管 峰，徐雯釵，袁勇軍，張瑞雪，趙思敏，陳秋平

（浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100）

脈沖強光對枯草芽孢桿菌NG-2滅活機理

管 峰，徐雯釵，袁勇軍*，張瑞雪，趙思敏，陳秋平

（浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100）

采用脈沖強光對枯草芽孢桿菌NG-2及芽孢進行滅活并研究其機理。在脈沖強光輻照枯草芽孢桿菌NG-2菌體及其芽孢后，利用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察形態(tài)特征變化，利用紫外分光光度法測定細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)含量，利用熒光光譜法檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和非特異性酯酶活力。結(jié)果表明，輻照距離為5 cm，閃照頻率為5次/s，輻照15 s時，脈沖強光對NG-2菌體及其芽孢滅活率超過50%；輻照40 s時，脈沖強光對NG-2菌體及其芽孢滅活率超過99.98%。輻照枯草芽孢桿菌及芽孢后菌體結(jié)構(gòu)損傷，芽孢壁破裂，細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、Ca2+和2,6-吡啶二羧酸含量顯著減少，非特異性酯酶活力降低，研究結(jié)果為脈沖強光對枯草芽孢桿菌及芽孢滅活機理提供理論依據(jù)。

脈沖強光；枯草芽孢桿菌；芽孢；滅活機理

細(xì)菌滅活是食品加工過程的重要工序，食品工業(yè)中采用的細(xì)菌滅活方法主要有加熱滅活和非加熱滅活兩大類。目前，在我國使用較多的為加熱滅活，傳統(tǒng)的低溫滅活不能將食品中的微生物（特別是耐熱的芽孢桿菌）全部殺滅，而高溫滅活又會破壞食品中的營養(yǎng)成分和食品的天然特性，并且往往伴隨著大量能量的消耗[1]。為更大限度保持食品的固有營養(yǎng)成分、質(zhì)構(gòu)、色澤和新鮮程度，冷滅活技術(shù)便應(yīng)運而生，如超高壓、脈沖強光、電離輻射、紫外線、微波、超聲波、磁場等[2]。近年來，脈沖強光作為一種新型的細(xì)菌滅活技術(shù)，廣泛應(yīng)用于食品的解凍、干燥、烘焙以及滅酶等[3]。芽孢桿菌是一種難以被滅活的微生物種類，目前對芽孢桿菌的滅活方法研究除了傳統(tǒng)的熱滅活外，還有臭氧[4]、大氣壓等離子體射流[5]和脈沖磁場[6]等方法。鑒于傳統(tǒng)滅菌處理在食品加工過程中的局限性，脈沖強光是食品加工中方便簡單、成本較為低廉的滅菌方法。

脈沖強光技術(shù)是一種能在極短時間內(nèi)放射強烈的近似太陽光光譜（200～1 100 nm），但強度強于太陽光，能殺滅固體表面、氣體和透明液體中微生物的新型冷滅活技術(shù)[7]。此技術(shù)具有能耗少、安全無殘留、滅活效率高等優(yōu)點，1996年已被美國食品與藥品監(jiān)督管理局允許使用于食品加工上（劑量小于12 J/cm2）[8]。該技術(shù)可有效地保持食品質(zhì)量，降低食品中微生物的數(shù)量從而延長食品的保質(zhì)期。目前有關(guān)其對微生物致死效果的研究較多，對細(xì)菌[9]、酵母菌[10]、霉菌[11]和病毒[12]滅活效果上國內(nèi)外均有資料報道，而對滅活機理的報道較少。本研究選擇枯草芽孢桿菌進行實驗，利用掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、紫外掃描、熒光掃描等方法，通過研究細(xì)胞膜損傷及非特異性酯酶活力和2,6-吡啶二羧酸（diethyl 2,6-pyridinedicarboxylate，DPA）含量，初步探討脈沖強光對枯草芽孢桿菌NG-2及芽孢的滅活作用，為其滅活機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌NG-2由浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院食品微生物實驗室從商業(yè)腐敗年糕中分離、鑒定并保存[13]。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司；Ca2+熒光探針（Fluo-3/AM） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二乙酸熒光素（fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）、DPA美國Sigma-Aldrich公司；D-Hanks平衡緩沖液 上海鈺博生物科技有限公司；二甲基亞砜、戊二醛、丙酮、抗壞血酸、硫酸亞鐵銨、無水乙酸鈉（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1750紫外分光光度計 日本島津公司；5804R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；F-380熒光光譜儀 天津港東科技發(fā)展股份有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡、H-7650透射電子顯微鏡 日本日立公司；ZWZ-Y1-D2脈沖強光設(shè)備 寧波中物光電殺菌技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體和芽孢懸液制備

無菌操作條件下，將已活化的菌體加入至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、120 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，離心（4 ℃、5 000 r/min、15 min）后取沉淀，用0.85 g/L生理鹽水洗2～3 次并重懸浮，制得菌體懸液（1.0×106CFU/mL），備用。將活化的菌體加入至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、120 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，離心后取沉淀芽孢染色顯微鏡檢查，芽孢含量達到100%后，用無菌生理鹽水制備成芽孢懸液（1.0×106CFU/mL），備用。

1.3.2 脈沖強光輻照處理

脈沖強光設(shè)備由拋光不銹鋼制成，并配備有一個用金屬外殼圍繞的處理室，處理室中備有2 盞氙氣燈和1 個位于中心的擋板。脈沖強光光源參數(shù)：燈管總長400 mm；極距380 mm；直徑8 mm；最小設(shè)置閃照頻率1 次/s；紫外區(qū)能量占總能量21.1%，其中UVA占6.2%，UVB占7.8%，UVC占7.1%。距離燈管中心13 cm處的單次脈沖劑量為150 mJ/cm2；紫外線峰值247 nm；輻照度615.0 W/cm2；脈沖寬度234 ms。

將2.0 mL菌體懸液或芽孢懸液移入無菌空培養(yǎng)皿中，立即進行脈沖強光輻照處理（輻照距離5 cm、固定閃照頻率5 次/s、單次輻照劑量3.6 J/cm2）。分別研究輻照時間為5、10、15、20、25、30 s和40 s時，其對菌體和芽孢滅活率的影響，以未進行脈沖強光輻照處理組為對照組。實驗設(shè)3 個平行，以平均值報告結(jié)果。

1.3.3 胞內(nèi)物質(zhì)泄漏量的測定

采用紫外掃描法進行蛋白質(zhì)和核酸泄漏量的測定[14]，以260 nm和280 nm波長處的吸光度分別表征核酸與蛋白質(zhì)漏出相對含量，以無菌生理鹽水做參比溶液；顯微結(jié)構(gòu)采用掃描電子顯微鏡觀察，具體操作參照文獻[15]進行，輻照時間為0 s和40 s；超微結(jié)構(gòu)采用透射電子顯微鏡觀察，具體操作參照文獻[16]進行，輻照時間為0、10、20 s和40 s；使用熒光光譜儀測定枯草芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和胞內(nèi)非特異性酯酶活力變化[17]；采用分光光度法測定芽孢DPA含量[18]。

1.3.4 滅活率計算

采用平板菌落計數(shù)法進行菌落計數(shù)[19]，按下式計算滅活率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。采用SPSS 21.0軟件中ANOVA方法對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，p＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照劑量對枯草芽孢桿菌的滅活效果

圖1 輻照時間對枯草芽孢桿菌菌體及芽孢的滅活效果Fig. 1 Effect of fl ash time on B. subtilis cells and spores

從圖1可知，脈沖強光對枯草芽孢桿菌菌體及芽孢均有很好的滅活效果，且滅活效果與輻照劑量存在量效關(guān)系。當(dāng)輻照時間為15 s時，脈沖強光對NG-2菌體及其芽孢的滅活率超過50%；當(dāng)輻照時間為40 s時，菌體細(xì)胞和芽孢總數(shù)分別減少6.0 lg（CFU/mL）和5.9 lg（ CFU/mL），滅活率均超過99.98%。菌體細(xì)胞和芽孢初始總數(shù)相同，但在相同輻照時間下，芽孢殘存量多于菌體細(xì)胞，表明芽孢相比于菌體對脈沖強光有更強的抵抗力，這和芽孢具有芽孢外壁、芽孢衣和芽孢皮層等特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)，也與江天寶[20]、Artíguez[21]等的研究中脈沖強光對細(xì)菌菌體殺傷作用強于芽孢的結(jié)果基本一致。

2.2 脈沖強光對枯草芽孢桿菌滅活機理研究

2.2.1 脈沖強光對枯草芽孢桿菌及其芽孢內(nèi)生物大分子溢出物的影響

表1 脈沖強光處理后枯草芽孢桿菌及其芽孢內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子溢出物的吸光度Table 1 Absorbance value of DNA and protein leaked from B. subtilis cells and spores treated by pulsed light

由表1可知，吸光度隨輻照時間的延長而增大，說明核酸和蛋白質(zhì)等胞內(nèi)物質(zhì)的外泄量隨著輻照時間的延長而增加。相對于對照組，脈沖強光輻照超過10 s即可造成枯草芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)核酸物質(zhì)顯著外泄，而細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)在輻照20 s后才顯著外泄（p＜0.05）；脈沖強光輻照超過10 s可造成枯草芽孢桿菌芽孢內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)均顯著外泄（p＜0.05）。

2.2.2 脈沖強光對枯草芽孢桿菌及其芽孢顯微結(jié)構(gòu)的影響由圖2a、c可知，未經(jīng)脈沖強光處理的菌體和芽孢形態(tài)均一，表面光滑，結(jié)構(gòu)完整。由圖2b可知，實驗組菌體細(xì)胞較對照組出現(xiàn)萎縮，表面褶皺，形狀不規(guī)則，細(xì)胞膜破裂；由圖2d可知，實驗組芽孢較對照組有凹陷現(xiàn)象，形狀不規(guī)則，芽孢壁破裂，有的芽孢只有半個或多個壁結(jié)構(gòu)。因此，脈沖強光對枯草芽孢桿菌及芽孢都能產(chǎn)生損傷作用。

圖2 不同時間脈沖強光處理對枯草芽孢桿菌及其芽孢顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig. 2 Effect of pulsed light on microstructure of B. subtilis cells and spores under scanning electron microscope

2.2.3 脈沖強光對枯草芽孢桿菌及其芽孢超微結(jié)構(gòu)的影響

圖3 不同時間脈沖強光處理對枯草芽孢桿菌菌體超微結(jié)構(gòu)的影響Fig. 3 Effect of pulsed light on morphological structure of B. subtilis cells under transmission electron microscope

通過透射電子顯微鏡觀察到對照組菌體（圖3a）和芽孢（圖4a）細(xì)胞壁和細(xì)胞膜均規(guī)則、完整、較光滑，且核質(zhì)集中，內(nèi)容物均勻分布。而處理組菌體（圖3b～d）與芽孢（圖4b～d）細(xì)胞壁和細(xì)胞膜均變薄、模糊不清，且內(nèi)容物溶出，細(xì)胞內(nèi)部變得松散，表明脈沖強光對枯草芽孢桿菌結(jié)構(gòu)有一定損傷。

圖 4 脈沖強光對枯草芽孢桿菌芽孢的形態(tài)影響Fig. 4 Effect of pulsed light on morphological structure of B. subtilis spores under transmission electron microscope

2.2.4 脈沖強光對枯草芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化能影響細(xì)胞的生理和生化狀態(tài)[22]，因此，采用熒光染料進行胞內(nèi)Ca2+濃度和分布檢測對于了解細(xì)胞生理活動具有重要意義。Fluo-3/AM是一種熒光量子產(chǎn)率很高、性能優(yōu)良的雙波長Ca2+熒光探針[23]。

圖5 脈沖強光處理后枯草芽孢桿菌胞內(nèi)Ca2＋結(jié)合Fluo-3/AM產(chǎn)生熒光強度的變化Fig. 5 Effect of pulsed light on the fl uorescence intensity of Ca2+binding by Fluo-3/AM in B. subtilis cells

由圖5可知，脈沖強光改變枯草芽孢桿菌細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+向細(xì)胞外泄漏，菌體內(nèi)Fluo-3熒光強度隨著脈沖強光輻射時間的延長而降低，說明非特異性酯酶將Fluo-3/AM水解并與胞內(nèi)的Ca2+結(jié)合。結(jié)果表明，脈沖強光處理的菌體細(xì)胞膜通透性改變，這與脈沖強光對枯草芽孢桿菌及芽孢超微結(jié)構(gòu)造成損傷的結(jié)果相一致，與錢靜亞[6]的研究結(jié)果也一致。

2.2.5 脈沖強光對枯草芽孢桿菌菌體內(nèi)非特異性酯酶活力的影響

圖6 脈沖強光處理后枯草芽孢桿菌胞內(nèi)非特異性酯酶降解FDA產(chǎn)生熒光強度的變化Fig. 6 Effect of pulsed light on the fl uorescence intensity of FDA degradation by non-specif i c esterase in B. subtilis cells

FDA是熒光素與2 個醋酸根共軛形成的一種不帶電荷的脂質(zhì)性分子，可通過簡單擴散進入細(xì)胞內(nèi)。FDA進入細(xì)胞后可被細(xì)胞內(nèi)的非特異性酯酶水解，釋放出能發(fā)黃綠色熒光的熒光素分子。由圖6可知，隨著脈沖強光輻照時間的延長，非特異性酯酶活力逐漸下降，對進入細(xì)胞內(nèi)的FDA分解能力減弱。綜合比較圖5、6發(fā)現(xiàn)，脈沖強光輻照后枯草芽孢桿菌胞內(nèi)酯酶仍可以將Fluo-3/AM水解并與胞內(nèi)的Ca2+結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號。

2.2.6 輻照時間對DPA質(zhì)量濃度的影響

硫酸亞鐵銨是測定微量DPA的一種很好的顯色劑，在pH 4.0～6.0的范圍內(nèi)，能與還原劑抗壞血酸反應(yīng)，生成一種穩(wěn)定的黃色復(fù)合物，在440 nm波長處有最大吸收峰，且黃色的深淺與DPA質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系[24]。

圖7 脈沖強光對枯草芽孢桿菌DPA泄漏的影響Fig. 7 Effect of pulsed light on the leakage of DPA in B. subtilis cells

由圖7可知，相對于輻照0 s，其他輻照時間對枯草芽孢桿菌芽孢結(jié)構(gòu)造成明顯損傷，隨輻照時間的延長，DPA外泄量增加。輻照10 s時，外泄DPA的質(zhì)量濃度是對照組的16.4倍；且在0～25 s內(nèi)，外泄質(zhì)DPA的質(zhì)量濃度隨輻照時間的延長而上升。這表明脈沖強光處理能破壞枯草芽孢桿菌芽孢結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致通透性屏障破壞從而顯著增加芽孢內(nèi)DPA的泄漏量，這個結(jié)果與微熱協(xié)同超高壓處理凝結(jié)芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢研究結(jié)果一致[25]。

3 討 論

以枯草芽孢桿菌NG-2菌體及其芽孢為研究對象，采用掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察和熒光檢測等方法研究了脈沖強光對枯草芽孢桿菌NG-2菌體的滅活機理。結(jié)果表明，脈沖強光對枯草芽孢桿菌菌體及芽孢滅活效果顯著，滅活效果與輻照時間存在時效關(guān)系，當(dāng)輻照15 s時，脈沖強光對NG-2菌體及其芽孢滅活率超過50%；當(dāng)輻照40 s時，滅活率超過99.98%。這與張佰清[26]、馬鳳鳴[27]等的研究結(jié)果是相一致的。

和傳統(tǒng)采用的連續(xù)紫外光照滅活機理部分相同，脈沖強光對微生物的滅活機理可以通過光化學(xué)效應(yīng)來解釋，該效應(yīng)主要是使微生物體內(nèi)的DNA形成嘧啶二聚體，阻礙細(xì)胞復(fù)制與增殖[28]。在本研究中，通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡都觀察到，脈沖強光輻照會導(dǎo)致枯草芽孢桿菌及芽孢的結(jié)構(gòu)和內(nèi)容物發(fā)生損傷性變化，豐富了脈沖強光滅活的機理。Takeshita等[29]比較了脈沖強光與紫外處理后的酵母細(xì)胞受損情況，發(fā)現(xiàn)脈沖強光能破壞酵母細(xì)胞膜，從細(xì)胞內(nèi)洗脫蛋白。張佰清等[30]用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質(zhì)漏出量，發(fā)現(xiàn)隨著脈沖強度的增加，蛋白質(zhì)漏出量增加。在本研究中，脈沖強光可以使枯草芽孢桿菌菌體和芽孢中核酸及蛋白質(zhì)外泄到細(xì)胞外，并且輻照時間越長，外泄現(xiàn)象越明顯。張佰清等[30]還對脈沖強光輻照后的大腸桿菌內(nèi)兩種抗氧化酶超氧化物歧化酶和過氧化氫酶進行活力檢測，發(fā)現(xiàn)脈沖強光處理后兩種酶活力均大幅降低。本研究發(fā)現(xiàn)脈沖強光使枯草芽孢桿菌內(nèi)外源熒光物與Ca2+、DPA和非特異性酯酶反應(yīng)產(chǎn)生的熒光強度減弱，說明脈沖強光會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+和DPA外泄，也能使菌體非特異性酯酶活力降低，不僅損傷枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，還影響菌體正常的生理功能。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)脈沖強光對枯草芽孢桿菌及芽孢有滅活作用，并且隨著脈沖強光輻照時間的延長，滅活作用也增強。超顯微結(jié)構(gòu)顯示脈沖強光輻照枯草芽孢桿菌及芽孢后可對其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷作用，紫外光和熒光掃描也進一步說明脈沖強光可使枯草芽孢桿菌內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、DPA和Ca2+外泄到細(xì)胞外，且細(xì)胞內(nèi)的非特異性酯酶活力隨著輻照時間的延長而降低。

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Inactivation and Mechanism of Bacillus subtilis NG-2 and Its Spores by Pulsed Light

GUAN Feng, XU Wenchai, YUAN Yongjun*, ZHANG Ruixue, ZHAO Simin, CHEN Qiuping
(College of Biological and Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China)

Pulsed light was used for the inactivation of Bacillus subtilis NG-2 and its spores. Morphological characteristics of the irradiated cells and spores were explored by scanning electron microscope and transmission electron microscope,the leakage of intracellular contents was determined by ultraviolet spectrophotometry, and intracellular calcium ion concentration and nonspecif i c esterase activity were investigated by fl uorescence spectroscopy. The results showed that the optimal pulsed light parameters were determined as 5 cm and 5 cycles/s for distance and fl ash frequency, respectively. Under the optimized conditions, the total number of bacterial colonies was killed by more than 50% and 99.98% at 15 and 40 s of irradiation time, respectively. The structures of the cell and spore wall were damaged, and intercellular nucleic acid, proteins,diethyl 2,6-pyridinedicarboxylate, Ca2+and non-specif i c esterase activity were decreased after irradiation. The fi ndings may provide a theoretical basis for the industrial application of pulsed light.

pulsed light; Bacillus subtilis; spore; inactivation mechanism

10.7506/spkx1002-6630-201723012

TS201.3

A

1002-6630（2017）23-0070-05引文格式：

管峰, 徐雯釵, 袁勇軍, 等. 脈沖強光對枯草芽孢桿菌NG-2滅活機理[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(23): 70-74.

10.7506/spkx1002-6630-201723012. http://www.spkx.net.cn

GUAN Feng, XU Wenchai, YUAN Yongjun, et al. Inactivation and mechanism of Bacillus subtilis NG-2 and its spores by pulsed light[J]. Food Science, 2017, 38(23): 70-74. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723012. http://www.spkx.net.cn

2017-03-14

浙江省重中之重學(xué)科“生物工程”學(xué)生創(chuàng)新項目（CX2016012）；寧波市高校院所研發(fā)投入補助項目（2011B22012）；寧波市江北區(qū)農(nóng)業(yè)項目（2012B04）

管峰（1985—），男，實驗師，碩士，研究方向為食品質(zhì)量安全控制。E-mail：guanfengxy@163.com

*通信作者：袁勇軍（1976—），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物與食品質(zhì)量安全控制。

E-mail：yuan2007019@aliyun.com