龐海東，賀 卓，燕傳明，盛下放，何琳燕

耐重金屬的植物促生芽孢桿菌篩選及其強(qiáng)化香蒲去除Cd的作用

龐海東，賀 卓，燕傳明，盛下放，何琳燕*

（農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物重點實驗室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

為探討細(xì)菌對水生植物修復(fù)水體重金屬污染的影響，從南京某礦區(qū)廢棄地的濕地植物柳樹（Salixbabylonica）、蘆葦（Phragmites australis）、香蒲（Typha latifolia）根際和根內(nèi)分離篩選到8株芽孢桿菌，這些芽孢桿菌都具有產(chǎn)鐵載體、吲哚乙酸、多糖和淀粉酶活性，且對重金屬的抗性較強(qiáng)，對溫度、pH和鹽濃度具有一定的耐受性。采用水培試驗研究了Cd脅迫下耐重金屬植物促生芽孢桿菌強(qiáng)化狹葉香蒲（T.angustifolia）吸收積累Cd的作用，結(jié)果表明，在2.5 mg·L-1Cd2+的條件下接種芽孢桿菌處理能夠促進(jìn)香蒲生長和組織中Cd含量增加。其中Bacillus megaterium P24和P37促進(jìn)香蒲根和地上部干重顯著增加40.0%～46.4%，B.amyloliquefaciens P29能使地上部Cd含量和總吸收量顯著增加31.1%和63.5%；溶液中Cd去除率最高可達(dá)79.5%。研究表明，耐重金屬芽孢桿菌能夠促進(jìn)香蒲生長、增加香蒲Cd含量，從而增加香蒲Cd總吸收量，達(dá)到去除水中Cd污染的作用，具有應(yīng)用于水體重金屬污染修復(fù)的潛力。

芽孢桿菌；狹葉香蒲；水體重金屬；污染修復(fù)；Cd

近年來隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，礦業(yè)開發(fā)、工業(yè)生產(chǎn)、城市生活產(chǎn)生的廢水排入水體，使水質(zhì)逐漸惡化，其中重金屬是主要的污染物。大量重金屬的存在給水體生物造成了嚴(yán)重危害，甚至威脅著人體健康[1-3]。因此，水體重金屬污染已經(jīng)成為國內(nèi)外亟需解決的環(huán)境問題。

水生植物修復(fù)技術(shù)是利用水生植物或其與微生物的共生關(guān)系清除污染物的一種環(huán)境生物技術(shù)，有學(xué)者認(rèn)為來自禾本科、水葵科、金魚藻科、香蒲科和小二仙草科的水生植物顯示出相對強(qiáng)的重金屬吸收能力[4-7]。目前被用于水體重金屬處理的水生植物有：菖蒲、水蔥、蘆葦、香蒲、眼子菜、鳳眼蓮[8-10]，其中香蒲對環(huán)境脅迫耐性較強(qiáng)，是國內(nèi)外公認(rèn)的濕地水生植物優(yōu)勢品種[11-12]。但是水生植物修復(fù)效果受到各種因素（如溫度、植物株齡和生物量等）的影響而不穩(wěn)定，且研究認(rèn)為這種修復(fù)作用是水生植物和根際微生物的耦合作用，因此，微生物強(qiáng)化措施可能會用于提升系統(tǒng)去除重金屬的整體功能。

微生物修復(fù)重金屬污染水體的作用已有很多報道[13-14]，但在受重金屬污染的湖泊、濕地等自然水體中微生物難以附著，修復(fù)效率較低。植物根際或內(nèi)生微生物能在健康植物根際或組織內(nèi)棲居而對植物不造成實質(zhì)性危害，并可以通過產(chǎn)生吲哚-3-乙酸（Indole Acetic Acid，IAA）和鐵載體等促生物質(zhì)促進(jìn)植物生長、提高植物對重金屬的耐受性和富集能力，而植物能夠為附生的微生物提供生長所需的空間、空氣和養(yǎng)分，有效增強(qiáng)根系微生物的活性。由此建立的微生物-植物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)已經(jīng)成為土壤重金屬修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點[15-16]，但在水體重金屬污染修復(fù)方面的應(yīng)用還剛剛起步[17-19]。芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，在缺乏營養(yǎng)或不良環(huán)境時能產(chǎn)生芽孢，抗逆性強(qiáng)，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)以及醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域都有著重要的應(yīng)用價值。本研究通過篩選耐重金屬的植物促生芽孢桿菌，考察菌株對香蒲生長和富集Cd的影響，以期為建立微生物強(qiáng)化水生植物聯(lián)合修復(fù)體系提供菌種資源和技術(shù)途徑，為發(fā)展重金屬污染水域生態(tài)修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品為南京市棲霞某礦區(qū)（32.07°～32.08°N，119.08°～119.10°E）濕地植物柳樹、蘆葦、香蒲的根和根際土壤。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，水1000 mL，固體培養(yǎng)基中再添加20 g瓊脂。

供試植物為多年生水生或沼生草本植物狹葉香蒲（T.angustifolia），幼苗購自南京藝蓮苑水生花卉公司。幼苗采回后用自來水清洗根部，選擇長勢、大小相同的幼苗用自來水復(fù)壯一周，待用。

1.2 芽孢桿菌的分離篩選

參考劉煒等[20]和王璐等[21]的方法，采用系列稀釋涂布平板培養(yǎng)法在LB固體培養(yǎng)基上分離、純化植物根際和內(nèi)生Cd抗性細(xì)菌。將采集的柳樹幼苗、蘆葦、香蒲，帶回實驗室后立刻進(jìn)行細(xì)菌的分離。根際細(xì)菌的分離是將植物根部的大塊土壤抖落，剪刀用75%乙醇表面消毒，剪取根部0.1 g裝入10 mL無菌水中振蕩30 min，將此溶液系列稀釋后取0.1 mL涂布于含1 mg·L-1Cd2+的LB固體培養(yǎng)基上。28℃培養(yǎng)72 h后，從中挑選長勢良好、菌落形態(tài)不同的Cd抗性細(xì)菌單菌落，多次劃線分離純化后4℃條件下保存。根內(nèi)細(xì)菌的分離是將植物根部用去離子水沖洗干凈，用75%的酒精和2.5%的NaClO先后消毒，并用無菌水浸洗數(shù)次。將表面消毒的根部0.1 g置于無菌研缽內(nèi)研磨至勻漿，加5 mL無菌水混勻，取0.1 mL涂布于含1 mg·L-1Cd2+的LB固體培養(yǎng)基上，同時取最后一遍浸洗的無菌水0.1 mL涂布于LB固體培養(yǎng)基，以檢測樣品表面消毒是否徹底。28℃培養(yǎng)72 h后，若無菌水涂布的平板未長菌，則從Cd抗性平板上挑選長勢良好、菌落形態(tài)不同的Cd抗性細(xì)菌單菌落，多次劃線分離純化后4℃條件下保存。然后將純化后的菌株接種到3 mL液體LB培養(yǎng)基中，30℃搖床150 r·min-1振蕩培養(yǎng)16～20 h，將菌體發(fā)酵液置于75～80℃水浴處理15 min，用接種環(huán)將菌液劃線到LB固體平板上，30℃倒置培養(yǎng)24～48 h，能正常生長的視為芽孢桿菌。保存待用。

1.3 菌株的分子鑒定

按常規(guī)方法提取細(xì)菌基因組DNA并以其為模板，用 16S rRNA 基因通用引物[22-23]27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。將所獲得序列用BLAST軟件與GenBank中已知的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對分析。

1.4 菌株的生物學(xué)特性試驗

菌株產(chǎn)多糖能力測定采用苯酚硫酸法[24]，菌株淀粉酶活性測定采用水解圈法[25]，菌株產(chǎn)吲哚乙酸（I－AA）測定參考Gordon等[26]和Mayer[27]的方法，鐵載體能力測定參考Schwyn等[28]的方法，溶磷實驗測定參考Liu等[29]的方法。

1.5 菌株對環(huán)境條件的抗逆性

參考王璐等[21]的方法，將供試菌株制成菌懸液，用滅過菌的牙簽點樣于不同條件的LB平板上，培養(yǎng)3～5 d，考察菌株對重金屬濃度、pH、溫度和鹽濃度的適應(yīng)性。其中重金屬 Pb2+、Zn2+終濃度為 50、100、200、300 mg·L-1；Cu2+終濃度為 10、20、50、100 mg·L-1；Cd2+終濃度為 20、50、100、200、300 mg·L-1。溫度設(shè)置為 5、15、25、35、45 ℃，pH 調(diào)節(jié)為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0（用 1 mol·L-1的 HCl和 1 mol·L-1的 NaOH 調(diào)節(jié)），NaCl質(zhì)量百分比分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%、7.0%。

1.6 菌株聯(lián)合香蒲去除水體Cd的作用

將供試菌株接種于LB培養(yǎng)基中，30℃150 r·min-1振蕩培養(yǎng)16～20 h至對數(shù)生長期，6000 r·min-1離心10 min收集菌體，用無菌去離子水將菌體重懸，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至OD600為1.0。將香蒲幼苗根浸泡于菌懸液中 30 min，移種于含 Cd 2.5 mg·L-1的Hoagland營養(yǎng)液中，對照（CK）以等量的無菌去離子水處理，每組處理設(shè)置3個重復(fù)。每桶種植3株香蒲苗，裝2 L Hoagland營養(yǎng)液。培養(yǎng)周期為20 d，每5 d用新鮮配制的Hoagland營養(yǎng)液將桶內(nèi)溶液補(bǔ)充至2 L。

植物收獲處理時，小心取出植株，用去離子水將植株清洗干凈，將根部浸于濃度為0.01 mol·L-1的EDTA-Na2溶液中10 min，以去除根表的重金屬離子。將植株地上部和根部用剪刀分開放置于牛皮紙袋內(nèi)，于80℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，稱量香蒲組織地上部和根部干重。植株樣品烘干后用粉碎機(jī)粉碎，稱取干燥的樣品于微波消解儀中進(jìn)行消解，定容后用ICPOES測定Cd2+含量，計算香蒲組織的重金屬含量和重金屬總吸收量。取塑料桶內(nèi)液體測定Cd2+濃度，按照下式計算各處理組的Cd去除率：

去除率=（初始水樣Cd濃度－試驗后水樣Cd濃度）/初始水樣Cd濃度×100%

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均采用Microsoft Office Excel 2013和Prism處理并作圖，采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的生物學(xué)和種屬確定

從南京某礦區(qū)濕地中的柳樹、蘆葦、香蒲根際土壤和根內(nèi)共分離純化到63株細(xì)菌，這些細(xì)菌都對1 mg·L-1Cd2+具有抗性。采用水浴法處理復(fù)篩，獲得8株芽孢桿菌，分別編號為 P21、P24、P29、P33、P34、P37、P39、P45。由表1可以看出，這8株芽孢桿菌都能分泌IAA、鐵載體、多糖和淀粉酶。菌株的IAA產(chǎn)量范圍為1.2～35.6 mg·L-1，多糖產(chǎn)量范圍為85.9～943.0 mg·L-1，淀粉水解圈直徑與菌落直徑比值范圍為1.5～2.0。菌株P(guān)24和P37能夠溶解難溶性磷酸鹽，在NBRIP培養(yǎng)基上有透明的溶磷圈產(chǎn)生。經(jīng)16S rRNA基因序列分析，供試菌株分別屬于B.cereus、B.megaterium、B.amyloliquefaciens和 B.thuringiensis。供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

2.2 菌株的抗逆性

由表2可以看出，8株芽孢桿菌對重金屬Pb、Zn、Cu和Cd都具有抗性，對Pb和Zn抗性較高，但對Cu和Cd抗性較低。P21、P34和P45對Pb、Zn、Cu和Cd的抗性范圍為 100～300 mg·L-1，P24、P33 和 P37 能在20 mg·L-1的Cd條件下生長，而P21和P39能在300 mg·L-1Cd脅迫下生長。

表1 供試菌株的植物促生特性和種屬Table 1 Plant growth-promoting characteristics and species of the isolated Cd-resistant bacterial strains

圖1 基于菌株部分16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Phylogenetic tree on the basis of partial 16S rRNA gene sequences of the strains

表2 供試菌株對重金屬的抗性和生長溫度、pH、鹽濃度范圍Table 2 Heavy metal resistance，growth temperature，pH and NaCl concentration range of the isolated strains

8株芽孢桿菌均為中溫菌，在15～45℃能正常生長，最適生長溫度在30℃左右。8株芽孢桿菌在pH為4.0的條件下都不能生長，P29和P33的生長pH范圍為6.0～8.0，菌株P(guān)39和P45生長pH范圍為6.0～10.0，其他菌株在pH 5.0～10.0的范圍內(nèi)都能正常生長。8株芽孢桿菌在NaCl濃度為0.5%～3.0%時均能正常生長，且P24和P37在NaCl濃度為7.0%時仍能正常生長，說明其具有耐受高滲的能力。

2.3 菌株聯(lián)合香蒲去除水體重金屬的效應(yīng)

2.3.1 菌株對香蒲生物量的影響

研究表明，能夠產(chǎn)生IAA、鐵載體、胞外多糖及具有溶磷能力的細(xì)菌能夠促進(jìn)植物的生長，提高植物對重金屬的耐受性。本試驗結(jié)果表明（圖2），在2.5 mg·L-1Cd2+的條件下，8株芽孢桿菌均能促進(jìn)香蒲根部和地上部組織的干重增加，但效果有差異。對根的促生作用表現(xiàn)為P34>P24>P37>P45>P29>P39>P21>P33，對地上部的促生作用表現(xiàn)為P24>P37>P29>P34>P39>P45>P33>P21。P24和P37對香蒲的促生作用較強(qiáng)，與CK相比，接菌處理促進(jìn)香蒲根干重分別顯著增加46.4%和41.8%，地上部干重顯著增加41.2%和40.0%（P<0.05）。P34促進(jìn)香蒲根干重顯著增加58.8%，但是對地上部的促生作用不顯著。其他菌株的促生作用均不顯著。

圖2 含Cd2+溶液中芽孢桿菌對香蒲干重的影響Figure 2 Effects of Bacillus stains on the aboveground and root dry weight of T.angustifolia within 2.5 mg·L-1Cd2+solution

2.3.2 菌株對香蒲吸收Cd的影響

由圖3可知，重金屬Cd主要富集在香蒲的根部，香蒲根Cd含量是地上部的62～84倍，接菌處理能夠改變香蒲組織中Cd含量。在2.5 mg·L-1Cd2+的條件中，P21、P29、P33和P39促進(jìn)香蒲根Cd含量增加，另4株芽孢桿菌減少了香蒲根Cd含量，但所有處理都沒有顯著差異。與CK相比，接種菌株P(guān)21和P29使香蒲地上部Cd含量分別顯著增加了31.3%和31.1%（P<0.05），P37和P39對香蒲地上部Cd含量的增加作用沒有達(dá)到顯著差異，其他4株芽孢桿菌減少了香蒲地上部Cd含量，但未達(dá)顯著性水平。

接菌處理都能增加香蒲根部和地上部Cd總吸收量。由圖4可知，在2.5 mg·L-1Cd2+的處理中，接菌處理使香蒲根Cd總吸收量增加了5.3%～56.8%，表現(xiàn)為 P37>P34>P24>P39>P29>P21>P33>P45，其中 P37、P34、P24、P39和P29使香蒲根Cd總吸收量顯著增加了 56.8%、49.2%、45.3%、37.3%和 33.4%（P<0.05）；接菌處理使香蒲地上部Cd總吸收量增加了1.7%～63.5%，其中接種菌株P(guān)29、P37和P21使香蒲地上部Cd總吸收量分別顯著增加了63.5%、55.1%和38.3%（P<0.05）。

2.3.3 菌株聯(lián)合香蒲去除水中Cd的效果

由圖5可以看出，水生植物香蒲耐受重金屬Cd，對水中Cd的去除率可達(dá)54.5%。8株芽孢桿菌處理都能強(qiáng)化香蒲對水中重金屬的去除效果，但8株芽孢桿菌與香蒲聯(lián)合去除Cd的作用存在明顯差異，聯(lián)合去除Cd效率表現(xiàn)為P24>P37>P39>P29>P45>P21>P33>P34。P24、P37、P39、P29 和 P45 聯(lián)合香蒲對 Cd的去除率范圍為69.1%～79.5%，與CK相比分別顯著提高 39.6%、32.3%、29.1%、23.4%和 21.3%（P<0.05）。P21、P33和P34對香蒲去除Cd的強(qiáng)化作用不顯著。

圖3 含Cd2+溶液中芽孢桿菌對香蒲根部和地上部Cd含量的影響Figure 3 Effects of Bacillus stains on the Cd content in the aboveground and root of T.angustifolia within 2.5 mg·L-1Cd2+solution

圖4 含Cd2+溶液中芽孢桿菌對香蒲根部和地上部Cd總吸收量的影響Figure 4 Effects of Bacillus stains on the Cd uptake in the aboveground and root of T.angustifolia within 2.5 mg·L-1Cd2+solution

圖5 芽孢桿菌強(qiáng)化香蒲去除水中Cd的作用Figure 5 Effects of T.angustifolia associated with Bacillus stains on the removal efficient of Cd

結(jié)合前面的結(jié)果分析，推測菌株P(guān)24和P37是通過促生作用顯著增加香蒲根部和地上部的干重，來增加香蒲對Cd的總吸收量；而P29主要是通過顯著增加香蒲地上部Cd含量來提高香蒲Cd總吸收量，從而達(dá)到去除水中Cd的作用。P39和P45對香蒲的促生作用和吸收Cd的影響都不顯著，但是對Cd的去除作用顯著，其機(jī)制還不清楚。

3 討論

Cd是水污染中常見也是環(huán)境中毒性最強(qiáng)的重金屬元素之一[3]，由于不能自然降解或生物降解，通常富集在水體中或沉積到水域底部，或被水生植物吸收，并通過食物鏈積累最終損害人類的健康。利用超積累植物修復(fù)重金屬污染水體的技術(shù)逐步發(fā)展，是當(dāng)前生物修復(fù)技術(shù)研究的熱點[10，17]。

香蒲對環(huán)境脅迫耐性較強(qiáng)，是國內(nèi)外公認(rèn)的濕地水生植物優(yōu)勢品種，在我國分布廣泛，包括長苞香蒲（T.angustata）、狹葉香蒲（T.angustifolia）、寬葉香蒲（T.latifolia）和東方香蒲（T.orientalis）等 11 種[30]。一些研究表明，50%以上的Cd富集在香蒲地下部，但不同種類的香蒲根對Cd的富集量存在較大差異，如東方香蒲根 Cd含量在 0.15～0.18 mg·kg-1之間[31]，寬葉香蒲根莖Cd含量范圍為0.003～8.99 mg·kg-1[32]，但狹葉香蒲根Cd含量可達(dá)幾百到幾千mg·kg-1[33-34]。在本研究中，Cd2+處理濃度為2.5 mg·L-1時，狹葉香蒲根Cd含量可高達(dá)4000 mg·kg-1，說明較其他香蒲品種而言，狹葉香蒲在富集Cd含量方面具有更大的優(yōu)勢。同時如何增強(qiáng)濕生植物對重金屬污染水體的適應(yīng)和耐受能力也是有效發(fā)揮濕生植物功能和作用的關(guān)鍵。Da Silva等[35]利用原位微生物群接種，強(qiáng)化兩種鹽沼植物（Juncus maritimus和 Phragmites australis）對重金屬的吸收，栽培2個月后P.australis莖干中Cd含量增加了7倍，具有植物提取潛力，而J.maritimus地下部總Cd吸收量增加了48%，可以用于植物穩(wěn)定。羅鵬程等[19]在 2.5 mg·L-1和 5 mg·L-1Cd2+脅迫下接種AM真菌，能夠促進(jìn)寬葉香蒲對Cd的吸收，地上和地下部Cd含量最大增加40.2%和56.5%。這些研究說明，通過微生物協(xié)同作用來強(qiáng)化水生植物富集重金屬是可行的。

植物根際和組織中分布著的多種細(xì)菌，在與植物的長期共同進(jìn)化中，已成為植物微生態(tài)系統(tǒng)的天然組成成分，能促進(jìn)植物對惡劣環(huán)境的適應(yīng)，加強(qiáng)系統(tǒng)的生態(tài)平衡。Li等[36]利用16S rDNA克隆文庫技術(shù)發(fā)現(xiàn)，生長于北京翠河濕地的狹葉香蒲根內(nèi)生細(xì)菌多樣性豐富。張瑞杰等[37]選用3種培養(yǎng)基從香蒲根組織中分離獲得305株內(nèi)生細(xì)菌，主要屬于假單胞菌屬和拉恩氏菌屬，篩選自LB培養(yǎng)基上的內(nèi)生細(xì)菌參與去除有機(jī)碳、重金屬和有機(jī)污染物的菌株比例較高，分別為3.95%、15.13%和8.55%。但這些內(nèi)生細(xì)菌或抗逆性較差，或與植物的相互作用不清楚，還不能用于生產(chǎn)實踐。芽孢桿菌是土壤和植物微生態(tài)區(qū)系的優(yōu)勢生物種群，容易存活繁殖，抗逆性強(qiáng)，對某些植物有很好的防病促生作用，在修復(fù)重金屬污染土壤上也有應(yīng)用潛力[38-40]。陳佛保等[41]篩選到芽孢桿菌DBM菌株在水稻受重金屬Zn（600 mg·kg-1）脅迫時能顯著促進(jìn)水稻的生長，并由于生物量增加使得水稻地上部和根部Zn總量增加。我們從礦區(qū)濕地植物根內(nèi)和根際土壤中篩選芽孢桿菌，并考察這些菌株的植物促生特性，結(jié)果表明篩選到的8株芽孢桿菌都能產(chǎn)生鐵載體和IAA，耐受多種重金屬，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，為聯(lián)合香蒲原位去除重金屬提供了菌種資源。

研究者認(rèn)為微生物促進(jìn)水生植物修復(fù)的機(jī)理主要有兩點：一是某些細(xì)菌產(chǎn)生的IAA、鐵載體等物質(zhì)能促進(jìn)植物生長，減少植物組織內(nèi)重金屬相對含量從而降低毒性；二是某些細(xì)菌產(chǎn)生的胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）能結(jié)合重金屬，減少其在根際環(huán)境中的生物毒性[17]。在本研究中，菌株P(guān)24和P37與其他6株細(xì)菌相比，產(chǎn)生IAA的量較高，對香蒲根部和地上部干重的增加幅度也較大，另外它們還具有分解無機(jī)磷作用，可為植物提供磷素營養(yǎng)。前人認(rèn)為IAA可以促進(jìn)植物橫向和不定根的發(fā)育[42]，因此還需進(jìn)一步研究在重金屬脅迫下菌株P(guān)24和P37對植物根系發(fā)育和磷素養(yǎng)分的影響，從而明確產(chǎn)IAA、溶磷菌株在修復(fù)過程中的作用機(jī)制。菌株P(guān)29促進(jìn)香蒲根部Cd含量，是否與菌株產(chǎn)生大量多糖改變Cd形態(tài)有關(guān)，也需要深入探究。

4 結(jié)論

（1）從南京湯山某礦區(qū)廢棄地的濕地植物根際和根內(nèi)共分離純化到8株具有促生作用的芽孢桿菌，其對Cd、Pb、Cu和Zn多種重金屬具有抗性。其中菌株P(guān)24和P37（B.megaterium）的IAA產(chǎn)量最高，菌株P(guān)29（B.amyloliquefaciens）的多糖產(chǎn)量最高。

（2）水生植物狹葉香蒲主要在根部積累Cd，接種芽孢桿菌P24和P37菌株顯著增加香蒲根部和地上部的干重，從而增加香蒲對Cd的總吸收量；而P29顯著增加香蒲地上部Cd含量，從而提高香蒲Cd總吸收量。

（3）B.megaterium P24、P37 菌株和 B.amyloliquefaciens P29菌株聯(lián)合香蒲對Cd的去除率分別達(dá)到79.5%、75.4%和70.3%，具有強(qiáng)化香蒲積累Cd、修復(fù)水體Cd污染的應(yīng)用潛力。

[1]韋麗麗,周 瓊,謝從新,等.三峽庫區(qū)重金屬的生物富集、生物放大及其生物因子的影響[J].環(huán)境科學(xué),2016,37（1）：325-334.

WEI Li-li,ZHOU Qiong,XIE Cong-xin,et al,Bioaccumulation and biomagnification of heavy metals in Three Gorges Reservoir and effect of biological factors[J].Environmental Science,2016,37（1）：325-334.

[2]陽金希,張彥峰,祝凌燕.中國七大水系沉積物中典型重金屬生態(tài)風(fēng)險評估[J].環(huán)境科學(xué)研究,2017,30（3）：423-432.

YANG Jin-xi,ZHANG Yan-feng,ZHU Ling-yan.Pollution and risk assessment of typical heavy metals in river sediments of seven major watersheds in China[J].Research of Environmental Sciences,2017,30（3）：423-432.

[3]謝曉君,王方園,王光軍,等.中國地表水重金屬污染的進(jìn)展研究[J].環(huán)境科學(xué)與管理,2017,42（2）：31-34.

XIE Xiao-jun,WANG Fang-yuan,WANG Guang-jun,et al.Study of heavy metal pollution in surface water in China[J].Environmental Science and Management,2017,42（2）：31-34.

[4]Brix H.Functions of macrophytes in constructed wetlands[J].Water Science and Technology,1994,29（4）：71-78.

[5]王 謙,成水平.大型水生植物修復(fù)重金屬污染水體研究進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2010,33（5）：96-102.

WANG Qian,CHENG Shui-ping.Review on phytoremediation of heavy metal pollution water by macrophytes[J].Environmental Science and Technology,2010,33（5）：96-102.

[6]張冬冬,肖長來,梁秀娟,等.植物修復(fù)技術(shù)在水環(huán)境污染控制中的應(yīng)用[J].水資源保護(hù),2010,26（1）：63-65.

ZHANG Dong-dong,XIAO Chang-lai,LIANG Xiu-juan,et al.Application of phytoremediation in water environmental pollution control[J].Water Resources Protection,2010,26（1）：63-65.

[7]Li J,Yu H X,Luan Y N.Meta-analysis of the copper,zinc,and cadmium absorption capacities of aquatic plants in heavy metal-polluted water[J].International Journal of Environmental Research and Public Health,2015,12（12）,14958-149573.

[8]Rezania S,Ponraj M,Talaiekhozani A,et al.Perspectives of phytoremediation using water hyacinth for removal of heavy metals,organic and inorganic pollutants in wastewater[J].Journal of Environmental Management,2015,163：125-133.

[9]Rezania S,Taib S M,Din M F M,et al.Comprehensive review on phytotechnology：Heavy metals removal by diverse aquatic plants species from wastewater[J].Journal of Hazardous Materials,2016,318：587-599.

[10]周桑揚(yáng),楊 凱,吳曉芙,等.人工濕地植物去除廢水中重金屬的作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].濕地科學(xué),2016,14（5）：717-724.

ZHOU Sang-yang,YANG Kai,WU Xiao-fu,et al.Advance in mechanism of removing heavy metals from wastewater by plants in wetlands[J].Wetland Science,2016,14（5）：717-724.

[11]喻 理,許 蒙,葉長城,等.香蒲-表面流濕地系統(tǒng)凈化灌溉水過程中鎘的分布和累積[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2016,35（8）：1573-1579.

YU Li,XU Meng,YE Chang-cheng,et al.Cadmium distribution and accumulation in surface-flow constructed wetland system with planted Typha angustifolia L.[J].Journal of Agro-Environment Science,2016,35（8）：1573-1579.

[12]Chen Y L,Hong X Q,He H,et al.Biosorption of Cr（Ⅵ）by Typha angustifolia：mechanism and responses to heavy metal stress[J].Bioresource Technology,2014,160：89-92.

[13]Chaturvedi A D,Pal D,Penta S,et al.Ecotoxic heavy metals transformation by bacteria and fungi in aquatic ecosystem[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2015,31：1595-1603.

[14]Wu H Q,Wu Q P,Wu G J,et al.Cd-resistant strains of B.cereus S5 with endurance capacity and their capacities for cadmium removal from cadmium-polluted water[J].Plos One,2016,11（4）：e0151479.

[15]Wood J L,Tang C X,Franks A E.Microbial associated plant growth and heavy metal accumulation to improve phytoextraction of contaminated soils[J].Soil Biology&Biochemistry,2016,103：131-137.

[16]Ma Y,Prasad M N,Rajkumar M,et al.Plant growth promoting rhizobacteria and endophytes accelerate phytoremediation of metalliferous soils[J].Biotechnology Advances,2011,29（2）：248-258.

[17]Stout L,Nusslein K.Biotechnological potential of aquatic plant-microbe interactions[J].Current Opinion in Biotechnology,2010,21（3）：339-345.

[18]胡智勇,陸開宏,梁晶晶.根際微生物在污染水體植物修復(fù)中的作用[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2010,33（5）：75-80.HU Zhi-yong,LU Kai-hong,LIANG Jing-jing.Role of rhizosphere microorganisms of aquatic plants in phytoremediation of wastewater[J].Environmental Science and Technology,2010,33（5）：75-80.

[19]羅鵬程,李 航,王曙光.濕生環(huán)境中叢枝菌根（AM）對香蒲耐Cd脅迫的影響[J].環(huán)境科學(xué),2016,37（2）：750-755.

LUO Peng-cheng,LI Hang,WANG Shu-guang.Effect of Arbuscular Mycorrhiza（AM）on tolerance of cattail on Cd stress in aquatic environment[J].Environmental Science,2016,37（2）：750-755.

[20]劉 煒,郭羿宏,張瑞杰,等.北京市白河濕地香蒲根際土壤細(xì)菌多樣性[J].濕地科學(xué),2016,14（5）：740-749.

LIU Wei,GUO Yi-hong,ZHANG Rui-jie,et al.Bacteria diversity of rhizosphere soils of Typha angustata in Baihe wetlands,Beijing[J].Wetland Science,2016,14（5）：740-749.

[21]王 璐,何琳燕,盛下放.耐銅蘇丹草根內(nèi)生細(xì)菌的分離篩選及其生物學(xué)特性研究[J].土壤,2016,48（1）：95-101.WANG Lu,HE Lin-yan,SHENG Xia-fang.Isolation of endophytic bacteria from roots of Cu-tolerant Sorghum sudanense and their biological characteristics[J].Soils,2016,48（1）：95-101.

[22]Lane D J.16S/23S rRNA sequencing[M]//Stackebrandt E,Goodfellow M（eds）.Nucleic acid techniques in bacterial systematics.Chichester：Wiley,1991：115-175.

[23]郜金榮.分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M].武漢：武漢大學(xué)出版社,2007：83-85.

GAO Jin-rong.Molecular biology experimental guidance[M].Wuhan：Wuhan University Press,2007：83-85.

[24]Dubois M,Gilles K A,Hamilton J K,et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry,1955,28（3）：350-356.

[25]曾東方,陳 玢,楊 帆,等.淀粉降解圈與酶活力相關(guān)性研究[J].中國釀造,2011,30（9）：132-134.

ZENG Dong-fang,CHEN Bin,YANG Fan,et al.Study on the correlation between starch degradation ring and enzyme activity[J].China Brewing,2011,30（9）：132-134.

[26]Gordon S A,Weber R P.Colorimetric estimation of indoleacetic acid[J].Plant Physiology,1951,26（1）：192-195.

[27]Mayer A M.Determination of indole acetic acid by the salkowsky reaction[J].Nature,1958,182（4650）：1670-1671.

[28]Schwyn B,Neilands J B.Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores[J].Analytic Biochemistry,1987,160（1）：47-56.

[29]Liu Z G,Li Y C,Zhang S A,et al.Characterization of phosphate-solubilizing bacteria isolated from calcareous soils[J].Applied Soil Ecology,2015,96：217-224.

[30]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志第8卷[M].北京：科學(xué)出版社,1992.2.China flora Editorial Committee,Chinese Academy of Sciences.Flora of China,Volume 8[M].Beijing：Science Press,1992.2.

[31]高靜湉,杜方圓,李衛(wèi)平,等.黃河濕地小白河片區(qū)優(yōu)勢植物重金屬的富集特征[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2016,35（11）：2180-2186.

GAO Jing-tian,DU Fang-yuan,LI Wei-ping,et al.Accumulation characteristics of heavy metals in dominat plants in Xiaobaihe Area of the Yellow River Wetland[J].Journal of Agro-Environment Science,2016,35（11）：2180-2186.

[32]Klink A,Polechonska L,Cegowska A,et al.Typha latifolia（broadleaf cattail）as bioindicator of different types of pollution in aquatic ecosystems-application of self-organizing feature map（neural network）[J].Environmental Science and Pollution Research,2016,23（14）：14078-14086.

[33]張 弛,袁亞光,欽 佩,等.香蒲對重金屬鎘的耐性及吸收途徑研究[J].南京大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)）,2013,49（4）：506-511.

ZHANG Chi,YUAN Ya-guang,QIN Pei,et al.Characteristics of cadmium tolerant and absorption in Typha angustifolia[J].Journal of Nanjing University（Natural Sciences）,2013,49（4）：506-511.

[34]Zhao H,Jin Q J,Wang Y J,et al.Effects of nitric oxide on alleviating cadmium stress in Typha angustifolia[J].Plant Growth Regulation,2016,78（2）：243-251.

[35]Da Silva M N,Mucha A P,Rocha A C,et al.A strategy to potentiate Cd phytoremediation by saltmarsh plants：Autochthonous bioaugmentation[J].Journal of Environmental Management,2014,134：136-144.

[36]Li Y H,Liu Q F,Liu Y,et al.Endophytic bacterial diversity in roots of Typha angustifolia L.in the constructed Beijing Cuihu Wetland（China）[J].Research in Microbiology,2011,162（2）：124-131.

[37]張瑞杰,張瓊瓊,黃興如,等.基于分離培養(yǎng)方法的香蒲根內(nèi)生細(xì)菌多樣性[J].濕地科學(xué),2016,14（2）：201-211.

ZHANG Rui-jie,ZHANG Qiong-qiong,HUANG Xing-ru,et al.Diversity of endophytic bacteria in roots of Typha orientalis estimated by culture method[J].Wetland Science,2016,14（2）：201-211.

[38]何琳燕,李 婭,劉 濤,等.龍葵根際和內(nèi)生Cd抗性細(xì)菌的篩選及其生物學(xué)特性[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報,2011,27（6）：83-88.

HE Lin-yan,LI Ya,LIU Tao,et al.Isolation and characterization of cadmium-resistant endophytic and rhizobacteria from solanum nigrum in orefield[J].Journal of Ecology and Rural Environment,2011,27（6）：83-88.

[39]王 偉,岳政府,劉孝文,等.低溫適應(yīng)型植物根際促生細(xì)菌的篩選及促生效應(yīng)研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2017,40（1）：93-100．

WANG Wei,YUE Zheng-fu,LIU Xiao-wen,et al.Screening of low temperature adapted plant growth-promoting rhizobacteria and investigation of their promoting effects[J].Journal of Nanjing Agricultural U－niversity,2017,40（1）：93-100．

[40]余勁聰,何舒雅,曾潤穎,等.芽孢桿菌修復(fù)土壤重金屬鎘污染的研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2016（1）：73-78.

YU Jin-cong,HE Shu-ya,ZENG Run-ying,et al.Research progress in remediation of cadmium contaminated soil with Bacillus[J].Guangdong Agricultural Sciences,2016（1）：73-78.

[41]陳佛保,柏 珺,林慶祺,等.植物根際促生菌（PGPR）對緩解水稻受土壤鋅脅迫的作用[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2012,31（1）：67-74.

CHENFo-bao,BAIJun,LINQing-qi,etal.Applicationofplantgrowthpromoting rhizobacteria（PGPR）for reducing zinc stress on paddy rice[J].Journal of Agro-Environment Science,2012,31（1）：67-74.

[42]Spaepen S,Vanderleyden J,Remans R.Indole-3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling[J].FEMS Microbiology Reviews,2007,31（4）：425-448.

Isolation of heavy metal resistant and plant growth promoting Bacillus strains and effects on cadmium removal by Typha angustifolia

PANG Hai-dong,HE Zhuo,YAN Chuan-ming,SHENG Xia-fang,HE Lin-yan*
（Key Laboratory of Agricultural and Environmental Microbiology,Ministry of Agriculture,College of Life Sciences,Nanjing Agricultural U－niversity,Nanjing 210095,China）

Metal resistant bacteria provide an effective way to enhance heavy metal removal rates of wetland phytoremediation systems.In this work,heavy metal resistant rhizobacteria and endophytic bacteria were isolated from plants growing in the waste mine wetland in Nanjing,Jiangsu,China.The effects of the bacteria on plant growth and cadmium removal by the narrow-leaved cattail（Typha angustifolia L.）under excessive cadmium exposure were investigated.The results indicated that the eight metal resistant Bacillus strains isolated from the aquatic plants showed a variety of growth promoting features including solubilizing phosphate and producing indole acetic acid（IAA）,siderophores,polysaccharides,and amylase.The isolates showed resistance to Cd,Pb,Cu,and Zn and tolerance to acids,alkalis,and salts.The growth of T.angustifolia was greatly promoted and the content of Cd in T.angustifolia increased after inoculation of the Bacillus strains into a Cd2+-containing solution.The dry weights of the root and aboveground tissues of T.angustifolia inoculated with Bacillus megaterium P24 and P37 were significantly increased by 40.0%～46.4%,compared with the control.Besides,the Cd content（31.1%）and total Cd uptake（63.5%）in the aboveground tissue increased when inoculated with Bacillus amyloliquefaciens P29.The highest Cd removal rate was 79.5%,after inoculation with B.megaterium P24.The results suggest that the metal resistant B.amyloliquefaciens P29 and B.megaterium P24 and P37 could be used as effective inoculants for improved phytoremediation in metal polluted waters.

Bacillus species;Typha angustifolia;heavy metal contaminated waters;remediation;cadmium

X172

A

1672-2043（2017）11-2314-08

10.11654/jaes.2017-0648

龐海東，賀 卓，燕傳明，等.耐重金屬的植物促生芽孢桿菌篩選及其強(qiáng)化香蒲去除Cd的作用[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2017,36（11）：2314-2321.

PANG Hai-dong,HE Zhuo,YAN Chuan-ming,et al.Isolation of heavy metal resistant and plant growth promoting Bacillus strains and effects on cadmium removal by Typha angustifolia[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（11）：2314-2321.

2017－05－04 錄用日期：2017-07-24

龐海東（1990—），男，碩士研究生，研究方向為微生物-植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染。E-mail：604716709@qq.com

*通信作者：何琳燕 E-mail：helyan0794@njau.edu.cn

國家自然科學(xué)基金項目（41471273）

Project supported：The National Natural Science Foundation of China（41471273）