李晶，徐洪玉

（山東省交通醫(yī)院 皮膚科，山東 濟(jì)南 250031）

XIAP在尖銳濕疣組織中的表達(dá)及其與HPV分型的相關(guān)性

李晶，徐洪玉

（山東省交通醫(yī)院 皮膚科，山東 濟(jì)南 250031）

目的探討X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）在尖銳濕疣組織中的表達(dá)及其與人乳頭瘤病毒感染的關(guān)系。方法免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)尖銳濕疣和正常包皮組織中XIAP的表達(dá)，采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外擴(kuò)增和反向點(diǎn)雜交相結(jié)合的DNA芯片技術(shù)對(duì)尖銳濕疣組織進(jìn)行基因分型檢測(cè)。結(jié)果正常包皮組、尖銳濕疣未復(fù)發(fā)組和復(fù)發(fā)組中XIAP的陽性表達(dá)率依次升高（分別是26.67%、53.49%和79.31%），3者之間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；XIAP在高危型HPV組與正常對(duì)照組的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高危型HPV組高于對(duì)照組；在高危型與低危型組間、低危型與正常對(duì)照組間的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；XIAP在不同年齡及性別患者間的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而患者不同的病程及復(fù)發(fā)次數(shù)，XIAP陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論尖銳濕疣組織中XIAP表達(dá)上調(diào)可能是其發(fā)生和復(fù)發(fā)的重要原因，XIAP在尖銳濕疣的惡性轉(zhuǎn)化過程中可能起促進(jìn)作用，對(duì)判斷患者病情預(yù)后具有一定的參考價(jià)值。

尖銳濕疣；X連鎖凋亡抑制蛋白；人乳頭瘤病毒；復(fù)發(fā)；凋亡

凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，IAP）是細(xì)胞內(nèi)一類獨(dú)特的抗凋亡蛋白家族，首先發(fā)現(xiàn)于桿狀病毒，能抑制病毒感染導(dǎo)致的宿主細(xì)胞死亡，而X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）是家族中抑制凋亡最有力的成員，可通過多種途徑阻礙內(nèi)源性或外源性凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展[1]。已有研究顯示XIAP在胃癌、肺癌及食管癌等多種腫瘤組織中過度表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、臨床分期及對(duì)放化療的敏感性等密切相關(guān)[2-4]。尖銳濕疣（condyloma acuminatum，CA）是由人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染引起的一種慢性良性增殖性疾病，其生物學(xué)行為類似良性腫瘤。近年來，HPV（尤其是高危型HPV）的致癌性已得到證實(shí)，在與HPV感染有關(guān)的宮頸癌中XIAP表達(dá)異常[5]。而目前關(guān)于CA與XIAP的文獻(xiàn)較少，且缺乏對(duì)XIAP與HPV感染的相關(guān)性進(jìn)行研究。本研究初步探討XIAP在CA發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與CA的HPV分型、各臨床參數(shù)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年6月-2015年4月于山東省交通醫(yī)院性病門診就診的72例患者，皮損均取自外生殖器部位，分別以石蠟包埋和液氮冰冷兩種方式保存，經(jīng)組織病理學(xué)確診為CA。所有患者就診前2周未做任何治療，無系統(tǒng)性疾病史，不合并有其他感染性疾病。30例包皮標(biāo)本作為對(duì)照組，取自本院泌尿外科行包皮環(huán)切術(shù)者，患者系健康男性，既往無CA等外生殖器疾病，經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)為正常上皮。

1.2 分組

1.2.1 治療后隨訪 分為未復(fù)發(fā)組（經(jīng)徹底治療皮損消退后，在3個(gè)月隨訪期內(nèi)，在原皮損處或鄰近部位無新發(fā)疣體）和復(fù)發(fā)組（經(jīng)徹底治療后隨訪3個(gè)月，無再次接觸史的情況下，在原皮損處或鄰近部位有新疣體者）[6]。其中，未復(fù)發(fā)組43例，男性26例，女性17例；年齡20～45歲，平均29.1歲；病程0.5～4個(gè)月，平均2.3個(gè)月。復(fù)發(fā)組29例，男性16例，女性13例；年齡22～53歲，平均31.5歲；病程0.5～5個(gè)月，平均2.8個(gè)月；復(fù)發(fā)次數(shù)1～6次，平均3.1次。

1.2.2 HPV基因分型檢測(cè) 分為高危型組和低危型組，雙重感染和多重感染中合并有高危型感染者歸為高危型組。

1.3 試劑

兔抗人XIAP多克隆抗體、SV超敏兩步法免疫組織化學(xué)試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；HPV基因分型檢測(cè)試劑盒購自深圳亞能生物技術(shù)有限公司，可同時(shí)分型檢測(cè)15種HPV型別，包括13種 高 危 型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59及 68，2種低危型 ：6、11。

1.4 方法

1.4.1 免疫組織化學(xué)染色 所有標(biāo)本均連續(xù)切片2張，切片厚度4 μm，1張用于免疫組織化學(xué)染色，1張行蘇木精-伊紅染色法染色，進(jìn)行組織病理確診。免疫組織化學(xué)操作均嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行。用已知陽性標(biāo)本做陽性對(duì)照，磷酸鹽緩沖溶液代替一抗做陰性對(duì)照。

1.4.2 HPV基因分型檢測(cè) 采用HPV基因分型檢測(cè)試劑盒中PCR體外擴(kuò)增和反向點(diǎn)雜交相結(jié)合的DNA芯片技術(shù)。所有操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) XIAP陽性染色定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜。細(xì)胞陽性表達(dá)強(qiáng)度按照以下方法進(jìn)行半定量分析，①按細(xì)胞著色強(qiáng)度：淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；②按陽性細(xì)胞百分比：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分，兩者分值的乘積即為細(xì)胞陽性表達(dá)強(qiáng)度，其分級(jí)方法為：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），6～8分為陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。采用單盲法，每張切片任選2個(gè)皮片，每個(gè)皮片隨機(jī)選取表皮層5個(gè)高倍（×400）視野進(jìn)行評(píng)分，取其得分的平均數(shù)作為該標(biāo)本分值。將（+）（+++）歸為陽性表達(dá)組計(jì)算陽性率[7]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組與未復(fù)發(fā)、復(fù)發(fā)組XIAP表達(dá)比較

未復(fù)發(fā)組XIAP陽性率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.203，P=0.031）；未復(fù)發(fā)組XIAP陽性率與復(fù)發(fā)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.005，P=0.044）；復(fù)發(fā)組XIAP陽性率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.389，P=0.000）。XIAP陽性著色主要位于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜。在正常皮膚組織中，陽性細(xì)胞主要位于基底層及棘層中下部，數(shù)目較少，染色較淺，呈灶狀分布；而在CA組織中，陽性細(xì)胞分布于表皮全層，以棘層為主，染色較強(qiáng)。見表1。

2.2 HPV基因分型結(jié)果

72例CA標(biāo)本中有58例HPV-DNA陽性，檢出率為80.56%。14例為陰性結(jié)果，這14例患者的臨床表現(xiàn)和組織病理均符合CA改變，考慮可能為所檢測(cè)的15種HPV型別之外的其他HPV型別感染。58例陽性標(biāo)本中低危型43例（74.14%），高危型15例（25.86%）。

2.3 HPV感染組XIAP陽性率的比較

低危型組和高危型組XIAP的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.809，P=0.235）；高危型組和對(duì)照組XIAP的陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.667，P=0.022）；低危型組和對(duì)照組XIAP的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.943，P=0.095）。見表2。

2.4 XIAP表達(dá)與CA臨床特征的關(guān)系

表1 對(duì)照組與未復(fù)發(fā)、復(fù)發(fā)組XIAP表達(dá)比較

表2 HPV感染組XIAP陽性率的比較

XIAP陽性表達(dá)與CA患者的發(fā)病年齡、性別比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；患者不同病程及復(fù)發(fā)次數(shù)、的比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 3。

表3 XIAP表達(dá)與CA臨床特征的關(guān)系

3 討論

XIAP是IAP中唯一能同時(shí)抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)起始階段和效應(yīng)階段的凋亡抑制蛋白，對(duì)于調(diào)節(jié)惡性細(xì)胞的程序性死亡具有決定性作用[4]。已有大量資料表明XIAP在人類多數(shù)惡性腫瘤中高表達(dá)，且可作為腫瘤標(biāo)志物和預(yù)后因子之一[5，8]。筆者在臨床中發(fā)現(xiàn)部分CA可自行緩解，部分卻反復(fù)發(fā)作、遷延不愈，而巨大型CA病理可出現(xiàn)局部的輕度核異型性，甚至發(fā)生惡變。有關(guān)CA自行緩解或惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制目前還未十分明確。YIN等[9]報(bào)道XIAP在CA組織中呈高表達(dá)，推測(cè)XIAP可能在CA的發(fā)病中起重要作用，但未做進(jìn)一步深入研究。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了XIAP在不同預(yù)后（未復(fù)發(fā)和復(fù)發(fā)）CA組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示XIAP蛋白在CA中表達(dá)較正常組織上調(diào)，且復(fù)發(fā)組上調(diào)更為明顯，復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組比較有差異，提示XIAP參與了CA的發(fā)病過程，其表達(dá)上調(diào)可能干擾角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞周期、促進(jìn)增殖及抑制凋亡，從而導(dǎo)致CA的不斷發(fā)展和反復(fù)發(fā)作。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，病程越長(zhǎng)和復(fù)發(fā)次數(shù)越多的CA患者XIAP的陽性率越高，說明隨著XIAP表達(dá)水平增高，細(xì)胞凋亡減少，有助于CA細(xì)胞的增殖甚至惡性轉(zhuǎn)化；而XIAP表達(dá)水平較低的患者中，細(xì)胞增殖能力有限，可能是CA有自然緩解趨勢(shì)的原因之一。由此提示XIAP對(duì)判斷CA患者病情預(yù)后具有一定的參考價(jià)值。

現(xiàn)已證實(shí)癌基因蛋白E6和E7在HPV感染細(xì)胞的永生化和轉(zhuǎn)化機(jī)制中起重要作用[10]。YUAN等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在高危型HPV感染的人角質(zhì)形成細(xì)胞中，E6和E7蛋白可通過上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B的表達(dá)來間接激活XIAP轉(zhuǎn)錄。MITSUISHI等[5]分別檢測(cè)感染低危型HPV的CA組織和感染高危型HPV鮑溫樣丘疹病組織中XIAP的表達(dá)水平，結(jié)論是低危型HPV癌基因蛋白不能活化XIAP表達(dá)。筆者的研究結(jié)果顯示高危型HPV組的XIAP表達(dá)水平較正常組織上調(diào)，低危型HPV組較正常組雖存在一定的差別但無差異，得出的結(jié)論與上述研究一致。此結(jié)果提示感染高危型HPV的CA具有較強(qiáng)的抗凋亡能力，這可能是其臨床上更易遷延不愈的原因之一。本研究中高危型和低危型HPV組的XIAP表達(dá)比較，由于病例尚較少，結(jié)果可能有一定的局限性，有待于在大樣本中進(jìn)一步研究和探討。

綜上所述，本研究分析了XIAP在不同預(yù)后CA中的表達(dá)情況，并初步探討其與病毒感染、病情轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，證實(shí)了XIAP表達(dá)上調(diào)與CA的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)有密切關(guān)系。已有研究報(bào)道，通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA穩(wěn)定抑制XIAP的表達(dá)，可減少腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡并增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療的敏感性[12-13]。因此，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，阻斷XIAP的表達(dá)可能成為治療CA、預(yù)防復(fù)發(fā)的新靶點(diǎn)。

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（李科 編輯）

Expression of XIAP in condyloma acuminatum and its correlations with HPV subtypes

Jing Li, Hong-yu Xu
(Department of Dermatology, Shandong Jiaotong Hospital, Jinan, Shandong 250031, China)

ObjectiveTo investigate the roles of X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) in condyloma acuminatum and to study the relationships between XIAP andHuman Papilloma Virus(HPV)subtypes.MethodsThe immunohistochemical method was adopted to detect the expression of XIAP in condyloma acuminatum and healthy prepuce tissues. HPV genotypes were detected by PCR and gene chip in all condyloma acuminatum tissues.ResultsThe expression rate of XIAP was gradually increased from normal prepuce,nonrecurrent condyloma acuminatum to recurrent condyloma acuminatum tissues (26.67%, 53.49% and 79.31%respectively) with signi fi cant differences (P＜ 0.05). Futhermore, the XIAP expression level in the high-risk HPV group was higher than that in the normal prepuce (66.67% vs. 26.67%,P＜ 0.05); however, it was similar between the high-risk and low-risk HPV groups as well as low-risk HPV group and normal prepuce (P＞ 0.05). The positive expression rate of XIAP was statistically different between the patients with different disease courses and recurrent times (P＜ 0.05), but not between those groups with different sex and age (P＞ 0.05).ConclusionsElevated expression of XIAP may play an important role in the pathogenesis and recurrence of condyloma acuminatum. It may promote the malignant transformation of condyloma acuminatum, and serve as an effective and objective marker in detection and mornitoring of condyloma acuminatum.

condyloma acuminatum; X-linked inhibitor of apoptosis protein;Human Papilloma Virus;recurrence; apoptosis

R752.53

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.29.024

1005-8982（2017）29-0111-04

2016-03-23