宋協(xié)法， 王學(xué)超， 董登攀

(中國海洋大學(xué)，山東 青島 266003)

三種因素對(duì)海水生物流化床啟動(dòng)期間營養(yǎng)鹽去除及amoA基因表達(dá)的影響

宋協(xié)法， 王學(xué)超， 董登攀

(中國海洋大學(xué)，山東 青島 266003)

循環(huán)水養(yǎng)殖；生物流化床；生物過濾功能啟動(dòng)；營養(yǎng)鹽；功能基因

生物濾池作為封閉式循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的核心單元，是控制養(yǎng)殖用水質(zhì)量、維持養(yǎng)殖系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行的關(guān)鍵[1]。常見的生物過濾器有浸沒式生物過濾器、滴流式生物過濾器、生物轉(zhuǎn)盤、生物轉(zhuǎn)筒、念珠式生物過濾器、生物流化床等，其中生物流化床由于其能提供良好的傳質(zhì)效果、較高的TAN處理效率、相對(duì)較小的占地面積以及巨大的比表面積等，被認(rèn)為是最先進(jìn)的生物反應(yīng)器類型之一[2-3]。生物流化床作為一種新型高效的生物濾器，已廣泛應(yīng)用于美國等發(fā)達(dá)國家養(yǎng)殖企業(yè)的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中[3-5]。國內(nèi)外學(xué)者針對(duì)生物流化床開展了一系列研究。Iván等[3]、張海耿等[6]和朱興一[7]均將生物流化床應(yīng)用于羅非魚循環(huán)水系統(tǒng)，評(píng)價(jià)其對(duì)含氮廢物的去除效果，結(jié)果均顯示其可有效凈化養(yǎng)殖水體，出水水質(zhì)符合羅非魚養(yǎng)殖需求。

生物過濾器啟動(dòng)過程的快慢，啟動(dòng)完成后系統(tǒng)的處理效果及穩(wěn)定性，不僅直接關(guān)系到養(yǎng)殖成本高低，也是循環(huán)水養(yǎng)殖成功的前提和必要條件。柳瑤等[8]以實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的旋轉(zhuǎn)式生物流化床為研究對(duì)象，采用自然生物過濾功能啟動(dòng)法，探究海水與淡水生物濾池過濾功能的啟動(dòng)。張海耿等[9]將流化床應(yīng)用于小型鱘魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，探討自然生物過濾功能啟動(dòng)方式和添加微生態(tài)制劑方式下該濾器的生物過濾功能啟動(dòng)時(shí)間及運(yùn)行效果。但是，目前對(duì)海水生物流化床生物過濾功能啟動(dòng)的影響因素及穩(wěn)定性的研究還存在不足。溫度、膨脹率和初始總氨氮(TAN)濃度是生物流化床運(yùn)行期間的重要參數(shù)，pH、溶氧(DO)和鹽度(SAL)也是維持水體理化性質(zhì)的重要保證，生物流化床運(yùn)行參數(shù)不同，微生物生存的環(huán)境以及生長的快慢也會(huì)不同，生物過濾功能的啟動(dòng)過程也可能不同。因此，研究生物流化床生物過濾功能的啟動(dòng)和微生物功能基因表達(dá)有助于擴(kuò)大生物流化床的應(yīng)用范圍，提高生物過濾功能的啟動(dòng)以及提高水處理效率。

1 材料與方法

1.1 模擬養(yǎng)殖污水處理系統(tǒng)

實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生物流化床海水養(yǎng)殖廢水處理系統(tǒng)由水泵、養(yǎng)殖池、生物流化床、沉淀池及溫控設(shè)備組成(圖1)。其中，床體高度134 cm，床體直徑19 cm，進(jìn)水管直徑2 cm，出水管直徑10 cm，布水腔底部直徑29 cm。

圖1 養(yǎng)殖污水處理系統(tǒng)

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 濾料

石英砂是國外最常采用的生物流化床填料[4]，實(shí)驗(yàn)選擇的石英砂粒徑0.35～0.65 mm，密度286 kg/m3，在生物流化床中的填充高度40 cm，體積約11 L，填充率30%。

1.2.2 人工配置海水養(yǎng)殖廢水

本試驗(yàn)的養(yǎng)殖廢水通過從魚池中收集的殘餌糞便進(jìn)行配置。殘餌糞便取自山東東方海洋科技股份有限公司的大西洋鮭循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，經(jīng)自然風(fēng)干后于烘箱內(nèi)65 ℃烘干12 h，烘干后的殘餌糞便使用研磨機(jī)粉碎；配水時(shí)取500 g溶于少量水后發(fā)酵3 d，經(jīng)300目篩絹過濾，將浸出液倒入體積約75 L的水桶中混勻，棄去殘?jiān)瑴y(cè)定水質(zhì)指標(biāo)后按照比例用來自青島近海沙濾海水的凈海水稀釋作為試驗(yàn)用水[10]。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 試驗(yàn)參數(shù)設(shè)置表

1.4 試驗(yàn)指標(biāo)與分析方法

1.4.1 樣品采集

在生物流化床運(yùn)行期間，每天在流化床床體、養(yǎng)殖池及蓄水池取水樣。水樣取出后及時(shí)測(cè)定營養(yǎng)鹽濃度。每10 d在無菌條件下在流化床上、中、下3個(gè)取樣點(diǎn)采集石英砂樣品，混勻后凍存于-80 ℃冰箱中。

1.4.2 水質(zhì)測(cè)定方法

TAN的去除效果用去除率A來表示：

A=100%×(Ct—C0)/C0

(1)

式中：A—TAN去除率，%；C0—TAN初始質(zhì)量濃度，mg/L；Ct—t時(shí)溶液中的TAN質(zhì)量濃度，mg/L。

1.4.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

在生物流化床運(yùn)行期間，每10 d在流化床的上、中、下3個(gè)取樣點(diǎn)采集石英砂樣品，混勻后凍存于-80℃冰箱中。樣品DNA的提取采用Fast DNA SPIN Kit for soil (MP Biomedicals,Illkirch,France) 按照操作說明進(jìn)行提取，提取后的DNA通過核酸蛋白檢測(cè)儀(NANODROP2000,Thermo,USA)測(cè)量核酸的濃度及純度。以amoA-1F(5’-GGG GTT TCT ACT GGT GGT)和amoA-2R(5’-CCC CTC KGS AAA GCC TTC TTC)[11]為引物擴(kuò)增amoA基因片段，片段長度491bp。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min;35個(gè)循環(huán)包括94℃變性30 s,58℃退火 45 s,72℃延伸 45 s;72℃延伸10 min。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將純化好的PCR產(chǎn)物與T-載體(TAKARA)連接，參照相關(guān)文獻(xiàn)[12]制備標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用特異性引物amoA-1F和aomA-2R對(duì)氨氧化細(xì)菌(Ammonium-oxidizing bacteria，AOB)的amoA功能基因進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)在Mastercycler ep realplex 實(shí)時(shí)定量PCR儀(Eppendorf,Germany)上進(jìn)行，采用試劑盒(SYBR?Premix Ex Taq kit,TaKaRa,Japan)進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)體系見表2。

表2 PCR反應(yīng)體系

實(shí)時(shí)定量的程序?yàn)椋?5 ℃ 900 s；95 ℃ 15 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線程序：95 ℃ 15 s，63 ℃ 15 s，15 min，95 ℃ 15 s。

2 結(jié)果

2.1 溫度對(duì)營養(yǎng)鹽去除率及功能基因表達(dá)的影響

不同溫度下的TAN去除率變化趨勢(shì)類似，呈現(xiàn)先逐漸升高的趨勢(shì)(圖2)。在15℃、20℃和25℃處理下，TAN去除率分別在第23天、17天和17天達(dá)到90%。相對(duì)于20和25℃兩個(gè)處理，在溫度為15℃時(shí)TAN去除率在前10 d內(nèi)增長緩慢并伴有小幅波動(dòng)，且達(dá)到穩(wěn)定所需要的時(shí)間最長。

隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，3種溫度處理下氨氧化細(xì)菌amoA的數(shù)量均呈上升趨勢(shì)(圖3)。在同次取樣時(shí)間點(diǎn)下，氨氧化細(xì)菌amoA的數(shù)量隨著溫度的升高而升高。結(jié)合不同溫度下TAN去除率的變化，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中氨氧化細(xì)菌amoA基因數(shù)量的變化與TAN去除率的變化相一致。

圖2 不同溫度對(duì)生物流化床TAN去除率和質(zhì)量濃度變化的影響

圖3 不同溫度對(duì)生物流化床內(nèi)amoA基因數(shù)量變化的影響

Fig.3 The effect of different temperatures on the amount of amoA gene in cyclo-bio fluidized sand biofilters

2.2 不同初始TAN濃度處理下生物流化床的生物過濾功能啟動(dòng)情況

圖4 生物流化床中不同TAN濃度對(duì)TAN去除率和濃度變化的影響

Fig.4 The effect of different ammonia concentrations on the removal effeiency of ammonia and the concetration of nitrate in cyclo-bio fluidized sand biofilters

如圖5所示，隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，3種初始TAN濃度下AOB的amoA數(shù)量均隨著時(shí)間增長而增多，在相同的時(shí)間下，AOBamoA的數(shù)量隨著初始TAN濃度的升高而升高。結(jié)合在不同TAN初始濃度下TAN去除率的變化，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中氨氧化細(xì)菌的amoA基因數(shù)量與TAN去除率有相似的變化趨勢(shì)。

圖5 不同TAN濃度對(duì)生物流化床內(nèi)amoA 基因數(shù)量變化的影響

Fig.5 The effect of different ammonia concentrations on the amount of amoA gene in cyclo-bio fluidized sand biofilters

2.3 不同膨脹率下生物流化床的生物過濾功能啟動(dòng)情況

如圖6所示，在膨脹率為100%和150%時(shí)，TAN去除率的變化趨勢(shì)相似；在膨脹率為50%時(shí)，TAN去除率增長較慢，并且最后TAN去除率只達(dá)到了80%，其他兩個(gè)膨脹率下TAN去除率均達(dá)到了100%。膨脹率為100%和150%時(shí)，TAN去除率達(dá)到90%分別需要13 d和12 d，到達(dá)穩(wěn)定的時(shí)間分別為20 d和19 d，差別不明顯。

如圖7所示，從整體趨勢(shì)來看，3種膨脹率下AOBamoA數(shù)量均隨著時(shí)間增長而增多，在相同的時(shí)間下AOBamoA數(shù)量隨著膨脹率的升高而升高。結(jié)合不同膨脹率下TAN去除率的變化發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，AOBamoA基因數(shù)量與TAN去除率的變化呈相似趨勢(shì)。

圖6 生物流化床中不同膨脹率對(duì)和TAN去除率的影響

Fig.6 The effect of different expansion rates on the removal effciency of ammonia and the concentration of nirate in eyclo-bio fluidized sand biofilters

3 討論

3.1 溫度對(duì)營養(yǎng)鹽去除率及功能基因表達(dá)的影響

硝化細(xì)菌是生物硝化脫氨中起主要作用的微生物，直接影響硝化效果和生物脫氨效率。環(huán)境溫度對(duì)硝化細(xì)菌的生長影響較大，大多數(shù)硝化細(xì)菌適宜生長的溫度為10℃～38 ℃，當(dāng)溫度低于10 ℃時(shí)，硝化細(xì)菌的活性較低，TAN的轉(zhuǎn)化會(huì)受到影響[13]。高于20 ℃時(shí)硝化細(xì)菌的活性較高，但高于38℃時(shí)硝化作用會(huì)消失[14]。因此，選取合適的反應(yīng)溫度是提高生物濾器硝化脫氮效率的重要前提。

圖7 不同膨脹率對(duì)生物流化床內(nèi)amoA 基因數(shù)量變化的影響

Fig.7 The effect of different expansion rates on the amount of amoA gene in cyclo-bio fluidized sand biofilters

生物濾器是循環(huán)水養(yǎng)殖的重要環(huán)節(jié)，生物濾器上附著硝化細(xì)菌，尤其是AOB直接決定其處理效率的高低[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高生物流化床內(nèi)AOBamoA數(shù)量呈增長趨勢(shì)，在25℃下菌群密度最大，說明多數(shù)AOB是嗜溫菌，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，AOB的生長速率升高、活性增強(qiáng)，表現(xiàn)為生物流化床對(duì)TAN的良好去除效果。該研究與竇娜莎[18]的研究結(jié)果相似，其發(fā)現(xiàn)曝氣生物濾池內(nèi)AOB菌群密度隨溫度升高而增大，與污染物的去除率變化趨勢(shì)一致。

3.2 初始TAN濃度對(duì)營養(yǎng)鹽去除率及功能基因表達(dá)的影響

TAN濃度本身會(huì)影響硝化反應(yīng)，被認(rèn)為是設(shè)計(jì)和管理生物濾器最重要的影響因素[19]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著初始TAN濃度的升高，TAN去除率的增速也加快，在初始TAN濃度為4 mg/L時(shí)，系統(tǒng)達(dá)到TAN近似完全去除所用時(shí)間最短。朱興一[7]研究發(fā)現(xiàn)隨TAN濃度的增加，TAN去除率逐漸上升，當(dāng)進(jìn)水TAN濃度為10 mg/L時(shí),TAN的去除率達(dá)到最大值。有研究指出，當(dāng)TAN濃度超過3 mg/L時(shí)，積累的TAN會(huì)抑制硝化反應(yīng)[20]。但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模循環(huán)水系統(tǒng)下，當(dāng)初始TAN濃度提高到4 mg/L時(shí)，仍然能保持較好的TAN去除率。原因可能是：一方面，本實(shí)驗(yàn)選用的生物流化床填料具有巨大的比表面積，能夠達(dá)到較高的水處理效率；另一方面，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模循環(huán)水系統(tǒng)容積較小，在相同的時(shí)間內(nèi)循環(huán)的次數(shù)較多。

本研究發(fā)現(xiàn)初始TAN濃度升高，amoA基因數(shù)量有較明顯的增加。Mota等[21]和楊小麗等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)隨著TAN濃度的增加，amoA基因數(shù)量增多，氨氧化細(xì)菌比例隨之增大。

3.3 膨脹率對(duì)海營養(yǎng)鹽去除率及功能基因表達(dá)的影響

膨脹率是生物流化床特有的操作參數(shù)。膨脹率不同，水流流速不同，也就導(dǎo)致單位體積TAN的轉(zhuǎn)換率(VTR)不同。這與生物濾器中的水力停留時(shí)間(HRT)對(duì)營養(yǎng)鹽處理的原理相似。適宜的膨脹率能保持濾料與底物的充分接觸，為濾料表面的微生物提供充足溶氧和營養(yǎng)物質(zhì)，從而對(duì)營養(yǎng)鹽保持較好的去除效果[23]。因此，選取適宜的膨脹率是生物流化床乃至循環(huán)水系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)在選取50%、100%和150%膨脹率參數(shù)下，生物流化床均顯示出良好的硝化性能，但在膨脹率為150%時(shí)TAN去除率比100%時(shí)的提升不大，但仍有較好的硝化性能。原因可能是在膨脹率150%時(shí)，濾料在啟動(dòng)過程中有一定的流失[4]。柳瑤等[8]研究旋轉(zhuǎn)式生物流化床啟動(dòng)時(shí)發(fā)現(xiàn)污水處理效率隨膨脹率增大而提高，膨脹率為100%時(shí)處理效率最高。Pujol等[24]也認(rèn)為適當(dāng)提高流速會(huì)對(duì)硝化作用有積極的促進(jìn)作用。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在膨脹率為100%和150%時(shí)，amoA基因數(shù)量無明顯差異，可能原因是在生物流化床啟動(dòng)期間，TAN濃度保持不變，amoA基因數(shù)量也隨著生物流化床的啟動(dòng)逐漸達(dá)到穩(wěn)定。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，在水溫為25 ℃時(shí)生物流化床掛膜完成所需時(shí)間最短，為23 d，并且amoA基因數(shù)量增速最快。在初始TAN濃度為4 mg/L時(shí)生物流化床掛膜完成所需時(shí)間最短，為21d，amoA基因數(shù)量也會(huì)隨著初始TAN濃度升高而增加。在膨脹率為100%和150%時(shí)生物流化床啟動(dòng)完成所需時(shí)間無明顯差異，但明顯短于膨脹率為50%時(shí)的生物流化床啟動(dòng)完成所需的時(shí)間。在膨脹率為100%和150%時(shí)，amoA基因數(shù)量無明顯差異。

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EffectofthethreefactorsonnutrientremovalandexpressionofamoAgeneduringthestart-upperiodofseawatercyclo-biofluidizedsandbiofilters

SONGXiefa,WANGXuechao,DONGDengpan

(OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China)

Under laboratory scale,with the cyclo-bio fluidized sand biofilter (CB-FSB) as the research object,the changes of the removal performance of ammonia-nitrogen and the nitrite-nitrogen,and the amount ofamoAgene during the start-up period of cyclo-bio fluidized sand biofilter (CB-FSB) under different initial ammonia-nitrogen concentrations,water temperatures and filter expansion rates were studied in this paper. The experimental results showed that the time required for the start-up of cyclo-bio fluidized sand biofilter (CB-FSB) was shortened with the increasing of water temperature. The time required for the start-up of CB-FSB were 27,25,and 23 days at 15℃,20℃ and 25 ℃,respectively. The time required for the start-up of CB-FSB was shortened with the increasing of the initial ammonia nitrogen concentration. The time required for the start-up of CB-FSB were 24,22,21 days at 1 mg/L,2 mg/L and 4 mg/L,respectively. There was no significant difference between 100% and 150% filter expansion rates for the start-up of CB-FSB,which was 21 days and 20 days,respectively. They were better than that with 50% expansion rate. The time required for the start-up of CB-FSB with 50% expansion rate was 27 days. The amount ofamoAgene was related to the change of nitrite-nitrogen removal rate and increased with the increasing of initial ammonia-nitrogen concentration. The amount ofamoAgene reached the peak at 4mg/L of ammonia-nitrogen concentration,which was 2.76 × 107copies/g.

recirculating aquaculture;stat-up of cyclo-bio fluidized sand biofilters;nutrient salt;function gene

10.3969/j.issn.1007-9580.2017.06.005

2017-09-04

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD13B04)

宋協(xié)法(1964—)，男，教授，博士，研究方向：設(shè)施漁業(yè)和養(yǎng)殖污水處理。E-mail：yuchuan@ouc.edu.cn

S959

A

1007-9580(2017)06-024-06