豬肺炎支原體與豬鼻支原體分離鑒定及鑒別檢測

李海利，鄧祖麗穎，徐引弟，王治方，張青嫻,朱文豪，方劍玉，游 一,侯自花，郎利敏,王克領(lǐng)

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.鄭州幼兒師范高等?？茖W校，河南 鄭州 450000)

豬肺炎支原體與豬鼻支原體分離鑒定及鑒別檢測

李海利1，鄧祖麗穎2，徐引弟1，王治方1，張青嫻1,朱文豪1，方劍玉1，游 一1,侯自花1，郎利敏1,王克領(lǐng)1

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.鄭州幼兒師范高等?？茖W校，河南 鄭州 450000)

為建立豬肺炎支原體與豬鼻支原體的鑒別診斷方法，對從河南省及周邊地區(qū)豬場采集的患呼吸道疾病的豬只樣品進行支原體的分離培養(yǎng)，針對豬肺炎支原體與豬鼻支原體設計了2對引物，擴增片段大小分別為480 bp和360 bp，對所分離純化的病原微生物進行了菌落形態(tài)觀察及分子鑒定。結(jié)果顯示，分離的病原微生物為支原體，菌落呈典型的“煎蛋樣”特征；通過單一PCR擴增反應，分別得到了豬肺炎支原體與豬鼻支原體相應的目的擴增片段。表明分離到了豬肺炎支原體與豬鼻支原體。在單一擴增的基礎(chǔ)上，建立了豬肺炎支原體與豬鼻支原體二重PCR反應方法，可同時得到2條目的條帶，與單一PCR擴增結(jié)果一致。表明建立的二重PCR方法可用于豬肺炎支原體與豬鼻支原體的同時檢測和鑒別診斷。

豬肺炎支原體； 豬鼻支原體； 鑒別診斷； 二重PCR

豬支原體肺炎(MPS)又稱豬地方流行性肺炎，俗稱豬氣喘病，是由豬肺炎支原體引起的豬的一種慢性呼吸道傳染病[1-3]。其主要臨床癥狀為咳嗽和氣喘，病理變化特征是肺的尖葉、心葉、中間葉和隔葉前緣呈肉樣或蝦肉樣實變[4-5]。該病廣泛分布于世界各地，主要特點是高接觸性、高傳染性、高發(fā)病率和低死亡率[6]，可導致日增質(zhì)量減少、長期生長不良、飼料報酬率大幅下降[7-8]。該病常與其他呼吸道病原如多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌或胸膜肺炎放線桿菌等協(xié)同感染引起豬地方性肺炎，常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流感病毒和豬圓環(huán)病毒協(xié)同感染引起豬呼吸道綜合征[9]。豬鼻支原體(Mhn)通常存在于豬鼻腔和扁桃體中，一般條件下并不致病。但豬鼻支原體感染肺臟時可引起肺炎，還可導致多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎[10-11]。

豬肺炎支原體和豬鼻支原體發(fā)病率較高，一般在50%～80%，個別新建豬場或感染豬場發(fā)病率可達100%，死亡率高達14%～37%[12-13]。流行后期或老疫區(qū)則以哺乳仔豬和斷奶仔豬多發(fā)，死亡率較高[14-15]，母豬和成年豬多呈慢性和隱性感染[16-18]。病豬與健康豬群混合飼養(yǎng)，常引起豬支原體肺炎的暴發(fā)。消除患病動物和徹底消毒，切斷傳播途徑，加強檢疫和監(jiān)測，對防治豬支原體肺炎和豬鼻支原體具有重要意義[19]。

支原體可持續(xù)存在，并且可導致其他疫苗免疫失敗[20-23]。豬支原體病流行于世界各地，在畜牧業(yè)發(fā)達的美國、澳大利亞等國也普遍存在，造成了巨大的經(jīng)濟損失[24-27]。防控豬支原體肺炎需掌握支原體的流行特征，豬肺炎支原體與豬鼻支原體的臨床癥狀相似，且在形態(tài)上難以區(qū)分，因而對豬肺炎支原體抗體的檢測與豬鼻支原體的鑒別診斷顯得尤為重要。鑒于此，建立豬肺炎支原體與豬鼻支原體的鑒別檢測方法，旨在為控制豬支原體肺炎奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試病料 從河南省及周邊地區(qū)豬場采集的患呼吸道疾病樣品由河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)室保存。

1.1.2 主要試劑 葡萄糖、PPLO肉湯粉、酵母粉、瓊脂粉、馬血清、精氨酸、青霉素等購自北京路橋生物技術(shù)有限公司；EDTA、聚乙二醇辛基苯基醚、異硫氰酸酯、氯化鈉購自Sigma公司。dNTP Mixture(2.5 mmol/L)、DNA Marker、ExTaq(5 U/μL)、MgCl2(25 mmol/L)、10×PCR Buffer (Mg2+free)、RNase Free dH2O等均購自TaKaRa公司；瓊脂糖購于Biowest公司；EB染料替代染液購自上海萊楓生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原微生物分離 取具有典型癥狀的支原體病例肺臟組織，表面無菌消毒，取肺臟組織樣本5 g涂于固體培養(yǎng)基表面，放置于37 ℃、含5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時將小塊無菌肺臟組織樣本投入到50 mL PPLO液體培養(yǎng)基中。3～5 d后，用光學顯微鏡低倍觀察菌落形態(tài)。取待檢病原微生物純培養(yǎng)物進行姬姆薩氏染色，于顯微鏡油鏡下觀察病原微生物形態(tài)。

將采集的鼻咽拭子浸入裝有滅菌生理鹽水的管中，于24 h內(nèi)送入實驗室，用0.50 μm濾膜過濾生理鹽水除雜菌，涂于PPLO固體培養(yǎng)基表面或PPLO液體培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、含5%的CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3～5 d后，用光學顯微鏡低倍觀察菌落形態(tài)。取待檢病原微生物純培養(yǎng)物進行姬姆薩氏染色，于顯微鏡油鏡下觀察病原微生物形態(tài)。

1.2.2 引物設計 引物用Array Designer 2.0 軟件根據(jù)豬肺炎支原體(GenBank No.AF004388)和豬鼻支原體(GenBank No.NC014448.1)序列設計，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為MphF：5′-GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA-3′，MphR：5′-GTGGACTACCAGGGTATCT-3′；MhnF：5′-TGAAG-CTGTGAAGCTCCTTTC-3′，MhnR：5′-TGTTGAACG-GGATGTAGCAA-3′。預期擴增片段大小分別為480 bp和360 bp。

1.2.3 分離病原微生物基因組模板的提取 采用柱式DNA提取方法提取基因組。具體操作如下：(1)取適量菌體加入500 μL裂解液(40 mmol/L EDTA，2%聚乙二醇辛基苯基醚，2 mol/L異硫氰酸酯，0.7 mol/L氯化鈉)，70 ℃水浴2 min，12 000 r/min離心30 s;(2)上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加500 μL無水乙醇，轉(zhuǎn)到DNA純化柱上，12 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中的廢液；(3)用500 μL沖洗液1(10 mmol/L EDTA，70%乙醇，pH值7.0)沖洗，12 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中的廢液；(4)用600 μL沖洗液2(75 mmol/L Tris-HCl，80%乙醇，pH值7.0)沖洗，12 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中的廢液，重復1次;(5)將柱子轉(zhuǎn)到新的離心管上，加50 μL焦碳酸二乙酯水，12 000 r/min離心30 s，即可得到高純度的DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 分離病原微生物PCR擴增 擴增體系為25.0 μL:10×PCR Buffer(Mg2+free) 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 2 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2 μL，DNA模板2 μL，正、反引物(10 μmol/L)各1 μL,RNase Free dH2O補充至25 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。反應結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。取PCR產(chǎn)物5 μL進行點樣，120 V電壓下電泳30 min。

1.2.5 分離病原微生物二重PCR反應 擴增體系為25.0 μL：10×PCR Buffer(Mg2+free) 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 2 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2 μL，DNA 2 μL，豬肺炎支原體和豬鼻支原體正、反引物(10 μmol/L)各1 μL，RNase Free dH2O補充至25 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，進行32個循環(huán)后，72 ℃再延伸2 min。反應結(jié)束后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6 檢測方法的應用 用建立的二重PCR檢測方法對從河南省及周邊地區(qū)豬場采集的患呼吸道疾病的16份病料進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離病原微生物形態(tài)學觀察及鏡檢

分離病原微生物在含0.4%酚紅PPLO的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基由紅變黃，呈輕微渾濁，在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d，觀察可見圓形隆起、邊緣整齊、表面粗糙、中央有顆粒的針尖大小或露珠狀小菌落。菌落呈支原體的“煎蛋樣”典型特征(圖1)。取待檢病原微生物純培養(yǎng)物進行姬姆薩氏染色25 min，于顯微鏡下觀察分離病原微生物形態(tài)，形態(tài)不一，大多呈絲狀(圖2)。

圖1 分離病原微生物菌落形態(tài)

圖2 分離病原微生物在顯微鏡下的形態(tài)

2.2 分離病原微生物PCR擴增結(jié)果

從圖3可以看出，擴增產(chǎn)物電泳后，在480 bp和360 bp處均可見特異性擴增條帶(圖3)，與預期結(jié)果一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化和測序，所得序列與數(shù)據(jù)庫中豬肺炎支原體和豬鼻支原體同源性達99%。

M.Marker 2000；1.空白對照;2.豬鼻支原體;3.豬肺炎支原體

2.3 豬肺炎支原體與豬鼻支原體二重PCR擴增結(jié)果

按照上述單重PCR擴增進行二重PCR，結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物在480 bp和360 bp處均可見特異性擴增條帶(圖4)，與豬肺炎支原體和豬鼻支原體預期結(jié)果一致。

M.Marker 2000；1.豬肺炎支原體;2.豬鼻支原體;3.豬肺炎支原體與豬鼻支原體二重擴增

2.4 建立檢測方法的應用結(jié)果

應用上述研究所建立的方法對臨床16份病料進行檢測，有5份病料檢測為豬肺炎支原體，5份病料檢測為豬鼻支原體，6份病料檢測為陰性(圖5)，陽性檢出率為62.5%。

M.Marker 2000；3、9、10、11、12為豬肺炎支原體；2、5、6、7、8為豬鼻支原體；1、4、13、14、15、16為陰性

3 結(jié)論

本研究對河南省及周邊地區(qū)的豬場患呼吸道疾病的樣品進行支原體的分離，通過菌落觀察、形態(tài)學觀察及分子診斷鑒定，表明分離純化的病原微生物為豬肺炎支原體與豬鼻支原體。在光學顯微鏡下低倍觀察支原體菌落形態(tài)，菌落呈“煎蛋樣”典型特征。針對豬肺炎支原體與豬鼻支原體設計了2對引物，擴增片段大小分別為480 bp和360 bp，通過單一PCR擴增反應，分別得到了豬肺炎支原體與豬鼻支原體相應的目的擴增片段。在單一擴增的基礎(chǔ)上，建立了豬肺炎支原體與豬鼻支原體二重PCR反應方法，可同時得到2條目的條帶，與單一PCR擴增結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，建立的二重PCR方法可用于豬肺炎支原體與豬鼻支原體的同時檢測和鑒別診斷，且簡便快捷，靈敏度高，特異性強。

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Identification and Differential Diagnosis of Mycoplasma hyosynoviae and Mycoplasma hyorhinis

LI Haili1,DENGZU Liying2,XU Yindi1,WANG Zhifang1,ZHANG Qingxian1,ZHU Wenhao1,FANG Jianyu1,YOU Yi1,HOU Zihua1,LANG Limin1,WANG Keling1

(1.Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China;2.Zhengzhou Infant Normal School,Zhengzhou 450000,China)

In order to develop differential diagnosis method ofMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinis,Mycoplasmawas isolated and identified from Henan province and surrounding areas.Two pairs of primers were designed to amplifyMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinisDNA and the fragment sizes were 480 bp and 360 bp respectively.The results showed that the colony was a typical “fried egg” characteristic.The single amplified PCR showed that the isolated microbes wereMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinis.On the basis of single amplification,the double PCR reaction was established for detectingMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinis.The double PCR method could be used for detection and differential diagnosis ofMycoplasmahyosynoviaeandMycoplasmahyorhinis.

Mycoplasmahyosynoviae;Mycoplasmahyorhinis; differential diagnosis; double PCR

S855

A

1004-3268(2017)11-0148-04

2017-06-16

河南省農(nóng)業(yè)科學院自主創(chuàng)新基金項目(2016ZC49)

李海利(1982-)，男，河南開封人，助理研究員，博士，主要從事動物傳染病臨床診斷及防控研究工作。

E-mail:haili8693@sina.com