張味娜，徐 逸，俞 敏*

·論著·

人參皂苷Rg3溫敏納米粒制備及對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用研究

張味娜1，徐 逸2，俞 敏1*

目的制備人參皂苷Rg3溫敏納米粒，對(duì)其體外釋藥特性和對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行研究。方法兩親性溫敏聚合物作為藥物載體，滴制法制備載藥溫敏納米粒。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以包封率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，溫敏聚合物濃度、人參皂苷Rg3濃度和攪拌時(shí)間為考察因素，篩選納米粒處方和工藝。體外釋放曲線法研究37 ℃和42 ℃時(shí)溫敏納米粒的體外釋放特征。MTT法(四氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法)考察溫敏納米粒對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞增生的抑制作用。結(jié)果優(yōu)選處方及制備工藝為溫敏聚合物，濃度為0.20 mg/mL，人參皂苷Rg3濃度為0.03 mg/mL，攪拌時(shí)間為2 h；溫敏納米粒呈類球形，包封率為78.43%±1.76%，平均粒徑為(147.0±2.3)nm，平均Zeta電位為-14.6 mV(n=3)。體外釋放結(jié)果表明，37 ℃時(shí)，3 h藥物累積釋放度為36.1%，24 h累積釋放度為44.6%；42 ℃時(shí)，3 h累積釋放度達(dá)54.1%，24 h累積釋放率為83.0%。體外抑制結(jié)果顯示，隨著溫敏納米粒濃度從20 μg/mL增加至180 μg/mL，HepG2肝癌細(xì)胞成活率由69.8%下降至37.7%。結(jié)論人參皂苷Rg3溫敏納米粒處方和工藝合理可行，能達(dá)到隨溫度變化對(duì)藥物釋放起調(diào)釋作用，對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞具有較好的體外抑制作用。

人參皂苷Rg3；溫敏納米粒；正交設(shè)計(jì)；體外釋放

0 引言

原發(fā)性肝癌是高發(fā)的惡性腫瘤之一，病死率高，預(yù)后差[1-2]。射頻消融是局部熱療的一種方式，近年成為治療原發(fā)性肝癌的主要方法之一，但是射頻消融對(duì)肝癌的治療存在局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的問題[3-4]。如果能通過化療方法聯(lián)合射頻消融進(jìn)一步殺死殘存的癌細(xì)胞，便可降低局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。

人參皂苷Rg3 是從人參中分離的一種四環(huán)三萜皂苷，能抑制腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移，具有顯著的抗腫瘤作用，對(duì)肺癌、黑色素瘤和肝癌細(xì)胞等有明顯抑制作用[5-6]。人參皂苷Rg3水溶性較差，口服后血漿濃度很低，口服3.2 mg/kg后測(cè)得最大血藥濃度僅為(16±6)μg/L[7-8]，故亟需采用制劑手段提高其生物利用度。納米制劑可提高難溶性藥物的溶解度，促進(jìn)藥物在體內(nèi)的吸收，提高其生物利用度，減少對(duì)正常組織的毒副作用[9-11]。其中，溫敏納米粒作為一種主動(dòng)靶向腫瘤治療的新策略，目前也被廣泛應(yīng)用于各種腫瘤疾病的治療研究和實(shí)踐中；溫敏納米粒一旦被靶部位溫度變化誘導(dǎo)或刺激，能在腫瘤部位聚集或在靶位點(diǎn)釋放有效載荷，進(jìn)而減少對(duì)正常組織的損傷，提高腫瘤治療的精準(zhǔn)性和有效性[12]。

臨床治療實(shí)踐中，射頻消融技術(shù)在腫瘤部位產(chǎn)生局部熱效應(yīng)，使溫度高于溫敏納米粒最低臨界溶解溫度，從而使腫瘤部位藥物釋放增加，且不引起藥物在其他部位的釋放。本試驗(yàn)通過制備人參皂苷Rg3溫敏納米粒，達(dá)到化學(xué)治療聯(lián)合射頻消融的目的，以期更有效地治療肝癌患者。

1 材料

1.1 儀器 JB-3型定時(shí)磁力攪拌器(上海智光儀器儀表有限公司)；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；KQ-100超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LGJ-10冷凍干燥機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；Nano-ZS90型激光粒度分析儀(英國馬爾文儀器設(shè)備有限公司)；5810R冷凍高速離心機(jī)(德國艾本德科技有限公司，離心半徑9.5 cm)；JEM1400透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)；Multiskan Ascent酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；THZ-82型水浴恒溫振蕩器(江蘇省金壇市宏華儀器廠)。

1.2 藥品與試劑 HepG2細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；DMEM培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品)；人參皂苷Rg3(純度>98%，上海同田生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：14090136)；P(NIPAM-co-DMAAM)-b-PCL(兩親性溫敏聚N-異丙基丙烯酰胺類嵌段共聚物，最低臨界溶解溫度為41.5 ℃，溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供)；透析袋(分子量：3 500，北京鼎國生物技術(shù)有限公司)。其他試劑均為分析純或化學(xué)純。

2 方法與結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg3含量測(cè)定方法[13]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kromasiol ODS-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(50∶50)，體積流量：1 mL/min，檢測(cè)波長：203 nm，進(jìn)樣量：20 μL，柱溫：30 ℃。此色譜條件下，人參皂苷Rg3的相對(duì)保留時(shí)間約為9.0 min，且載體色譜峰與人參皂苷Rg3色譜峰能很好地達(dá)到基線分離，空白輔料無干擾，表明此方法專屬性強(qiáng)。色譜圖見圖1。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取干燥至恒重的人參皂苷Rg3對(duì)照品10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1 mg/mL的儲(chǔ)備液。分別精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL儲(chǔ)備液置于10 mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，分別吸取20 μL進(jìn)行測(cè)定。以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C)作線性回歸，得回歸方程：A=8.856 5 C+2.802 1，r=0.999 9，線性范圍：10～100 μg/mL，以信噪比為3時(shí)測(cè)得檢測(cè)限為0.05 μg/mL，以信噪比為10時(shí)測(cè)得定量限為0.1 μg/mL。

2.1.3 方法精密度試驗(yàn) 制備高、中、低(100、50、10 μg/mL)3個(gè)質(zhì)量濃度的人參皂苷Rg3標(biāo)準(zhǔn)液，分別放置0、2、4、8、12、24 h,用HPLC測(cè)定，考察日內(nèi)精密度；每日測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定5 d，考察日間精密度。結(jié)果表明，高、中、低質(zhì)量濃度人參皂苷Rg3標(biāo)準(zhǔn)液日內(nèi)RSD分別為0.97%、1.12%、0.86%(n=6)，日間RSD分別為0.74%、0.92%、1.07%(n=5)，方法精密度符合分析試驗(yàn)要求。

2.1.4 提取回收率試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下方法制備空白納米粒，精密移取1.0 mL空白納米?；鞈乙?份并分別置于10 mL容量瓶中，分別加入1 mg/mL人參皂苷Rg3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1、0.5、1.0 mL，各3份，甲醇稀釋并定容至刻度，制得低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度為10、50、100 μg/mL的人參皂苷Rg3供試品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算人參皂苷Rg3實(shí)際質(zhì)量濃度，與已知質(zhì)量濃度相比計(jì)算回收率。平均回收率為98.64%，RSD為1.03%(n=9)，回收率符合要求。

圖1 高效液相色譜圖注：A.空白輔料，B.對(duì)照品，C.樣品；1.人參皂苷Rg3

2.1.5 儀器精密度試驗(yàn) 取人參皂苷Rg3對(duì)照品溶液(50 μg/mL)適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg3峰面積的RSD為0.61%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2 人參皂苷Rg3溫敏納米粒的制備 精密稱取一定量溫敏兩親嵌段共聚物P(NIPAM-co-DMAAM)-b-PCL(參考文獻(xiàn)[14]制備)分散到5 mL四氫呋喃溶液中，超聲至完全溶解，用注射器(4號(hào)針頭)吸取聚合物的四氫呋喃溶液滴加到100 mL的人參皂苷Rg3甲醇溶液中，邊滴加邊攪拌(1.0 mL/min，攪拌速度200 r/min)。全部加入后，繼續(xù)攪拌一定時(shí)間后過濾，即得人參皂苷Rg3溫敏納米粒的混懸液。將混懸液轉(zhuǎn)移至透析袋中(分子量：3 500)，用PBS緩沖液和蒸餾水分別透析12 h(3次，1 000 mL/次)除去未包封的藥物和四氫呋喃。透析之后冷凍干燥，即得載藥納米粒粉末。密封后4 ℃冰箱儲(chǔ)存。

2.2.1 人參皂苷Rg3溫敏納米粒的制備工藝優(yōu)化 以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)，對(duì)不同滴加速度、不同溫敏聚合物濃度、不同人參皂苷Rg3濃度、不同攪拌轉(zhuǎn)速和不同攪拌時(shí)間范圍進(jìn)行考察?；趩我蛩卦囼?yàn)結(jié)果，對(duì)影響包封率的3個(gè)主要因素：溫敏聚合物濃度(mg/mL)、人參皂苷Rg3濃度(mg/mL)和攪拌時(shí)間(h)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。每個(gè)因素3個(gè)水平，采用正交表L9(3)4，以包封率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行處方優(yōu)化。因素水平和正交試驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表

表2 人參皂苷Rg3溫敏納米粒L9(3)4正交試驗(yàn)安排和試驗(yàn)結(jié)果

注：K1、K2、K3分別為3個(gè)水平的平均值；R為極差

正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)直觀分析表明，極差R反映各因素對(duì)指標(biāo)的影響程度。R越大，影響程度越大。試驗(yàn)中3個(gè)因素R值排列順序?yàn)锳>B>C，即溫敏聚合物的濃度對(duì)包封率影響最大，較高的濃度能顯著提高藥物的包封率。其中各因素水平分析結(jié)果為A：3>2>1；B：2>1>3；C：2>3>1，最佳處方為A3B2C2，即溫敏聚合物的濃度為0.20 mg/mL，人參皂苷Rg3的濃度為0.03 mg/mL，攪拌時(shí)間為2 h。正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果表明，方差分析顯示數(shù)據(jù)和直觀分析數(shù)據(jù)結(jié)果一致，表明此次正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)可信。見表3。

表3 處方篩選方差分析

2.2.2 人參皂苷Rg3溫敏納米粒制備的工藝驗(yàn)證 按“2.2.1”項(xiàng)下方法及選定的工藝條件制備人參皂苷Rg3溫敏納米粒3批，按照“2.3”、“2.4”、“2.5”項(xiàng)中測(cè)定方法測(cè)定其包封率、載藥量和粒徑分布。與之前的正交設(shè)計(jì)結(jié)果對(duì)比，驗(yàn)證工藝的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，三次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果均符合要求，表明優(yōu)化處方組成合理，制備工藝穩(wěn)定。見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.3 人參皂苷Rg3溫敏納米粒包封率的測(cè)定 取一定量的人參皂苷Rg3溫敏納米混懸液，于高速冷凍離心機(jī)內(nèi)離心30 min(15 000 r/min)，取上清液按“2.1”項(xiàng)下含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。按照公式：包封率=(總藥量-未包封藥量)/總藥量×100%計(jì)算包封率。

2.4 人參皂苷Rg3溫敏納米粒載藥量的測(cè)定 精密稱取一定量干燥人參皂苷Rg3溫敏納米粒粉末，溶解在一定體積的四氫呋喃溶液中，超聲10 min使之完全溶解，使其最終濃度為1 mg/mL。真空干燥箱中干燥(30 ℃)，使四氫呋喃揮發(fā)完全。再用PBS(0.1 mol/L，pH=7.4)溶液10 mL復(fù)溶，微孔濾膜(0.45 μm)過濾后，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。按公式：載藥量=包載藥物量/干燥載藥納米粒量×100%計(jì)算載藥量。

2.5 人參皂苷Rg3溫敏納米粒的粒徑及Zeta電位的測(cè)定 按“2.2”項(xiàng)下方法及工藝條件制備人參皂苷Rg3溫敏納米粒混懸液3批。取適量混懸液，用水溶液稀釋到合適的濃度，用激光粒度分析儀及Zeta電位儀測(cè)定其粒徑和Zeta電位。見圖2、圖3。

圖2 人參皂苷Rg3溫敏納米粒粒徑分布圖

圖3 人參皂苷Rg3溫敏納米粒Zeta電位圖

由圖2可知，人參皂苷Rg3溫敏納米粒粒徑分布集中，平均粒徑為(147.0±2.3)nm，不易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除。分散指數(shù)PDI為0.132(<0.3)，表明納米粒有較窄的粒徑分布。由圖3可以看出，溫敏納米粒平均Zeta電位為-14.6 mV，負(fù)電荷使納米粒不易被細(xì)胞膜所吸附，此Zeta電位為納米粒的體內(nèi)穩(wěn)定性奠定了基礎(chǔ)。

2.6 溫敏納米粒的形態(tài)學(xué)觀察 按“2.2”項(xiàng)下方法和工藝條件制備人參皂苷Rg3溫敏納米?；鞈乙?，將混懸液稀釋到合適的濃度，用少量2%磷鎢酸負(fù)染后滴加到專用銅網(wǎng)上，自然揮干，使粒子濃縮沉積，置于透射電鏡下觀察載藥納米粒的形態(tài)特征。見圖4。

圖4 人參皂苷Rg3溫敏納米粒透射電鏡圖

由圖4可看出，溫敏納米粒外觀圓整，呈球形或類球形，表明溫敏兩親嵌段共聚物在水溶液中確實(shí)發(fā)生了自組裝行為。

2.7 人參皂苷Rg3溫敏納米粒體外釋放行為研究 精密稱取5 mg人參皂苷Rg3溫敏納米粒干燥粉末，分散在5 mL PBS(0.1 mol/L，pH=7.4)，置于透析袋(分子量：3 500)中并浸入裝有30 mL PBS(0.1 mol/L，pH=7.4)的燒杯中，于恒溫水浴振蕩器中不斷震蕩，振蕩頻率為60 r/min，在37、42 ℃條件下測(cè)試藥物釋放。分別于0.25、0.5、1、3、5、7、9、12、24 h定時(shí)取樣1 mL，并即時(shí)補(bǔ)加同體積、同溫度的釋放介質(zhì)。按“2.1”項(xiàng)下的測(cè)定條件和方法檢測(cè)藥物的釋放并繪制累計(jì)釋放曲線。人參皂苷Rg3溫敏納米粒體外釋放曲線見圖5。

圖5 人參皂苷Rg3溫敏納米粒在不同溫度下體外累計(jì)釋放曲線

由圖5可以看出，兩個(gè)溫度下溫敏納米粒的釋放均表現(xiàn)初期的快速釋放和后期緩慢可控的釋放。37 ℃時(shí)，3 h的藥物累計(jì)釋放度為36.1%，24 h的累計(jì)釋放度為44.6%；42 ℃時(shí)，3 h的累計(jì)釋放度高達(dá)54.1%，24 h的累計(jì)釋放率為83.0%。在相同時(shí)間內(nèi)，溫敏納米粒在42 ℃的釋放速度和釋放量明顯高于37 ℃。結(jié)果表明，藥物載體隨著溫度的變化對(duì)藥物的釋放起到了調(diào)釋作用。

2.8 人參皂苷Rg3溫敏納米粒的細(xì)胞毒性試驗(yàn) 用復(fù)蘇后的肝癌細(xì)胞(HepG2)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，密度是1×104個(gè)/孔，貼壁培養(yǎng)24 h。更換培養(yǎng)液后，分別加入濃度(以人參皂苷Rg3計(jì))為10、20、60、100、140、180 μg/mL的人參皂苷Rg3溫敏納米粒和人參皂苷Rg3溶液(培養(yǎng)基稀釋為稀釋液)，正常培養(yǎng)液組作為陰性對(duì)照。將96孔板移至培養(yǎng)箱中，37 ℃、飽和濕度95%和5% CO2保護(hù)下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。之后加入20 μL MTT(5 mg/mL)，孵育4 h后終止培養(yǎng)。除去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min以溶解結(jié)晶紫。選擇波長450 nm，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光密度值(OD)，然后計(jì)算細(xì)胞成活率OD值。計(jì)算公式：成活率=OD治療/OD空白×100%。人參皂苷Rg3溫敏納米粒和人參皂苷Rg3溶液對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制結(jié)果見圖6。

圖6 不同濃度的人參皂苷Rg3溫敏納米粒和溶液對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用

圖6結(jié)果表明，隨著人參皂苷Rg3溫敏納米粒和人參皂苷Rg3溶液濃度的增加，肝癌細(xì)胞HepG2的成活率隨之降低，二者均表現(xiàn)出較好的抑制作用。分析數(shù)據(jù)可知，隨著人參皂苷Rg3溶液和溫敏納米粒濃度從20 μg/mL增加至180 μg/mL，HepG2肝癌細(xì)胞成活率分別由71.4%和69.8%下降至41.0%和37.7%，二者對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用無明顯差異。但是根據(jù)溫敏納米粒體外溶出特性可知，42 ℃時(shí)人參皂苷Rg3溫敏納米粒的體外釋放度有所提高，故抑制作用隨溫度的升高而增加。

3 討論

本文利用兩親性溫敏嵌段共聚物P(NIPAM-co-DMAAM)-b-PCL自組裝的特性，滴制法制備了人參皂苷Rg3溫敏納米粒，制備的人參皂苷Rg3溫敏納米粒外觀、包封率、載藥量和粒徑均滿足納米制劑的要求。體外釋放試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著外部溫度的改變，溫敏納米粒達(dá)到了調(diào)節(jié)藥物釋放的目的，是一種很有潛力的溫敏控釋載體。MTT法結(jié)果表明，人參皂苷Rg3溫敏納米粒對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞具有良好的抑制作用。本文所制備的人參皂苷Rg3溫敏納米粒為下一步進(jìn)行化療聯(lián)合射頻消融治療原發(fā)性肝癌試驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

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PreparationofginsenosideRg3thermo-sensitivenanoparticlesandtheirinhibitoryeffectonhepatomacells

ZHANG Wei-na1,XU Yi2,YU Min1*

(1.Department of Pharmacy，Zhejiang Ninghai First Hospital，Ningbo 315600，China;2.Wenzhou Medical College Pharmacy School,Wenzhou 325000,China)

ObjectiveTo prepare ginsenoside Rg3 thermo-sensitive nanoparticles and to investigate the drug release behavior and the inhibiting effect on the hepatoma cellsinvitro.MethodsThermo-sensitive nanoparticles were prepared using the solvent injective method with amphiphilic block copolymer.The encapsulation efficiency was used to evaluate the influence of different formulation and preparation factors;the formulation was optimized by orthogonal design,with mixing time,mass concentration of amphiphilic block copolymer and ginsenoside Rg3 as factors.The drug release properties were measured at 37 ℃ and 42 ℃invitro.MTT assay was used to determine the inhibiting effect of ginsenosides Rg3 thermo-sensitive nanoparticles on HepG2 cells.ResultsThe mass concentration of amphiphilic block copolymer was 0.20 mg/mL，the mass concentration of ginsenosides Rg3 was 0.03 mg/mL and the mixing time was 2 h in the optimized formula and preparation process;the optimized nanoparticles had a spherical shape,the average diameter was (147.0±2.3) nm (n=3),the average Zeta potential was -14.6 mV (n=3) and the encapsulation efficiency was 78.43%±1.76% (n=3).The index of release showed that the accumulative release rates of the thermo-sensitive nanoparticles at the temperature of 37 ℃ and 42 ℃ were 36.1% and 54.1% within 3 h,and 44.6% and 83.0% within 24 h,respectively.The test of inhibition showed the survival rate of HepG2 cells was decreased from 69.8% to 37.7% with the increase of the concentration of thermo-sensitive nanoparticles from 20 μg/mL to 180 μg/mL.ConclusionThe results show that both formulation and preparation of ginsenoside Rg3 thermo-sensitive nanoparticles are feasible and reasonable.The thermo-sensitive nanoparticles can well respond to the environmental temperature change and has a good inhibitory effect on HepG2 cellsinvitro.

Ginsenoside Rg3;Thermo-sensitive nanoparticles;Orghogonal experimental design;Invitrodissolution

2017-04-05

1.浙江省寧?？h第一醫(yī)院藥劑科，寧波 315600；2.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，溫州 325000

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10.14053/j.cnki.ppcr.201711001