皮細胞的有效性，推測該方法有望成為角膜長期保存的新手段。

在生物樣品凍干的過程中，常常需要添加凍干保護劑。糖類，尤其是海藻糖，因其自身特殊的結(jié)構(gòu)，可以在凍干過程中有效保護細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)不受破壞，保持生物膜的完整性而成為生物制品凍干中常用的保護劑之一［11］。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是一種非滲透凍干保護劑，因可以提高溶液的黏度，顯著提高溶液的玻璃化程度而被廣泛應(yīng)用［12］；胎牛血清（FBS）中含有大量細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)［13］，可以在復(fù)水過程中大大提高細胞存活率，因此受到研究者們的青睞；甘油作為滲透性保護劑，可以進入胞內(nèi)而提供良好的保護效果［14－15］，也是近年來凍干保護劑選擇的熱點；而低體積分數(shù)的二甲基亞砜（Me2SO）更是在凍結(jié)過程中對細胞起到巨大的保護作用［16］。

因此，本文以肝癌細胞Hep?G2為對象，初步探索肝癌細胞Hep?G2的真空冷凍干燥，選取了海藻糖、PVP、FBS、甘油及Me2SO作為保護劑，探討不同種類和不同質(zhì)量濃度或體積濃度的保護劑效果，尋找合適的凍干保護劑配比，同時，將細胞置于不同摩爾濃度的海藻糖溶液中，以肝癌細胞復(fù)水后的回收率、存活率及24 h貼壁率為指標(biāo)，探討胞內(nèi)海藻糖對凍干肝癌細胞的影響，為今后凍干其他細胞提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料：人肝癌細胞Hep?G2（購于中科院）。

主要試劑：胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）；Dulbecco’s Modified Eagle Medium （DMEM）培養(yǎng)基（GIBCO公司）；二甲基亞砜（Me2SO）（德國APPLICHEM公司）；臺盼藍染色液（2X）（碧云天生物技術(shù)公司）；等滲磷酸鹽緩沖液（PBS，PH 7.4）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、海藻糖、甘油（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、青霉素和鏈霉素（華北制藥）。

1.2 儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥機，Advantage 2.0 Benchtop Freeze Dryer（美國SP Industries公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；低速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Countess II FL細胞計數(shù)儀（賽默飛世爾科技有限公司）；低溫臺（BCS196 Biological Cyro?stage）；BX51TRF 顯微鏡（Olympus，日本）。

1.3 實驗方法

1.3.1 肝癌細胞的獲取

從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)皿，吸掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基（10%胎牛血清 ＋1%雙抗 ＋89%DMEM 培養(yǎng)基），每個皿都加入 2 mL D?Hank′s，清洗2遍，接著用0.5 mL胰酶進行消化1～2 min后，當(dāng)在顯微鏡下觀察細胞呈圓粒狀并較均勻的分布在培養(yǎng)皿中時，每個皿加入2 mL DMEM培養(yǎng)基終止消化，并將所有細胞吸入到同一離心管中，轉(zhuǎn)速為1 00 0 r/min，離心 5 min，倒去上清液。

將肝癌細胞 Hep?G2用等滲 PBS溶液離心（1 000 r/min，離心 5 min）、洗滌 3 遍，收集肝癌細胞備用。

1.3.2 凍干保護劑配方優(yōu)化

實驗分組：保護劑基礎(chǔ)液均為DMEM，將保護劑分為12組，根據(jù)保護劑不同種類又分為5組，第一組序號為0，是對照組，保護劑組成為15%FBS＋20%海藻糖；第二組序號為1～3，是Me2SO組；第三組序號為4～8，是PVP組；第四組序號為9～10，是甘油組；第五組序號為11，是根據(jù)第1～4大組實驗的結(jié)果選出的配方，為復(fù)方保護劑組。將備用的肝癌細胞分裝1 mL到12個1.5 mL的離心管中，保證每個樣品中有足夠量的細胞，離心（1 600 r/min，離心 4 min），去掉上清液，分別加入以下凍干保護劑，低溫顯微鏡觀察，均以10℃/min從室溫降到－80℃，平衡10 min，再以20℃/min升溫到30℃。

將每組保護劑按4∶1的比例加入到細胞中進行凍干，最終凍干測定復(fù)水后肝癌細胞的回收率、存活率和24 h貼壁率，進行三組平行實驗。

表1 保護劑分組Tab．1 The group of freeze?drying protectants

1.3.3 肝癌細胞 Hep?G2 的凍干與復(fù)水

凍干：將細胞與保護劑以1∶4的體積比配制成凍干細胞混合液。取1 mL配好的凍干細胞混合液加入到容積為5 mL的西林瓶中并計數(shù)，放入凍干機中進行凍干，每次實驗共設(shè)三組平行。預(yù)凍速率大概為10 K/min，預(yù)凍溫度為－65℃，時間2 h，保證樣品全部凍結(jié)；接著進行一次干燥，樣品溫度保持－45℃，持續(xù)24 h，壓力為5 Pa；二次干燥樣品溫度為20℃，時間10 h，壓力為5 Pa。凍干完成后，樣品密封保存。

復(fù)水：復(fù)水液的配制將PVP溶于PBS緩沖液中，PVP終質(zhì)量濃度（w/v）為10%。在37℃水浴下，將2 mL復(fù)水液加入到凍干樣品中，輕輕振動，直到樣品完全溶解，取樣再對其進行細胞計數(shù)［17］。

1.3.4 胞內(nèi)海藻糖的載入、提取與測定

胞內(nèi)海藻糖的載入：用雙蒸水配制400、600、800、1 000 mmol/L四種不同摩爾濃度的海藻糖溶液。將肝癌細胞置于四種不同摩爾濃度的海藻糖溶液中，并在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育7 h［4］。經(jīng)孵育之后的肝癌細胞，于1 200 r/min離心5 min，去除上清液，用等滲的PBS緩沖液洗滌，反復(fù)3次，用細胞計數(shù)儀計數(shù)，并計算平均體積。

胞內(nèi)海藻糖的提?。簽榉乐固崛∫褐衅渌M分的影響，加三倍體積的10%三氯乙酸于細胞懸浮液中，常溫下抽提細胞內(nèi)海藻糖3次［18］，收集三次的抽提液，可以獲得較為單一的含海藻糖組分。

胞內(nèi)海藻糖的測定：采用硫酸?蒽酮法測定各萃取液中海藻糖質(zhì)量濃度［19］。

1.3.5 負載海藻糖的細胞凍干及回收率、存活率和24 h貼壁率檢測

凍干保護劑為前期實驗篩選出來的最佳保護劑：基礎(chǔ)液為 DMEM，組分為 40%PVP（w/v） ＋15%FBS（v/v） ＋20%海藻糖（w/v） ＋10%丙三醇（v/v）。 隨后進行凍干。凍干結(jié)束后，在3 7℃水浴下進行復(fù)水，再取樣進行回收率、存活率及24 h貼壁率的檢測。

凍干細胞回收率［20］檢測：

存活率檢測［21］：采用臺酚藍染色法，取 20 μL 0.4%臺酚藍溶液和20 μL復(fù)水后細胞懸浮液，混勻，

滴加在細胞計數(shù)板上，在3 min內(nèi)，插入細胞計數(shù)儀中計數(shù)。按以下公式計算存活率：24 h貼壁率檢測：復(fù)水后的細胞，加入2 mL DMEM，于 1 200 r/min，離心 10 min，棄上清液，加 4 mL DMEM接種到培養(yǎng)皿中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h換液后，將培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液吸入到離心管中，計數(shù)未貼壁細胞。接著用胰酶消化后加2 mL DMEM，計數(shù)貼壁細胞。計算公式如下：

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

用SPSS Statistics軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準差的形式。

2 結(jié)果與分析

2.1 保護劑配方的優(yōu)化

2.1.1 Me2SO組細胞回收率、存活率和24 h貼壁率

對照組、添加 Me2SO體積分數(shù)（v/v）為 5%、10%、15%的保護劑組細胞復(fù)水后的回收率、存活率和24 h貼壁率結(jié)果見表2。文中采用Duncan法進行多重比較，表格中同列標(biāo)有相同字母的表示相互沒有顯著區(qū)別（P＞0.05），沒有相同字母表示互相有顯著區(qū)別（P＜0.05）。

表2 添加不同體積分數(shù)Me2SO保護劑細胞凍干復(fù)水后的回收率、存活率和24 h貼壁率Tab．2 Recovery rate，survival rate，and 24 h adherent rate after the recovery of freeze?dried cell with Me2SO

由表2可知，添加Me2SO保護劑組細胞凍干的回收率、存活率和24 h貼壁率均與對照組有顯著差異（P＜0.05），這表明添加體積分數(shù)為5% ～15%Me2SO保護劑對凍干肝癌細胞有一定的保護作用。添加了5% ～15%Me2SO后，回收率并沒有顯著差異，但10%Me2SO和15%Me2SO組的存活率及24 h貼壁率要顯著高于5%Me2SO組。而10%Me2SO和15%Me2SO組的回收率、存活率和24 h貼壁率均無顯著差異（P＞0.05）。 這表明 10%Me2SO和 15%Me2SO組的保護效果優(yōu)于5%Me2SO組，且兩者保護效果相近。

2.1.2 PVP組的細胞回收率、存活率和24 h貼壁率

對照組、添加 PVP質(zhì)量濃度（w/v）為 20%、30%、40%、50%、60%的保護劑組細胞復(fù)水后的回收率、存活率和24 h貼壁率結(jié)果見圖1。

添加不同質(zhì)量濃度PVP保護劑的肝癌細胞Hep?G2凍干復(fù)水后，測定其回收率、存活率和24 h貼壁率（圖1）。由圖1可知，PVP對肝癌細胞的凍干過程有明顯的保護作用，其作用效果隨著質(zhì)量濃度的增大而先增高后降低。當(dāng)PVP質(zhì)量濃度為20%時，肝癌細胞回收率、存活率和24 h貼壁率明顯高于對照組，當(dāng)PVP質(zhì)量濃度增大為40%時，肝癌細胞回收率、存活率和24 h貼壁率都達到了峰值，此后，隨著PVP質(zhì)量濃度增大，回收率、存活率和24 h貼壁率都有著不同程度的下降，表明40%PVP質(zhì)量濃度的保護劑凍干效果最佳，能產(chǎn)生較好的保護作用。

圖1 添加不同質(zhì)量濃度PVP保護劑細胞凍干復(fù)水后的回收率、存活率和24 h貼壁率Fig．1 Recovery rate，survival rate，and 24 h adherent rate after the recovery of freeze?dried cell with PVP

2.1.3 甘油組的細胞回收率、存活率和24 h貼壁率

對照組、添加丙三醇體積分數(shù)（v/v）為 10%、20%的保護劑組細胞復(fù)水后的回收率、存活率和24 h貼壁率結(jié)果見表3。

表3 添加不同體積分數(shù)甘油保護劑細胞凍干復(fù)水后的回收率、存活率和24 h貼壁率Tab．3 Recovery rate，survival rate，and 24 h adherent rate after the recovery of freeze?dried cell with glycerol

由表3可知，添加了體積分數(shù)為（v/v）10% ～20%甘油的保護劑與對照組在回收率、存活率和24 h貼壁率上差異均有顯著性（P＜0.05），表明添加10%～20%甘油的保護劑對肝癌細胞凍干存在積極作用。10%甘油組的細胞存活率與20%甘油組沒有顯著差異（P＞0.05），但兩者的24 h貼壁率卻有顯著差異（P＜0.05），說明10%甘油組的凍干效果要優(yōu)于20%甘油組。

2.1.4 復(fù)方保護劑組的細胞回收率、存活率和24 h貼壁率

由于Me2SO的凍干效果不佳，因此以下結(jié)果均不再進行比較。挑選前三組最優(yōu)保護劑，進行復(fù)方保護劑組實驗，并比較它們的回收率、存活率和24 h貼 壁率。

表4 添加不同保護劑細胞凍干復(fù)水后的回收率、存活率和24 h貼壁率Tab．4 Recovery rate，survival rate，and 24 h adherent rate after the recovery of freeze?dried cell with different protectant

由表4可知，添加了保護劑的細胞凍干復(fù)水后與對照組在回收率、存活率和24 h貼壁率上差異均有顯著性（P＜0.05），說明凍干保護劑的添加對肝癌細胞凍干有明顯的保護作用。10%甘油組在回收率、存活率和24 h貼壁率上都要低于其他兩組（序號6和序號11），說明甘油在凍干過程中的保護效果最差。40%PVP組與復(fù)方保護劑組的存活率高于復(fù)方保護劑組，但復(fù)方保護劑組的貼壁率明顯高于40%PVP組，這表明雖然40%PVP的保護劑可以大大提高凍干復(fù)水后細胞的存活率，但多數(shù)細胞已失去其貼壁能力，而復(fù)方保護劑能較好維持肝癌細胞的基本功能。綜上所述，復(fù)方保護劑在凍干肝癌細胞過程中保護效果最好。

2.2 孵育載入肝癌細胞海藻糖的摩爾濃度

采用硫酸蒽酮法測定海藻糖摩爾濃度，其中萃取液的質(zhì)量濃度與胞內(nèi)摩爾濃度成正比關(guān)系［22］，因此，萃取液的質(zhì)量濃度也可以反映胞內(nèi)海藻糖摩爾濃度的大小。當(dāng)細胞放在等滲的海藻糖溶液中時，胞內(nèi)幾乎沒有負載海藻糖。所以，該實驗選擇了一系列高滲溶液：400、600、800、1 000 mmol/L 海藻糖溶液作為負載液。圖2所示為不同摩爾濃度胞外海藻糖對肝癌細胞的影響。在37℃條件下，通過孵育的方式，萃取液海藻糖摩爾濃度呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。當(dāng)胞外摩爾濃度在400～600 mmol/L區(qū)間時，以相對較快的速率增加對海藻糖的攝取量，海藻糖摩爾濃度明顯加大；當(dāng)胞外摩爾濃度在600～800 mmol/L范圍時，萃取液海藻糖摩爾濃度增加趨勢減緩，此時可能細胞吸取的海藻糖摩爾濃度達到飽和；當(dāng)胞外摩爾濃度為1 000 mmol/L時，細胞對海藻糖的攝取量減小，可能是過高摩爾濃度的胞外環(huán)境提供了水從胞內(nèi)向胞外流動的推動力，從而形成了細胞膜內(nèi)外的滲透梯度，對細胞造成了一定的滲透損傷［23］。

圖2 不同摩爾濃度胞外海藻糖對肝癌細胞的影響Fig．2 The effect of extracellular trehalose at various molar concentrations on Hepatoma Hep?G2 cells

表5 胞外不同摩爾濃度海藻糖載入肝癌細胞后凍干的回收率、存活率和24 h貼壁率Tab．5 Recovery rate，survival rate，and 24 h adherent rate after the recovery of freeze?dried cell in extracellular trehalose at various molar concentrations

2.3 凍干肝癌細胞的回收率、存活率和24 h存活率

將肝癌細胞放置在不同摩爾濃度海藻糖溶液中，通過熱孵育載入細胞內(nèi)后進行凍干，測得的回收率、存活率和24 h貼壁率如表5所示。

由表5可知，當(dāng)胞外摩爾濃度為400 mmol/L時，回收率、存活率和24 h貼壁率均與對照組無明顯差異，可能由于進入細胞的海藻糖摩爾濃度不足以對細胞提供保護作用［24］。當(dāng)胞外摩爾濃度為600 mmol/L時，回收率要明顯高于對照組，但存活率和24 h貼壁率并沒有顯著差異（P＞0.05）。當(dāng)胞外摩爾濃度為800 mmol/L時，存活率和24 h貼壁率均大大高于其他組（P＜0.05），說明該組具有活性的細胞明顯多于對照組。當(dāng)胞外海藻糖摩爾濃度為1 000 mmol/L時，肝癌細胞凍干的回收率、存活率和24 h貼壁率差異均有顯著性（P＜0.05），明顯低于其他組。

綜上所述，當(dāng)胞外海藻糖摩爾濃度為400 mmol/L或 600 mmol/L 時，肝癌細胞凍干效果與不添加海藻糖組基本無變化；當(dāng)胞外海藻糖摩爾濃度為800 mmol/L時，與對照組相比，凍干效果有顯著差異（P＜0.05），凍干效果最好；當(dāng)胞外摩爾濃度為1 000 mmol/L時，凍干效果低于對照組。

3 討論

肝臟是人體代謝的重要器官，但由于人肝臟細胞在生理條件下獲取困難、個體差別大、傳代培養(yǎng)不易，而肝癌細胞Hep?G2培養(yǎng)傳代較為容易，且有正常肝細胞的很多功能以及體細胞的基本特征［25］，因此，本研究以肝癌細胞Hep?G2為模型，探索肝癌細胞的真空冷凍干燥以及海藻糖對肝癌細胞凍干的影響。

保護劑在生物制品凍干過程中是不可或缺的，二甲基亞砜（Me2SO）為常見的低溫保護劑，添加Me2SO后凍存，可以降低溶液的冰點，減少胞內(nèi)冰的形成，從而有效地減少了由冰晶帶來的機械損傷［26］。真空冷凍干燥細胞前的預(yù)凍過程，為了減小細胞的冷凍損傷，因此選擇加入一定體積分數(shù)的Me2SO作為保護劑。楊波等［27］在凍存人肝細胞實驗中，添加體積分數(shù)（v/v）為 10%Me2SO作為保護劑，貼壁率高達81.05%。 Han Ying等［28］在研究紅細胞凍干保存實驗中，將Me2SO、PVP等加入保護劑配方中，發(fā)現(xiàn)有積極的凍干效果，細胞和血紅蛋白復(fù)水后的恢復(fù)率達到80%以上。本研究發(fā)現(xiàn)，加入Me2SO的保護劑對細胞凍干雖然產(chǎn)生了積極保護作用，但保護效果并不理想，這可能是由于Me2SO體積分數(shù)過高不利于干燥過程的進行。

權(quán)國波等［29］發(fā)現(xiàn)隨著PVP質(zhì)量濃度的增高，體系的結(jié)晶起始點隨之降低，玻璃化程度增高，有利于整個體系度過危險溫區(qū)，從而減少細胞在凍干過程中受到的機械損傷。但隨著PVP質(zhì)量濃度的進一步升高，游離血紅蛋白質(zhì)量濃度只有0.5 g/L左右，表明過高質(zhì)量濃度的PVP并不利于凍干。本研究中，當(dāng)PVP質(zhì)量濃度達到40%時，細胞的回收率、存活率和24 h貼壁率顯著提高，但當(dāng)PVP質(zhì)量濃度增大為50%時，細胞的回收率、存活率和24 h貼壁率均有不同程度的下降，和權(quán)國波等［29］的結(jié)論一致。這可能是由于對細胞造成了較高的滲透壓以及PVP的親水性質(zhì)的影響［30］。

甘油由于可以滲透到細胞內(nèi)部提供良好的保護作用，因而一直被廣泛應(yīng)用于細胞的凍存中，體積分數(shù)20%（v/v）的甘油可以在凍存肝癌細胞中取得較理想的效果［31］。本研究亦發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，加入了體積分數(shù)（v/v）為10%、20%甘油的保護劑與可以使細胞回收率、存活率和24 h貼壁率均顯著提高。其中，體積分數(shù)（v/v）為10%甘油的保護效果較好。

在細胞凍干過程中，糖類往往與大分子聚合物一起作為保護劑，為細胞膜提供優(yōu)良的保護作用，尤其是海藻糖［32］。 B．Stokich 等［33］在分子層面研究了海藻糖對肝癌細胞分子層的影響，當(dāng)海藻糖加入到低溫保護劑中時，會改變冰晶形成特征。Han Ying等［28］配比了質(zhì)量濃度（w/v）為0% ～15%的海藻糖保護劑，凍干紅細胞后發(fā)現(xiàn)，血紅蛋白和紅細胞的恢復(fù)率與對照組并沒有顯著差異，因此，得出結(jié)論：胞外海藻糖在凍干過程中并沒有起到保護作用。但是否海藻糖必須進入胞內(nèi)才能提供膜的保護作用，很多學(xué)者對于胞內(nèi)海藻糖的保護效果進行了研究。T．Chen等［34］利用基因重組成的通道將海藻糖引入胞內(nèi)，使細胞在復(fù)水后質(zhì)膜的恢復(fù)率高達90%。何暉等［35］通過孵育的方法將海藻糖載入胞內(nèi)，細胞回收率最高達到51.8%。本研究中，將肝癌細胞置于不同摩爾濃度的海藻糖溶液中孵育7 h后凍干，當(dāng)胞外海藻糖摩爾濃度為800 mmol/L時，與對照組相比，細胞存活率和24 h貼壁率差異顯著（P＜0.05），凍干效果最佳。

4 結(jié)論

采用真空冷凍干燥的方法保存肝癌細胞Hep?G2，選擇不同體積分數(shù)的Me2SO、甘油及不同質(zhì)量分數(shù)的PVP、復(fù)方保護劑篩選出最優(yōu)保護劑配方，并通過測定細胞回收率、存活率和24 h貼壁率來探究海藻糖對肝癌細胞凍干的影響。結(jié)果表明：添加40%PVP（w/v） ＋10%甘油（v/v） ＋15%FBS（v/v） ＋20%海藻糖（w/v）的保護劑的細胞，在復(fù)水后回收率、存活率和 24 h 貼壁率分別為 29.58%，42.18% 和18.71%，與對照組差異顯著，對細胞保護效果最佳；當(dāng)胞外海藻糖摩爾濃度為800 mmol/L時，凍干效果最好，肝癌細胞Hep?G2在復(fù)水后回收率、存活率和24 h 貼壁率分別為 27.81%，66.65% 和 33.68%，存活率和貼壁率顯著高于其他組。該結(jié)論對凍干肝癌細胞Hep?G2的可能性提供了初步證明，對其他體細胞的凍干工藝也具有一定的借鑒價值。

［1］BAKALTCHEVA I，LESLIE S，MACDONALD V，et al．Reversible cross?linking and CO treatment as an approach in red cell stabilization［J］．Cryobiology，2000，40（4）：343?359．

［2］BIEGANSKI R M，F(xiàn)OWLER A，MORGAN J R，et al．Stabilization of active recombinant retroviruses in an amor?phous dry state with trehalose［J］．Biotechnology Progress，1998，14（4）：615?620．

［3］CERRUTTI P，HUERGO M S D，GALVAGNO M，et al．Commercial baker＇s yeast stability as affected by intracellu?lar content of trehalose，dehydration procedure and the physical properties of external matrices［J］．Applied Micro?biology and Biotechnology，2000，54（4）：575?80．

［4］SATPATHY G R，T?R?K Z，BALI R，et al．Loading red blood cells with trehalose：a step towards biostabilization［J］．Cryobiology，2004，49（2）：123?136．

［5］ARNOLD P，DJERASSI I，F(xiàn)ARBER S，et al．The prepa?ration and clinical administration of lyophilized platelet ma?terial to children with acute leukemia and aplastic anemia［J］．Journal of Pediatrics，1956，49（5）：517?522．

［6］WOLKERS W F，WALKER N J，TABLIN F，et al．Hu?man platelets loaded with trehalose survive freeze?drying［J］．Cryobiology，2001，42（2）：79?87．

［7］ZHANG Shaozhi，F(xiàn)AN Juli，XU Xianguo，et al．An ex?perimental study of the use of ultrasound to facilitate the loading of trehalose into platelets［J］．Cryobiology，2009，59（2）：135?140．

［8］范菊莉，張紹志，徐夢潔，等．超聲波預(yù)處理的人血小板凍干保存實驗［J］．南京航空航天大學(xué)學(xué)報，2012，44 （3）： 420?424． （ FAN Juli，ZHANG Shaozhi，XU Mengjie，et al．Experimental study on lyophilization preser?vation of human platelets pretreated by ultrasound［J］．Journal of Nanjing University of Aeronautics＆ Astronau?tics，2012，44（3）：420?424．）

［9］肖洪海，李軍，華澤釗，等．人臍帶血有核細胞冷凍干燥保存實驗初步研究［J］．中國細胞生物學(xué)學(xué)報，2003，25（6）：389?393．（XIAO Honghai，LI Jun，HUA Zezhao，et al．Research on freeze?drying of the nucleated cell of hu?man cord blood［J］．Chinese Journal of Cell Biology，2003，25（6）：389?393．）

［10］楊宏偉，陳曉隆，黃永剛．應(yīng)用酶組織細胞化學(xué)技術(shù)對真空冷凍干燥保存兔角膜內(nèi)皮細胞的研究［J］．中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，33（3）：221?222．（YANG Hongwei，CHEN Xiaolong，HUANG Yonggang．Enzymes of corneal endothelial cells in vacuum freeze drying preservation in rabbit by using enzyme histocytochemistry［J］．Journal of China Medical University，2004，33（3）：221?222．）

［11］ZHANG M，OLDENHOF H，SIEME H，et al．Freezing?induced uptake of trehalose into mammalian cells facilitates cryopreservation ［J］．Biochimica et Biophysica Acta，2016，1858（6）：1400?1409．

［12］華澤釗．低溫生物醫(yī)學(xué)技術(shù)［M］．北京：科學(xué)出版社，1994．（HUA Zezhao．Low temperature biomedical technol?ogy［M］．Beijing： Science Press，1994．）

［13］MENDENHALL C L，THEUS S A，ROSELLE G A，et al．Biphasic in vivo immune function after low?versus high?dose alcohol consumption［J］．Alcohol，1997，14（3）：255?260．

［14］何暉，劉寶林，華澤釗，等．甘油預(yù)處理對紅細胞冷凍干燥保存作用的實驗研究［J］．制冷學(xué)報，2006，27（4）：54?58．（HE Hui，LIU Baolin，HUA Zezhao，et al．Experimental study on effect of pretreatment with glycerol upon freeze?drying preservation quality of red blood cells［J］．Journal of Refrigeration，2006，27（4）：54?58．）

［15］KANIAS T，ACKER J P．Biopreservation of red blood cells—the struggle with hemoglobin oxidation［J］．Febs Journal，2009，277（2）：343?356．

［16］CHESNé C，GUILLOUZO A．Cryopreservation of isolated rat hepatocytes：a critical evaluation of freezing and thawing conditions［J］．Cryobiology，1988，25（4）：323?330．

［17］SPIELES G，HESCHEL I，RAU G．An attempt to recover viable human red blood cells after freeze?drying［J］．Cryo Letters，1996，17（1）：43?52．

［18］周俊，劉景漢，歐陽錫林，等．血小板胞內(nèi)海藻糖測定方法的建立和評價［J］．中國實驗血液學(xué)雜志，2004，12（6）：837?840．（ZHOU Jun，LIU Jinghan，OUYANG Xilin，et al．Establishment and evaluation on the method for platelet intracellular trehalose determination［J］．Jour?nal of Experimental Hematology，2004，12（6）：837?840．）

［19］LILLIE S H，PRINGLE J R．Reserve carbohydrate metab?olism in Saccharomyces cerevisiae：responses to nutrient limitation［J］．Journal of Bacteriology，1980，143（3）：1384．

［20］周新麗，劉建峰，周國燕，等．蛋黃卵磷脂對凍干紅細胞恢復(fù)率的影響［J］．制冷學(xué)報，2009，30（6）：49?51．（ZHOU Xinli，LIU Jianfeng，ZHOU Guoyan，et al．Effect of egg yolk phosphatidylcholine on recovery of freeze?dried red blood cells［J］．Journal of Refrigeration，2009，30（6）：49?51．）

［21］司徒鎮(zhèn)強，吳軍正．細胞培養(yǎng)［M］．北京：世界圖書出版公司，1996．（SITU Zhenqiang，WU Junzheng．Cell cul?ture［M］．Beijing： World Book Publishing Company，1996．）

［22］楊維，姜曼，耿文鑫，等．大鼠皮膚的冷凍干燥保存［J］．中國組織工程研究，2009，13（41）：8080?8084．（YANG Wei，JIANG Man，GENG Wenxin，et al．Freeze?drying preservation of rat skin tissues［J］．Journal of Clini?cal Rehabilitative Tissue Engineering Research，2009，13（41）：8080?8084．）

［23］LYNCH A L，CHEN R，SLATER N K．pH?responsive polymers for trehalose loading and desiccation protection of human red blood cells［J］．Biomaterials，2011，32（19）：4443?4449．

［24］GUO N，PUHLEV I D，MANSBRIDGE J，et al．Trehalose expression confers desiccation tolerance on human cells（see comments） ［J］．Nature Biotechnology，2000，18（2）：168?171．

［25］ZANNIS V I，BRESLOW J L，SANGIACOMO T R，et al．Characterization of the major apolipoproteins secreted by two human hepatoma cell lines［J］．Biochemistry，1981，20（25）：7089?7096．

［26］DABOS K J，PARKINSON J A，HEWAGE C，et al．1H NMR spectroscopy as a tool to evaluate key metabolic func?tions of primary porcine hepatocytes after cryopreservation［J］．Nmr in Biomedicine，2002，15（3）：241?250．

［27］楊波，周燕，劉寶林，等．肝細胞低溫保存的實驗研究［J］．中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報，2011，30（2）：308?311．（YANG Bo，ZHOU Yan，LIU Baolin，et al．Studies on cryopreservation of human hepatocytes［J］．Chinese Journal of Biomedical Engineering，2011，30（2）：308?311．）

［28］HAN Ying，LIU Mingdong，MA Enpu，et al．Preservation of human red blood cells by lyophilization［J］．Bulletin of the Academy of Military Medicalences，2005，51（2）：152?164．

［29］權(quán)國波，劉敏霞，郭永，等．聚乙烯吡咯烷酮和葡萄糖在冰凍干燥保存人紅細胞中的效果研究［J］．制冷學(xué)報，2006，27（5）：11?16．（QUAN Guobo，LIU Minxia，GUO Yong，et al．Study on effect of pvp and glucose in ly?ophilization of human red blood cells［J］．Journal of Refrig?eration，2006，27（5）：11?16．）

［30］權(quán)國波，韓穎，劉秀珍，等．保護液的玻璃化狀態(tài)對紅細胞冷凍干燥保存后回收率的影響［J］．中國實驗血液學(xué)雜志，2003，11（3）：308?311．（QUAN Guobo，HAN Ying，LIU Xiuzhen，et al．Effect of vitrification state of protective solutions on recovery of red blood cells after ly?ophilization preservation［J］．Journal of Experimental He?matology，2003，11（3）：308?311．）

［31］姚嵐，梁瑋，劉寶林．人肝癌細胞Hep?G2的低溫保存研究［J］．制冷學(xué)報，2015，36（2）：95?100．（YAO Lan，LIANG Wei，LIU Baolin．Study on Cryopreservation of hu?man hepatoma Hep?G2 cell［J］．Journal of Refrigeration，2015，36（2）：95?100．）

［32］CROWE J H，CROWE L M，OLIVER A E，et al．The trehalose myth revisited：introduction to a symposium on stabilization of cells in the dry state［J］．Cryobiology，2001，43（2）：89?105．

［33］STOKICH B，OSGOOD Q，GRIMM D，et al．Cryopreser?vation of hepatocyte （HepG2） cell monolayers： impact of trehalose［J］．Cryobiology，2014，69（2）：281?290．

［34］CHEN T，ACKER J P，EROGLU A，et al．Beneficial effect of intracellular trehalose on the membrane integrity of dried mammalian cells［J］．Cryobiology，2001，43（2）：168?181．

［35］何暉，劉寶林，華澤釗，等．胞內(nèi)海藻糖對紅細胞冷凍干燥保存效果的影響［J］．制冷學(xué)報，2006，27（3）：41?44．（HE Hui，LIU Baolin，HUA Zezhao，et al．Beneficial effect of intracellular trehalose on viability of freeze?dried red blood cells［J］．Journal of Refrigeration，2006，27（3）：41?44．）

Preliminary Research on Freeze?drying Preservation of Human Hepatoma Hep?G2 Cells

Song Ping Li Weijie Zhou Xinli Liu Baolin
（School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai，200093，China）

Freeze?drying is a long?term and effective method for cell preservation．The lyoprotectant can have a significant effect on cell freeze?drying．In this study，different volume concentrations of Me2SO，glycerol，and different mass concentrations polyvinylpyrrolidone（PVP），compound lyoprotectant for lyophilizing human Hepatoma Hep?G2 cells were considered．The effect of intracellular trehalose on the lyophilized cells was investigated by determining the cell?recovery rate，survival rate，and 24 h attachment rate．The results show that，compared with the control group，the cells added in a 40%PVP （w/v） ＋ 10% （v/v） glycerol ＋ 15%fetal bovine serum （FBS） （v/v） ＋ 20% trehalose （w/v） solution

better protection．The cell recovery rate，survival rate，and 24 h adherent rate are 29.58%，42．18%，and 18．71%，respectively．When the extracellular trehalose molar concentration is 800 mmol/L，the Hepatoma Hep?G2 cell?recovery rate，survival rate，and 24 h adherent rate are 27．81% ，66．65% ，and 33．68% ，respectively．It is significantly better than the control group and has the best protection for cell freeze?drying．

freeze?drying；lyoprotectant；cell；survival rate

Li Weijie，male，lecturer，College of Medical Equipment and Food，University of Shanghai for Science and Technology，＋86 13651731551，E?mail：liweijie10 ＠ 139．com．Research fields：cryopreservation or freeze?drying of food，cells and tissues．

TB61＋1；R318．52；R735．7

A

0253－4339（2017）06－0111－08

10.3969 /j.issn.0253 － 4339.2017.06.111

國家自然科學(xué)基金（51376132）資助項目。（The project was supported by the National Natural Science Foundation of China （No．51376132）．）

2017年1月23日

李維杰，男，講師，上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，13651731551，E?mail：liweijie10＠ 139．com。 研究方向：食品及生物細胞、組織冷凍冷藏以及凍干工藝。