甘蔗脫毒健康種苗中蔗糖轉(zhuǎn)化酶表達(dá)分析

王俊剛　趙婷婷　楊本鵬　蔡文偉　馮翠蓮　曾軍　熊國如　張樹珍

摘要：甘蔗脫毒健康種苗能夠有效提高植株生物量和糖分，而蔗糖轉(zhuǎn)化酶則是甘蔗生長和蔗糖積累的關(guān)鍵酶。擬分析3種甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因，即可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（soluble acid invertase，簡稱SAI）、可溶性中性轉(zhuǎn)化酶（neutral invertase，簡稱NI）和細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶（cell wall-bound invertase，簡稱CWI）基因在脫毒種苗、常規(guī)種苗全生育期的表達(dá)量差異。結(jié)果表明，細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶主要在脫毒健康種苗拔節(jié)期未成熟葉片、莖及成熟期葉片、未成熟莖節(jié)中上調(diào)表達(dá)，尤其在成熟期未成熟莖節(jié)中大幅上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)莖節(jié)的快速生長和蔗糖的卸載及積累；液泡可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶SAI、可溶性中性轉(zhuǎn)化酶主要在成熟期葉片和未成熟莖節(jié)中上調(diào)表達(dá)，有利于促進(jìn)成熟期脫毒健康種苗莖稈中糖分積累及對(duì)單糖的快速利用。進(jìn)一步研究表明，脫毒處理可以提高甘蔗生長后期蔗糖轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)量，有利于生物量和蔗糖含量的增加，可能是脫毒健康種苗增糖增產(chǎn)的分子調(diào)節(jié)機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：甘蔗；脫毒健康種苗；蔗糖轉(zhuǎn)化酶；表達(dá)量

中圖分類號(hào)： Q9465；S566101文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0035-04[

收稿日期：2016-06-08

基金項(xiàng)目：國家“863”計(jì)劃（編號(hào)：2013AA102604-1）；海南省自然科學(xué)基金（編號(hào)：20163124）；中央級(jí)公益科研院所基本業(yè)務(wù)費(fèi)（編號(hào)：ITBB140503）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（編號(hào)：CARS-20-2-5）。

作者簡介：王俊剛（1983—），男，湖北孝感人，博士研究生，助理研究員，研究方向?yàn)楦收嵘锛夹g(shù)。Tel：（0898）66987509；E-mail：wangjungang@itbborgcn。

通信作者：張樹珍，博士，研究員，研究方向?yàn)楦收嵘锛夹g(shù)。Tel：（0898）66987509；E-mail：zhangsz2007@163com。

甘蔗是禾本科甘蔗屬多年生草本C4植物，是將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能效率最高的作物之一，是世界上重要的糖料作物和能源作物，約生產(chǎn)全球70%的食糖和42%的乙醇[1]。蔗糖是甘蔗生產(chǎn)的主要物質(zhì)，其合成和積累過程是一個(gè)系統(tǒng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，涉及到各種蔗糖代謝相關(guān)酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及信號(hào)分子等的調(diào)節(jié)作用[2-3]，而蔗糖轉(zhuǎn)化酶能夠催化蔗糖的水解，影響莖稈蔗糖含量[4-5]。高等植物中含有多個(gè)編碼蔗糖轉(zhuǎn)化酶的基因，蔗糖轉(zhuǎn)化酶既存在于光合組織中，也存在于非光合組織中，主要累積于細(xì)胞質(zhì)、液泡和細(xì)胞間隙。高等植物中轉(zhuǎn)化酶依據(jù)不同的溶解性、亞細(xì)胞定位和最適pH值，可以分為3種類型：（1）可溶性中性轉(zhuǎn)化酶（neutral invertase，簡稱NI），為非糖基化形式，存在于細(xì)胞質(zhì)中，最適pH值為中性或弱堿性（pH值70～80），在植物組織中降解蔗糖滿足代謝中對(duì)己糖的需求；（2）可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（soluble acid invertase，簡稱SAI），主要存在于液泡中，為糖基化形式，其活性最適pH值為酸性（45～50），參與調(diào)節(jié)光合同化產(chǎn)物在淀粉和蔗糖間的分配及控制蔗糖己糖比率[6-7]；（3）細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶（cell wall-bound invertase，簡稱CWI），最適pH值為酸性（45～55），但有較高的pI值（9～10）。細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶則主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)蔗糖從葉片（源）中輸出的速率，是蔗糖源源不斷地向庫細(xì)胞卸載的重要?jiǎng)恿8-10]，促進(jìn)植物細(xì)胞從源代謝向庫代謝的轉(zhuǎn)變，有助于庫器官的生長和代謝產(chǎn)物的長距離運(yùn)輸[11-12]。

甘蔗多年宿根種植引起甘蔗品種退化，利用腋芽莖尖脫毒處理能夠恢復(fù)母本性狀，使甘蔗產(chǎn)量增加20%～40%，含糖量增加05～10百分點(diǎn)[13-15]，但是有關(guān)從分子生物學(xué)水平研究脫毒處理對(duì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶表達(dá)量的影響還未見報(bào)道。本研究以已報(bào)道的3個(gè)甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)化酶為研究對(duì)象，從甘蔗生長的苗期、分蘗期、拔節(jié)期和成熟期對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行比較分析，探討脫毒處理與蔗糖轉(zhuǎn)化酶表達(dá)量之間的關(guān)系，以便從分子生物學(xué)層面上分析脫毒處理對(duì)轉(zhuǎn)化酶表達(dá)量的影響，揭示脫毒健康種苗可能的增產(chǎn)增糖機(jī)制。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

供試材料為新臺(tái)糖22號(hào)品種腋芽脫毒健康種苗二代種莖苗和未脫毒新臺(tái)糖22種莖，來源于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所甘蔗試驗(yàn)地。

12試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在海南省臨高縣皇桐鎮(zhèn)國家甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系試驗(yàn)站，土壤為紅壤，肥力中等。

13田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)和管理

參照文獻(xiàn)[15-16]的有關(guān)方法進(jìn)行處理。

14總RNA提取、定量與完整性檢測(cè)

取從10個(gè)完整植株剝離的凍存樣品進(jìn)行研磨，用TRIzol法提取RNA，TRIzol RNA提取試劑購自Aidlab （艾德萊）公司。用核酸分析儀（Eppendorf Biophotometer Plus）測(cè)定260、280 nm處的吸光度，以D260 nmD280 nm值估計(jì)總RNA的純度，以D260 nm進(jìn)行總RNA定量。用10%普通瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

15第一鏈cDNA的合成

取3 μg甘蔗總RNA與1μL反轉(zhuǎn)錄引物（10 pmolL）（Oligo-dT接頭引物）混合，65 ℃加熱5 min后，立即放置于冰上，然后加入5×buffer、25 mmolL dNTP混合液、40 UμL Ribonuclease Inhibitor、5 UμL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)體系為 25 μL。反應(yīng)過程如下：42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，5 min后瞬時(shí)離心，最后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

16引物設(shè)計(jì)

根據(jù)公布的甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因CWI（GenBank登錄號(hào)：BU925833）、NI（GenBank登錄號(hào)：KC145797）、SAI（GenBank登錄號(hào)：AY302083） 序列，利用Primer5設(shè)計(jì)引物，內(nèi)參GADPH基因引物參考文獻(xiàn)[17]，詳見表1。endprint