楊 昊

（山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250000）

固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜同時檢測動物源性食品獸藥殘留

楊 昊

（山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250000）

利用固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜方法對喹諾酮類與青霉素類2類15種獸藥在動物源性食品中的殘留情況進行檢測。樣品經(jīng)丙醇-乙酸乙酯（5∶5）提取，由不經(jīng)活化的prime HLB固相萃取柱凈化，使用甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）作為流動相，電噴霧離子源分段多反應監(jiān)測掃描模式檢測。15種獸藥檢出限為0.5～2.0 μg/kg，定量限為2.0～5.0 μg/kg，各基質中回收率為71.3%～96.5%，相對標準偏差為2.1%～9.2%。采用此方法，能有效提高多殘留獸藥的檢測效率，可良好應用于食品安全問題中獸藥殘留的快速分析。

固相萃??；超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法；獸藥殘留；動物源性食品

近年來，獸藥（含飼料藥物添加劑在內）在畜牧業(yè)的應用愈發(fā)廣泛，動物性食品中的獸藥殘留現(xiàn)象亦日益發(fā)展為很多人共同關注的一個社會焦點[1]。

當前，對違禁藥物予以非法使用、濫用抗菌藥物及藥物添加劑等行為均已成為我國動物源性食品中獸藥殘留超標、畜禽產(chǎn)品消費不安全等的主要原因之一。基于對獸藥性質差異明顯，當前殘留分析大多采用類似于化學類結構的同組藥物進行相應方法的開發(fā)、多類殘留的同時檢測報道較少、檢測周期長、成本高、效率低[2]等因素的考慮，為增加藥物分析的種類，滿足多類獸藥風險篩查與檢測工作的需求，應加強現(xiàn)代農(nóng)藥檢測領域中關于不同類別農(nóng)藥多殘留問題的檢測，完善檢測方法與基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

實驗過程所用儀器包括：Qasis Prime HLB200mg/6ml固相萃取柱、Acquity UPLC液相色譜儀、Xevo TQ-S質譜儀、Thermo XIR高速冷凍離心機、Milli Q超純水系統(tǒng)、GM200刀式研磨儀以及ENVI氮吹儀等。實驗所用試劑有：甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）以及15種獸藥標準品（喹諾酮類12種、青霉素類3種）[3]。

1.2 樣品制備

為了滿足樣品的均質[4]要求，需對其進行去脂處理，以此為前提，稱取2.00 g樣品放入材質為聚四氟乙烯的離心管中，加入10 mL乙酸鈉-乙酸緩沖液（濃度為0.2 mol/L，pH值為5.2），待其充分渦旋呈均質狀態(tài)后，加入 50μL β-葡萄糖醛苷酶進行振蕩酶解，保持溫度為 37 ℃，振蕩速度 200 r/min，整個酶解過程不能小于 6 h。完成酶解作業(yè)后，取出并將其冷卻至室溫水平，以1 000 r/min的速度進行10 min渦旋，之后將所有的上清液取出來，放到一個新的離心管中，滴入氫氧化鈉溶液（濃度為10 mol/L）對其pH值進行調節(jié)，直至達到11.0的水平。然后，加入異丙醇-乙酸乙酯溶液（滿足體積比為5:5）與飽和氯化鈉溶液各10 mL，完全渦旋提?。ㄔ摬僮鲿r間為10 min），以10 000 r/min的速度做離心處理，將分離后的上層有機相清液取出來，用氮氣吹干（溫度保持在40 ℃）。最后，加入5 mL乙酸鈉-乙酸緩沖液對殘差進行充分溶解，上柱。

用3 mL甲醇與3 mL水對柱后樣液（規(guī)格為25 mg/10mL）進行活化處理，待其溶解后全部上柱，將流速控制在1滴/s，順序采用3 mL水、3 mL甲醇水溶液（濃度為60%）以及1 mL甲醇將MIP柱清洗干凈，之后，對其進行真空負壓抽干處理，用2mL甲醇溶液洗脫，控制流速于1滴/s的水平上。

之后，對洗脫液進行收集，用微弱氮氣流將其吹干（保持溫度在40 ℃），用1 mL初始比例流動相復溶，過親水性聚丙烯膜（厚度為0.2 μm），待測。

表1 5種獸藥中代表性化合物的多反應監(jiān)測離子對與質譜參數(shù)（簡表）Table 1 The multi-reaction monitoring ions pairs and mass spectrometric parameters of representative compound in five veterinary drugs(simple list)

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

柱溫恒定為35 ℃；流速為0.45 mL/min；液相色譜柱為Water Acquity UPLC BEHC18；流動相A為甲醇，流動相 B為乙酸銨水溶液（規(guī)格為 5 mmol/L，含0.1甲酸）；進樣量為10μL。梯度順序如下：0～5 min，95%～80% B；0.5～10 min，80%～60%B；1.0～2.5 min，60%～40% B；2.5～3.0 min，40% B；3.0～3.5 min，40%～1% B；3.5～4.5 min，1% B；4.5～5.0min，1%～95% B；5.0～6.0 min，95% B。

1.3.2 質譜條件

選用電噴霧離子源（ESI），以正離子方式進行掃描、動態(tài)多反映監(jiān)測方式進行監(jiān)察與測量（各質譜掃描窗口為對應化合物保留±0.5 min的時間），毛細管電壓為800 V，脫溶劑氣溫度與氣流量分別為450 ℃與800 L/h，錐孔氣流量150 L/h，霧化氣壓力7.0 bar。表1所示為其他相關參數(shù)。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

采用如上所述實驗方法，測定后的混合標準溶液色譜圖如圖1所示。

2.2 儀器與工作參數(shù)的選擇

以BEHC18超高效液相色譜柱為分離介質，采用流動注射方法，對移取的溶液分別在電噴霧正模式下進行母離子與子離子兩種掃描，為提高靈敏度至最佳水平，還要對去簇電壓與碰撞氣電壓等參數(shù)予以優(yōu)化。以不同溶液作為流動相，對化合物的分離情況、峰值以及響應值大小進行考察。結果發(fā)現(xiàn)：因接受正離子模式檢測，在流動相中加入酸能夠對信號響應予以增強，緩沖鹽的加入則有利于峰形的變化。所以，最終選擇的流動相為甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液，其中，乙酸銨水溶液中含有0.1的甲酸。

圖1 15種獸藥的動態(tài)多反應監(jiān)測色譜圖Fig.1 The dynamic multi-response monitoring chromatogram of fifteen veterinary drugs

2.3 提取與凈化條件選擇

2.3.1 提取方式選擇

對于多殘留檢測，目標化合物的前處理方式十分重要。此次試驗中檢測的獸藥化學結構普遍存在亞氨基等功能團，容易溶于甲醇等極性溶劑中，在水溶液中通常呈現(xiàn)弱堿性。在取代集團的作用下，化合物之間存在比較明顯的性質差異，即使它們屬于同族藥物，pKa也會有較大的不同。舉例而言，硝基咪唑類化合物的pKa值通常在2.8～11.4之間，這說明它有一些中性與偏酸性藥物，故樣品前處理難度會比較大。實驗優(yōu)化了多種溶劑種類，并對搭配比例不同的處理效率進行了對比分析。結果顯示，乙腈的提取效率較低，而乙酸乙酯與異丙醇對不同化合物的分配又各不相同，致使配比不同的情況下得到的提取效率也存在相應的差異，經(jīng)過進一步考察，在綜合考慮所有化合物的前提下，做出以異丙醇-乙酸乙酯（5∶5）進行提取的最終選擇。

2.3.2 固相萃取方式的選擇與優(yōu)化

由于目標化合物有不同的極性，且對不同固相萃取柱的適應性也存在差異，為在所有的化合物中予以應用，所選擇的固相萃取柱應符合極性吸附原理，經(jīng)凈化處理，不僅可以去除磷脂、蛋白質等雜志，還能夠最小化凈化處理對化合物產(chǎn)生的負面影響。在HLB親水親脂平衡柱的基礎之上，Prime HLB會在相應地增強干擾物的效果，同時，優(yōu)化篩板，避免堵塞狀況的出現(xiàn)。實現(xiàn)對不同親水親脂平衡柱進行對比研究，結果表明，prime HLB在降低雜質干擾中的效果最為明顯，對于某種相對比的喹諾酮類、青霉素類化合物而言，會有更高的回收率。

2.4 方法學驗證

2.4.1 基質效應

從原理上看，液相色譜-質譜分析中的基質效應不能完全消除[5]，一般會通過稀釋法、標準加入法、內標法、陰性基質匹配標準溶液對基質效應造成的誤差進行修正或削弱。本實驗采用優(yōu)化梯度洗脫程序與陰性基質匹配標準溶液法對基質效應予以抵消。

表2 15種獸藥線性范圍、方程、相關系數(shù)、檢出限與定量限表Table 2 The linearity range, equation, coefficient association, LOD and LOQ of fifteen veterinary drugs

2.4.2 線性關系與檢出限

依照以上條件，將混合標準工作溶液上機測定，在制作標準工作曲線之時，橫坐標用以表示質量濃度，縱坐標則用于表示峰面積。結果顯示，接受檢測的獸藥在對應濃度范圍內線性比較好。通過定量子離子的3倍信噪比進行檢出限（LOD）的計算，10倍信噪比則用于定量限（LOQ）的計算，加入標準物質測定，得到如表2所示結果。由表可知，獸藥 LOD 為 0.5～2.0 μg/kg，LOQ 為 2.0～5.0 μg/kg，靈敏度能夠對實際樣品檢測所需予以滿足。

2.4.3 回收率與重現(xiàn)性

在豬肉、魚肉中分別添加3個不同濃度的混合標準溶液，對它們進行6次回收率實驗，結果顯示，所測化合物在豬肉、魚肉中的回收率維持在71.3%～96.5%的水平內，相對標準偏差（RSD）在2.1%～9.2%的范圍內，表明該方法的精密度較高，可對實際樣品的檢測所需予以滿足。

2.5 實際樣品測定

采用實驗所用方法，對市場中銷售的豬肉、魚肉共 20份進行快速篩查。與國家標準方法GBT20366-2006及GBT21312-2007進行比較，所得測定結果大體相同，這意味著該方法能夠應用于動物源食品中獸藥殘留的快速篩查與定量測定。

3 結 論

為預防、治療與診斷動物疾病，或有目的地對動物生理機能進行調節(jié)，我國很多畜牧業(yè)經(jīng)營企業(yè)都開始使用多種類獸藥。消費者在不知情的情況下食用動物源性食品后，殘留在食品中的獸藥成分短期內可能不會對人體產(chǎn)生影響，但長期、大量的食用會對其肝、腎、心臟等器官造成巨大損傷[6]。為有效解決上述問題，避免消費者因食用含獸藥殘留類動物源性食品而引致生理機能受損現(xiàn)象的發(fā)生，實驗提出一種具體的檢測方法：固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜同時檢測法，對豬肉、魚肉中15種獸藥的殘留情況進行檢測。固相萃取法具有快速與簡便優(yōu)勢，較之標準方法與已有報道，可減少活化、淋洗等耗時較多的環(huán)節(jié)，有效縮短樣品處理時間。經(jīng)驗證，固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜方法在測定低限、回收率以及精密度等方面均能對殘留檢測需求予以滿足，在動物源性食品中獸藥殘留的檢測中適用性較高。

［1］郭德華，鄧曉軍，趙善貞，等.固相萃取-高效液相色譜/串聯(lián)質譜同時檢測動物源性食品中76種獸藥殘留[J].分析化學，2010（3）：318-324.

［2］陳剛，鄧曉軍，孫錦蘭，等.高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定動物源性食品中35種獸藥殘留量[J].理化檢驗-化學分冊，2014（7）：809-814.

［3］郝杰，姜潔，余建龍，等.固相萃取-超過效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定動物源性食品中多種獸藥殘留[J].食品科學，2017（12）：266-272.

［4］郝杰，姜潔，邵瑞婷，丁學妍，史娜，路勇.分子印跡固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定動物源性食品中11種β-受體阻斷劑殘留[J].分析測試學報，2016（10）：1278-1282.

［5］王京，王慶齡，葉佳明，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定動物源食品中30種獸藥殘留[J].分析實驗室，2016（8）：955-960.

［6］朱捷，何微，馬桂娟.HPLC-MS/MS法同時測定補腎壯陽類保健食品中非法添加11中化學藥成分[J].當代化工，2015（11）：2729-2732.

Simultaneous Determination of Veterinary Drug Residues in Animal-origin Food by Solid Phase Extraction-Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

YANG Hao
（Shandong Food and Drug Inspection Institute,Shangdong Jinan 250101, China）

15 Kinds of veterinary drug residues in animal-origin food were detected by solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry. Samples were extracted by acetone-ethyl acetate, and were purified by a prime HLB solid phase extraction column. The eluate was detected by multiple reaction monitoring scanning with electronic spray ionization. The limits of quantitation for 15 veterinary drugs were in the range of 2.0～5.0 μg/kg, as well as the detection limits were 0.5～2.0 μg/kg. Recoveries from different food matrices were 71.3%～96.5% with relative standard deviations between 2.1%～9.2%. This method is significantly efficient in the determination of multiple veterinary drugs and suitable for rapid analysis of veterinary drugs.

Solid phase extraction; UPLC-MS/MS; Veterinary drug residue;Animal-derived food

O 657.63；O 657.7+2；O 658.2

A

1671-0460（2017）11-2386-03

2017-09-01

楊昊（1986-），男，山東省樂陵市人，工程師，研究方向：食品中農(nóng)藥獸藥殘留在液相色譜質譜中檢測方法研究。