張旻南
摘要:分子量內(nèi)標(biāo)是STR分型時用來標(biāo)定樣品峰大小的重要內(nèi)參,目前常用的內(nèi)標(biāo)如ABI公司LIZ500等都是采用PCR擴(kuò)增的方法制備,這種方法制備的內(nèi)標(biāo),由于引物二聚體的長度與內(nèi)標(biāo)中的小片段長度相近,不易于純化,因此混有引物峰,容易在數(shù)據(jù)分析時產(chǎn)生誤判,且不易于規(guī)?;a(chǎn)。本實驗采用定點突變技術(shù)結(jié)合酶切PCR產(chǎn)物的方法,制備了從50bp到500bp共14個片段的分子量內(nèi)標(biāo),制備的產(chǎn)物沒有引物峰等雜峰,且制備工藝適用于規(guī)?;a(chǎn),對獲得的內(nèi)標(biāo)片段進(jìn)行線性化分析,R值=0.9999,符合線性化要求,可以用作STR分型的分子量內(nèi)標(biāo)。
關(guān)鍵詞:定點突變;酶切;分子量內(nèi)標(biāo)
0 引言
分子量內(nèi)標(biāo)是在進(jìn)行STR檢測時與樣品在同一通道電泳的一系列長度不同的
DNA片段,在數(shù)據(jù)分析時,通過分析樣品DNA與分子量內(nèi)標(biāo)的相對出峰位置,就可以標(biāo)定樣品DNA的大小。在電泳時,分子量內(nèi)標(biāo)的出峰時間和峰型也可以反映電泳儀器的工作狀態(tài)。目前常用的分子量內(nèi)標(biāo),如ABI公司的LIZ500,采用的直接PCR擴(kuò)增的方法制備,得到的產(chǎn)物無法消除引物峰,且由于采用不同引物擴(kuò)增,不同片段的擴(kuò)增效率也有差異,這些問題導(dǎo)致其制備工藝不易于規(guī)模化生產(chǎn)。本實驗利用定點突變技術(shù)把限制性內(nèi)切酶位點引入同一DNA片段的不同位置,獲得一系列突變位置不同的重組質(zhì)粒。然后采用同一對引物擴(kuò)增重組質(zhì)粒,擴(kuò)增效率相同,擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)純化后可以完全去除引物DNA,經(jīng)酶切后的片段峰高易于調(diào)平。本實驗制備的分子量內(nèi)標(biāo)中沒有引物峰等雜峰的影響,峰型良好,線性化分析R值=0.9999,可以作為STR分型的分子量內(nèi)標(biāo)。
1 材料與方法
1.1 實驗材料與儀器
1.1.1 實驗材料與試劑
9947DNA,GO taq PCR mix,EcoR V限制性內(nèi)切酶(NEB公司),DpnI限制性內(nèi)切酶,Qiagen DNA純化試劑盒,Qiagen DNA質(zhì)粒提取試劑盒,T載體(TAKARA),DH5α感受態(tài)細(xì)胞,定點突變試劑盒
1.1.2 實驗儀器
GA118-16A,PCR擴(kuò)增儀(ABI Pro Flex PCR系統(tǒng)),六一平板電泳儀,離心機(jī)(effendorf)。
1.2 實驗方案
1.2.1 引物的設(shè)計
從Genebank上查找并下載人類基因組全序列,從中選取一段長度500bp的序列。這段序列要求堿基含量均衡,沒有poly結(jié)構(gòu)、回文結(jié)構(gòu)等特殊序列,使用primer5.0設(shè)計引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,序列如下:
F: TTCAAGTCAGGGTTTCCAAG
R: TTTTAGAGATAAGGTGTGCGT
其中,引物F的5端采用6FAM熒光標(biāo)記,命名為F-FAM。
1.2.2 目的片段的擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的獲得
(1)以9947DNA為模板,F(xiàn)、R為引物,采用GO taq PCR mix進(jìn)行擴(kuò)增。其中,GO taq PCR mix 12.5μl;9947DNA 1μl(濃度1ng/μl);引物F、R各1μl(濃度10μM);雙蒸水9.5μl。擴(kuò)增程序:預(yù)變性95℃,5min;95℃,30s;57℃,40s;72℃,30s;40個循環(huán);終延伸72℃,10min。
(2)采用Qiagen DNA純化試劑盒對上步中擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行純化,純化步驟詳見試劑盒說明書。
(3)將純化得到的目的片段連接到T載體,轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞,鋪板并挑斑擴(kuò)大培養(yǎng)(步驟詳見T載體說明書)。
(4)采用Qiagen DNA質(zhì)粒提取試劑盒參照試劑盒說明書提取質(zhì)粒,并測序。測序的序列與Genebank上選取的序列進(jìn)行比對,要求沒有發(fā)生任何突變,將此質(zhì)粒命名為質(zhì)粒A。
1.2.3 突變質(zhì)粒的獲得
按照定點突變試劑盒說明書的操作步驟,在質(zhì)粒A的50bp,75bp,100bp,139bp,150bp,160bp,200bp,250bp,300bp,350bp,400bp,450bp,490bp位點分別進(jìn)行定點突變,引入EcoR V限制性內(nèi)切酶酶切位點GAT^ATC,得到質(zhì)粒A-50,A-75,A-100,A-139,A-150,A-160,A-200,A-250,A-300,A-350,A-400,A-450,A-490。經(jīng)測序驗證,引入的突變位點序列正確。
1.2.4 熒光片段的擴(kuò)增與酶切
(1)以上一步獲得的突變質(zhì)粒為模板,采用GO taq PCR mix進(jìn)行擴(kuò)增,其中GO taq PCR mix 12.5μl;9947DNA 1μl(濃度1ng/μl);引物F、R各1μl(濃度10μM);雙蒸水9.5μl。擴(kuò)增程序:預(yù)變性95℃,5min;95℃,30s;57℃,40s;72℃,30s;40個循環(huán);終延伸72℃,10min。
(2)采用Qiagen DNA純化試劑盒對上步中擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行純化,純化步驟詳見試劑盒說明書。
(3)將上步中純化后的產(chǎn)物分別用EcoR V限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,酶切體系:
DNA 1ug,EcoR V酶 1μl,10X buffber 2μl,雙蒸水補(bǔ)足10μl。酶切反應(yīng)條件:30℃孵育30min;65℃滅活20min.。
1.2.5 熒光片段的混合與檢測
將上步酶切得到的片段按一定比例混合,取1μl混合產(chǎn)物與9μl甲酰胺混合,
95℃變性3分鐘,立即置于冰上,在ABI3130上進(jìn)行檢測,進(jìn)樣電壓1kV,進(jìn)樣時間15s,電泳電壓15kV,電泳時間1500s。
2 結(jié)果與分析
分子量內(nèi)標(biāo)經(jīng)ABI3130檢測,結(jié)果如圖1所示,峰型完好,沒有引物峰及其他雜峰,各片段峰高均衡。經(jīng)Genenmappper軟件分析,各個片段大小判定正確。
對各個片段的出峰位置和片段大小進(jìn)行線性分析,R值=0.9999,如圖2所示。
本實驗利用定點突變技術(shù)把限制性內(nèi)切酶位點引入同一DNA片段的不同位置,獲得一系列突變位置不同的重組質(zhì)粒。各重組質(zhì)粒除了酶切位點的位置不同,其他序列完全一致,因此可以采用同一對引物進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增效率相同。擴(kuò)增后的片段都是500bp,通過純化可以完全除去引物及引物二聚體。不同重組質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)物含有同一個酶切位點,可以通過一次酶切反應(yīng)得到長度不同的酶切產(chǎn)物。
本實驗制備的分子量內(nèi)標(biāo)中沒有引物峰等雜峰的影響,峰型良好,線性化分析R值=0.9999,可以作為STR分型的分子量內(nèi)標(biāo)。
本實驗方案易于規(guī)?;a(chǎn),制作的分子量內(nèi)標(biāo)可以完全取代ABI LIZ500作為GA118系列遺傳分析儀的性能檢驗試劑。
參考文獻(xiàn):
[1]雒麗娜.利用重疊延伸PCR技術(shù)進(jìn)行定點突變研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012
[2]張浩.定點突變技術(shù)的研究進(jìn)展[J].免疫學(xué)雜志,2000endprint