利用AhMITE轉(zhuǎn)座子分子標記鑒定花生雜交F1代真假雜種

吳 琪，曹廣英，尹 亮，唐月異，王秀貞，孫全喜， 王志偉，吳昌湛，彭婭萍，王傳堂*

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；3.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院賀州分院/賀州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 賀州 542813)

利用AhMITE轉(zhuǎn)座子分子標記鑒定花生雜交F1代真假雜種

吳 琪1，曹廣英2，尹 亮1，唐月異1，王秀貞1，孫全喜1， 王志偉1，吳昌湛3，彭婭萍1，王傳堂1*

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；3.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院賀州分院/賀州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 賀州 542813)

本研究以抗青枯病北方大花生栽培品種“日花1號”為父本，山東省花生研究所生物技術(shù)研究室選育的高油酸花生品種“花育963”以及高產(chǎn)品種“玫瑰紅”、“14VS-13”、“花育33”、“花育50”、“14L123”為母本雜交獲得的F1代種子為材料，利用微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(miniature inverted-repeat transposable element, MITE)標記技術(shù)鑒定F1代真雜種。從10對AhMITE引物中篩選出6對在雜交親本中有清晰、穩(wěn)定并具有明顯差異條帶的標記引物對F1代進行雜種鑒定。每一個組合都使用兩對AhMITE引物進行鑒定，實驗結(jié)果相互印證，保證了結(jié)果的準確性。

花生；AhMITE；分子標記；雜種鑒定

花生是重要的油料作物，雜交育種是花生育種中最常用的方法，然而人工去雄授粉的實際操作過程中，很難保證母本完全去雄和自交花徹底摘除，所以收獲的F1代常常存在假雜種。以往通過表型鑒定真、假雜種要等到下一年播種后長成植株再鑒定，一來比較耗時，二來鑒定那些表型差異較小的親本雜交得到的F1代就顯得相當(dāng)困難，而通過分子生物學(xué)可以直接、準確鑒定F1代種子，省時、省力，極大提高了育種效率。

微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(miniature inverted-repeat transposable element，MITE)是由Bureau等[1-2]在玉米中發(fā)現(xiàn)的一類轉(zhuǎn)座子，其具有TIR和TSD結(jié)構(gòu)，并表現(xiàn)高拷貝性。研究表明，MITE標記廣泛存在于植物和動物的基因組中，尤其多存在于基因富集區(qū)，推測其對基因表達和基因組進化有較大影響[3]。MITE由于其自身的高拷貝特性以及其在基因組中的廣泛分布而被開發(fā)成遺傳標記，成為遺傳圖譜構(gòu)建和標記輔助育種的新工具。MITE標記技術(shù)操作簡便，能夠擴增出清晰、穩(wěn)定并具有明顯差異的條帶，MITE標記在大麥、小麥、水稻、燕麥、玉米等植物的指紋圖譜構(gòu)建以及遺傳分析方面得到廣泛應(yīng)用[4-7]。并且從水稻、擬南芥中開發(fā)的MITE標記可以在番茄、棉花、馬鈴薯等多種植物中應(yīng)用[8-9]。在花生方面，Patel等[10]首先報道了MITE插入FAD2基因產(chǎn)生高油酸花生突變體。Gowda等[11-12]發(fā)現(xiàn)MITE標記在FST1-linked位點的插入和缺失與花生抗/感晚斑病和銹病有關(guān)。Shirasawa等[13]根據(jù)花生MITE兩端序列開發(fā)了504對引物，為MITE標記在花生中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

王潔等[14]、尹亮等[15]、祁雪等[16]利用MITE標記對不同花生雜交組合的F1代進行了鑒定。王輝等[17]利用31對MITE標記研究了26個花生品種及89個高世代材料的親緣關(guān)系。

研究表明，AhMITE標記在花生中擴增的PCR產(chǎn)物差異大，多態(tài)性高，帶型穩(wěn)定，采用瓊脂糖凝膠電泳即可區(qū)分[17]，使用AhMITE標記鑒定花生雜交種結(jié)果可靠，并且大大提高選育效率。本研究所使用的AhMITE標記均由Shirasawa等[13]開發(fā)而成，PCR產(chǎn)物多態(tài)性是由AhMITE標記在特定位點的插入或缺失所引起。本研究從10對AhMITE引物中篩選出6對在親本中表現(xiàn)多態(tài)性的引物鑒定了6個花生雜交組合的F1代真、假雜種，進一步證實AhMITE標記在花生品種鑒定和花生遺傳多樣性研究中的有效性和準確性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

花生材料：父本：抗青枯病北方大花生栽培品種“日花1號”(RH1)；母本：高產(chǎn)大花生品種“玫瑰紅”(Meiguihong)、山東省花生研究所生物技術(shù)研究室選育的高油酸花生品種“花育963”(HY963)、“14VS-13”、“花育33”(HY33)、“花育50”(HY50)、“14L123”；F1代群體。試劑：10×PCR Buffer(Mg2++Plus)，dNTP Mix，rTaq(均購自TaKaRa，Japan)。

1.2 基因組DNA提取

DNA提?。喝』ㄉ尤~0.1g加入1.5mL離心管中，加入0.2mL SDS提取液(0.01mol/L Tris-HCl，0.1% SDS)，用研磨杵研碎，55℃水浴30min，加入0.2mL酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合液，充分混勻，12000 r/min離心10min，取上清，加入等體積異丙醇，12000 r/min離心10min，用70%乙醇漂洗沉淀，風(fēng)干后溶于50μL TE緩沖液，-20℃保存、備用。

1.3 AhMITE標記篩選

從文獻[13-17]中選取10對AhMITE引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。利用這10對AhMITE引物對親本進行多態(tài)性分析，選出條帶清晰、穩(wěn)定、有明顯差異的標記用于F1代雜種鑒定。

1.4 F1代真雜種鑒定

以雜種F1代種子DNA為模板，使用篩選出的6對AhMITE標記進行PCR擴增，同時具有父、母本擴增帶型的樣品為真雜種。PCR反應(yīng)體系(25μL)為：10×PCR Buffer(Mg2++Plus)2.5μL，dNTP Mix 1.5μL，AhMITE正向引物(10μmol/L)1.0μL，AhMITE反向引物(10 μmol/L)1.0μL，DNA模板(30 ng/μL)1.0μL，rTaq 0.25μL，加ddH2O補充至25μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30s，39個循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物使用添加1μL Super GelRed(US，Everbright Inc)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，拍照并存檔。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本間AhMITE多態(tài)性標記篩選

利用10對AhMITE引物對父本“日花1號”及6個母本(“玫瑰紅”、“HY963”、“14VS-13”、“HY33”、“HY50”、“14L123”)進行多態(tài)性分析，篩選出6對多態(tài)性好的引物(表1)，用于F1代雜交種鑒定。

表1 AhMITE引物對序列

2.2 F1真假雜種鑒定

用篩選出的引物檢測6個雜交組合的93粒F1代種子，每個雜交組合用兩對AhMITE引物擴增結(jié)果相互驗證，結(jié)果共鑒定出37個真雜交種(表2)。圖1是利用AhMITE多態(tài)性引物AhTE0180、AhTE0254、AhTE0369、AhTE0584、AhTE0633、AhTE0660對6個雜交組合親本之間的多態(tài)性篩選。另外F1代真雜種同時具有父本和母本雙方的譜帶，呈共顯性，而假雜種只有母本的條帶，如圖2～6所示。

表2 F1真假雜種鑒定結(jié)果

圖1 雙親間多態(tài)性引物篩選Fig.1 Screening for polymorphic AhMITE primers of parents 注：M: marker。每8個模板為一組，其中1號和8號皆為父本RH1，2～7號為母本，順序為：玫瑰紅、HY963、14VS-13、HY33、HY50、14L123。泳道9～16為引物AhTE0180；泳道17～24為引物AhTE0254；泳道25～32為引物AhTE0369；泳道49～56為AhTE0584；泳道57～64為AhTE0633；泳道65～72為AhTE0660。Note: M: marker. One set includes 8 templates: lane 1 and lane 8 are male parent RH1, lane 2-7 are female parents (The order is Meiguihong, HY963, 14VS-13, HY33, HY50, 14L123). Lanes 9-16, primer AhTE0180; lanes 17-24, primer AhTE0254; lanes 25-32, primer AhTE0369; lanes 49-56, primer AhTE0584; lanes57-64, primer AhTE0633; lanes 65-72, primer AhTE0660.

圖2 利用AhMITE多態(tài)性引物AhTE0369對玫瑰紅(母)×RH1(父)及HY963(母)×RH1(父)雜交組合F1代的擴增結(jié)果Fig. 2 DNA fragments amplified by AhMITE primer AhTE0369 for cross combination Meiguihong (female parent) × RH1 (male parents) and HY963 (female parent) × RH1 (male parents) 注：M: marker。泳道1、25、30為RH1；泳道2、26為玫瑰紅；泳道31為HY963；泳道4、5、7、9、11、12、23、24、28、29為玫瑰紅(母)×RH1(父)雜交F1代的真雜種；泳道33、35、37、40、43為HY963(母)×RH1(父)雜交F1代的真雜種。Note: M: marker. Lane 1, 25 and 30, RH1; lane 2 and 26, Meiguihong; lane 31, HY 963; lane 4, 5, 7, 9, 11, 12, 23, 24, 28 and 29 are true hybrids of Meiguihong (female parent) × RH1 (male parents); lane 33, 35, 37, 40 and 43 are true hybrids of HY963 (female parent) × RH1 (male parents).

圖3 利用AhMITE多態(tài)性引物AhTE0584對玫瑰紅(母)×RH1(父)及HY963(母)×RH1(父)雜交組合F1代的擴增結(jié)果Fig. 3 DNA fragments amplified by AhMITE primer AhTE0584 for cross combination Meiguihong (female parent) × RH1 (male parents) and HY963 (female parent) × RH1 (male parents) 注：M: marker。泳道1、25、30為RH1；泳道2、26為玫瑰紅；泳道31為HY963；泳道4、5、7、9、11、12、23、24、28、29為玫瑰紅(母)×RH1(父)雜交F1代的真雜種；泳道33、34、35、37、40、43為HY963(母)×RH1(父)雜交F1代的真雜種。Note: M: marker. Lane 1, 25 and 30, RH1; lane 2 and 26, Meiguihong; lane 31, HY 963; lane 4, 5, 7, 9, 11, 12, 23, 24, 28 and 29 are true hybrids of Meiguihong (female parent) × RH1 (male parents); lane 33, 34, 35, 37, 40 and 43 are true hybrids of HY963 (female parent) × RH1 (male parents).

使用AhTE0369和AhTE0584對玫瑰紅(母)×RH1(父)及HY963(母)×RH1(父)雜交組合F1代的擴增結(jié)果表明玫瑰紅(母)×RH1(父)雜交組合F1代的真雜種數(shù)有10個，HY963(母)×RH1(父)雜交組合F1代的真雜種數(shù)有5個(圖2～3，表2)。

圖4 利用AhMITE多態(tài)性引物AhTE0180(a)和AhTE0660(b)對14VS-13(母)×RH1(父)及HY33(母)×RH1(父)雜交組合F1代的擴增結(jié)果Fig. 4 DNA fragments amplified by AhMITE primer AhTE0180(a) and AhTE0660(b) for cross combination 14VS-13 (female parent) × RH1 (male parents) and HY33 (female parent) × RH1 (male parents) 注：M: marker。泳道1、13、25、37為RH1；泳道2、26為14VS-13；泳道14、38為HY33；(a)：泳道3、5、7、12為14VS-13(母)×RH1(父)雜交F1代的真雜種；泳道15、16、21為HY33(母)×RH1(父)雜交F1代的真雜種。(b)：泳道27、29、31、36為14VS-13(母)×RH1(父)雜交F1代的真雜種；泳道39、40、45為HY33(母)×RH1(父)雜交F1代的真雜種。Note: M: marker. Lane 1, 13, 25 and 37, RH1; lane 2 and 26, 14VS-13; lane 14 and 38, HY33; (a): lane 3, 5, 7, and 12 are true hybrids of 14VS-13 (female parent) × RH1 (male parents); lane 15, 16 and 21 are true hybrids of HY33 (female parent) × RH1 (male parents). (b): lane 27, 29, 31 and 36 are true hybrids of 14VS-13 (female parent) × RH1 (male parents); lane 39, 40 and 45 are true hybrids of HY33 (female parent) × RH1 (male parents).

由圖4a和4b知，AhMITE多態(tài)性引物AhTE0180和AhTE0660對14VS-13(母)×RH1(父)及HY33(母)×RH1(父)雜交組合F1代的擴增結(jié)果表明14VS-13(母)×RH1(父)雜交組合F1代的真雜種數(shù)有4個，HY33(母)×RH1(父)雜交組合F1代的真雜種數(shù)有3個(表2)。

由圖5知，AhMITE多態(tài)性引物AhTE0180和AhTE0660對HY50(母)×RH1(父)雜交組合F1代的擴增結(jié)果表明HY50(母)×RH1(父)雜交組合F1代的真雜種數(shù)有5個。

圖5 利用AhMITE多態(tài)性引物AhTE0180和AhTE0660對HY50(母)×RH1(父)雜交組合F1代的擴增結(jié)果Fig. 5 DNA fragments amplified by AhMITE primer AhTE0180 and AhTE0660 for cross combination HY50 (female parent) × RH1 (male parents) 注：M: marker。泳道1、16為RH1；泳道2、17為HY50；泳道6、7、10、11、13為引物AhTE0180鑒定的真雜種；泳道21、22、25、26、28為引物AhTE0660鑒定的真雜種。Note: M: marker. Lane 1 and 16, RH1; lanes 2 and 17, HY50; lane 6, 7, 10, 11 and 13 are true hybrids by primer AhTE0180; lane 21, 22, 25, 26 and 28 are true hybrids by primer AhTE0660.

圖6 利用AhMITE多態(tài)性引物AhTE0663和AhTE0254對14L123(母)×RH1(父)雜交組合F1代的擴增結(jié)果 Fig. 6 DNA fragments amplified by AhMITE primer AhTE0663 and AhTE0254 for cross combination 14L123 (female parent) × RH1 (male parents) 注：M: marker。泳道1、21為RH1；泳道2、22為14L123；泳道3、6、7、8、11、13、14、17、18、19為引物AhTE0663鑒定的真雜種；泳道23、26、27、28、31、33、34、37、38、39為引物AhTE0254鑒定的真雜種。Note: M: marker. Lane 1and 21, RH1; lanes 2 and 22, 14L123; lane 3, 6, 7, 8, 11, 13, 14, 17, 18 and 19 are true hybrids by primer AhTE0663; lane 23, 26, 27, 28, 31, 33, 34, 37, 38 and 39 are true hybrids by primer AhTE0254.

由圖6知，AhMITE多態(tài)性引物AhTE0663和AhTE0254對14L123(母)×RH1(父)雜交組合F1代的擴增結(jié)果表明14L123(母)×RH1(父)雜交組合F1代的真雜種數(shù)有10個。

3 討 論

傳統(tǒng)的真假雜種鑒定多采用形態(tài)標記篩選真雜種，但由于該方法極易受外界環(huán)境因素影響，所以誤差較大，而且對一些性狀差異小的親本后代進行鑒定往往比較困難。DNA分子標記能夠從分子水平上反映個體差異，所以在花生收獲當(dāng)年就可以對F1代種子進行鑒定，其結(jié)果真實可靠，而且來年可以直接播種真雜種，省時、省力，不受環(huán)境條件制約。AhMITE標記的多態(tài)性是其在特定基因位點插入或缺失造成的，PCR結(jié)果差異顯著，利用瓊脂糖凝膠電泳即可進行區(qū)分，兼具操作簡單和結(jié)果準確的優(yōu)點，因此是進行花生真假雜種鑒定的理想工具。本研究利用6對AhMITE引物鑒定了六個雜交組合F1代中的真雜種，每一個組合都使用兩對AhMITE引物進行鑒定，試驗結(jié)果能夠相互印證，同時也證明AhMITE標記在花生育種中的高效性。

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IdentificationofPeanutHybridF1withAhMITEMarkers

WU Qi1, CAO Guang-ying2, YIN Liang1, TANG Yue-yi1,WANG Xiu-zhen1, SUN Quan-xi1, WANG Zhi-wei1, WU Chang-zhan3, PENG Ya-ping1, WANG Chuan-tang1*

(1.ShandongPeanutResearchInstitute,Qingdao266100,China; 2.CollegeofLifeScience,JilinAgr.Univ.,Changchun130118,China; 3.HezhouBranch,GuangxiAcademyofAgr.Science/HezhouAgr.ScienceResearchInstitute,Hezhou542813,China)

Miniature inverted-repeat transposable element (MITE) molecular markers were employed to identify the true F1hybrid seeds of four peanut cross combinations. The male parent of those cross combinations was Rihua1, a peanut cultivar with high resistance to bacterial wilt (BW). The female parents included a high oleate peanut variety HY963 and high yielding varieties Meiguihong, 14VS-13, Huayu33, Huayu50 and 14L123. Six polymorphicAhMITEprimer pairs were selected to distinguish the true hybrids. The PCR amplifications of each sixAhMITEprimers had clear, stable and obviously different bands. Each combination was tested by two pairs ofAhMITEprimers. And the results can be mutual confirmed by each other to ensure the accuracy.

peanut;AhMITE; molecular markers; hybrid identification

10.14001/j.issn.1002-4093.2017.03.008

S565.2037

A

2017-06-21

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項目(2015YQN13)；山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2015YL064)；國家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-14)

吳琪(1981-)，女，山西太原人，山東省花生研究所助理研究員，博士，主要從事花生抗病研究。

*通訊作者：王傳堂(1968-)，男，研究員，主要從事花生分子育種研究。E-mail: chinapeanut@126.com