CLC-3 siRNA對人肺動脈平滑肌細胞增殖及細胞周期的影響

師慶紅，秦 迪，趙長福，張 欣，楊照微，黃麗紅*，何成彥

(吉林大學中日聯誼醫(yī)院 1.檢驗科；2.老年病科；3.骨科，吉林 長春130033)

CLC-3 siRNA對人肺動脈平滑肌細胞增殖及細胞周期的影響

師慶紅1，秦 迪2，趙長福3，張 欣2，楊照微1，黃麗紅2*，何成彥1

(吉林大學中日聯誼醫(yī)院 1.檢驗科；2.老年病科；3.骨科，吉林 長春130033)

目的探討CLC-3 siRNA對人肺動脈平滑肌細胞(PASMC)增殖及細胞周期的影響。方法應用脂質體3000將CLC-3 siRNA轉入PASMC。通過免疫印記法測定了CLC-3 siRNA干擾后PASMC的CLC-3表達水平；應用臺盼藍染色計數法計數了細胞增殖；流式細胞儀測定了細胞周期。結果(1)CLC-3 siRNA可降低PASMC的CLC-3表達；(2)CLC-3 siRNA干擾可顯著抑制PASMC增殖,與空白對照、陰性對照 siRNA轉染組相比P<0.05；(3)CLC-3 siRNA干擾可顯著減少PASMC的S期細胞、增加G1期細胞，與空白對照、陰性對照 siRNA轉染組相比P<0.05。結論CLC-3 siRNA干擾PASMC表達CLC-3，可抑制PASMC的增殖并影響其細胞周期進程。

肺動脈高壓；肺動脈平滑肌細胞(PASMC)；氯離子通道CLC-3；siRNA

(ChinJLabDiagn,2017,21:2171)

肺動脈高壓嚴重威脅著人類健康[1]。研究證實肺小動脈血管增生是肺動脈高壓的主要特征之一，肺動脈血管平滑肌細胞(PASMC)增殖在肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用[2]。近年來以其為靶點治療肺動脈高壓取得一定進展。體內多種因素影響心肌及血管平滑肌細胞的增殖，如細胞腫脹激活性氯離子通道(Icl.swelling)及其氯通道CLC-3等[3,4]。在本研究中我們應用CLC-3 siRNA干擾人PASMC表達CLC-3蛋白，初步探討了干擾其表達對人PASMC增殖及其細胞周期的影響，為進一步深入研究CLC-3在肺動脈高壓發(fā)病機制中的作用及以其為靶點新的治療策略奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1人PAMSC的培養(yǎng)

人肺動脈平滑肌細胞(HPAMSC，ScienCell)培養(yǎng)于多聚賴氨酸處理(2 μg/cm2)的培養(yǎng)10 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為平滑肌細胞生長培養(yǎng)基(ScienCell)，其中含5%胎牛血清、SMCGS、青霉素、鏈霉素。5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，生長至約90%匯合時傳代。HPAMSC在5至12代用于本實驗。

1.2CLC-3siRNA轉染

CLC-3 siRNA由Origene公司合成，序列為：AGCUACAACAGUAUAACAAGUGCAA，陰性對照siRNA由Origene公司提供。轉染方法：將分別用125 μl無血清SCM稀釋的7.5 μl Lipofectamin 3000 和1 μl CLC-3 siRNA(20 μM)混合，室溫孵育15 min，加入接種1×105HPAMSC 的6孔板中，輕輕混勻，培養(yǎng)48 h后進行干擾目的基因表達的檢測。

1.3免疫印記法檢測CLC-3蛋白表達水平

用細胞裂解液裂解細胞(Gengstar)，制備細胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量。經10%SDS-PAGE電泳后轉膜，封閉過夜后加入CLC-3多克隆抗體(CST，1∶1 000稀釋)、GAPDH多克隆抗體(碧云天，1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，洗膜后加入HRP-羊抗兔IgG(碧云天1∶1 000稀釋)室溫孵育1 h，洗膜后加發(fā)光試劑(ThermoFisher)，壓片、顯影、定影后觀察記錄結果。

1.4細胞增殖的測定

轉染48 h后，用0.004%EDTA-0.05%胰酶消化細胞,PBS洗2次，用1%臺盼藍染色計數活細胞數，每組計數3孔。

1.5細胞周期測定

轉染48 h后，用0.02%EDTA-0.05%胰酶消化細胞,PBS洗2次后，用200 μl PBS重懸細胞，逐滴加入到預冷的70%乙醇中，4℃保存；24 h后離心，PBS洗3次，加入500 μl含50 mg/ml PI、100 μg/ml RNase A、0.2%Triton X-100的PBS，用流式細胞儀分析細胞周期。

1.6統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1CLC-3siRNA對人PAMSC表達CLC-3蛋白的影響

空白對照、陰性對照 siRNA轉染及CLC-3 siRNA 轉染組細胞，提取細胞總蛋白，通過免疫印記法檢測CLC-3蛋白表達水平。結果顯示：與PAMSC空白對照、陰性對照 siRNA轉染組相比，CLC-3 siRNA組CLC-3表達水平降低，見圖1。

2.2干擾CLC-3表達對人PAMSC增殖及細胞周期的影響

轉染48 h后，收集空白對照、陰性對照 siRNA轉染及CLC-3 siRNA 轉染組細胞，計數每孔活細胞數并通過流式細胞儀進行細胞周期分析。結果顯示：與空白對照、陰性對照 siRNA轉染組相比，CLC-3 siRNA組活細胞數顯著減少(P<0.05)；CLC-3 siRNA組S期細胞呈減少、G1期細胞增加，與空白對照、陰性對照 siRNA轉染組相比，P<0.05，見表1。

表1 CLC-3 siRNA對人肺動脈平滑肌細胞增殖及細胞周期的影響

*與空白對照、陰性對照 siRNA組相比P<0.05

3 討論

肺動脈高壓是以肺小動脈血管痙攣、肺小動脈血管增生和重構為主要特征的一種疾病。PASMC增殖導致肺小動脈增生及重構，在肺動脈高壓病理過程中起關鍵作用[5]。目前針對PASMC增殖的藥物如前列腺環(huán)素類似物、內皮素受體拮抗劑等在臨床治療肺動脈高壓中取得了一定療效[6,7]，但療效仍不理想。近年來研究發(fā)現細胞腫脹激活性氯離子通道(Icl.swelling)及其通道基因CLC-3在高血壓、心肌缺血/再灌注、心肌肥厚和心力衰竭中發(fā)揮重要作用[8,9]。氯離子通道阻滯劑DIDS、DCPIB等可影響PASMC 的增殖，為開發(fā)肺動脈高壓治療策略指出了新的方向。在本研究中我們應用CLC-3 siRNA干擾人PASMC表達CLC-3蛋白，初步觀察到干擾CLC-3表達不僅可抑制人PASMC細胞增殖，而且也影響其細胞周期進程，使部分細胞阻滯在G1期，進入S期細胞顯著減少。本研究結果提示我們：CLC-3是研究PASMC增殖的較理想靶點，干擾CLC-3表達可影響PASMC細胞的 G1/S期轉換。本研究為深入探討CLC-3與肺動脈高壓相關性及CLC-3影響PASMC細胞增殖的機制奠定了實驗基礎。

[1]Hong David.肺動脈高壓所致右心衰竭機制與治療[J].中國高血壓雜志,2012,20(7)：604.

[2]張凌云,高安寶.肺動脈平滑肌細胞與低氧性肺血管重塑形成機制[J].中國動脈硬化雜志,2013,21(2)：177.

[3]Xiong D,Heyman N,Airey J,et al.Cardiac-specific,inducible CLC-3 gene deletion eliminates native volume-sensitive chloride channels and produces myocardial hypertrophy in adult mince[J].J Mol Cell Cardiol,2010,48:211.

[4]Chu X,Filali M,Santic B,et al.A critical role for chloride channel-3 (CLC-3) in smooth muscle cell activation and neointima formation[J].Arterioscler Tbromb Vasc Biol,2011,31:345.

[5]Archer SL,Weir EK,Wikins MR,et al.Basic science of pulmonary arterial hypertension for clinicians:new concepts and experimental therapies[J].Circulation,2010,121:2045.

[6]梁富翔，宋 兵，祁 泉,等.內皮素受體拮抗劑治療肺動脈高壓療效和耐受性的網狀Meta分析[J].中國循證心血管醫(yī)學雜志,2014,6(7)：663.

[7]何建國,楊 濤.肺動脈高壓治療新視野[J].中國循環(huán)雜志,2014,29(10)：761.

[8]Large WA,Wang Q.Characteristics and physiological role of the Ca2+-activated Cl-conductance in smooth muscle[J].Am J Physiol Cell Physiol,1996,271:C435.

[9]Liang W,Ray JB,He JZ,et al.Regulation of proliferation and membrane potential by chloride currents in rat pulmonary artery smooth muscle cells[J].Hypertension,2009,54:286.

CLC-3siRNAeffectsonHumanPulmonaryArterySmoothMuscleCellsProliferationandcellcycles

SHIQing-hong,QINDi,ZHAOChang-fu,etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo evaluate the effects of CLC-3 siRNA on the proliferation and cell cycles of PASMC.MethodsWe transfect CLC-3 siRNA into PASMC by Lipofectamine 3000 reagent.The expression of CLC-3 protein in PASMC is detected by western blotting after CLC-3 siRNA transfection.The cell proliferation of PASMC is counting by trypan blue staining and the cell cycle of PASMC is analyzed by flow cytometry.Results(1)CLC-3 siRNA can reduce the expression of CLC-3 protein in PASMC.(2)CLC-3 siRNA interference can significantly decrease the proliferation of PASMC,compare to blank control,negative siRNA,P<0.05.(3)CLC-3 siRNA interference can significantly reduce the S phase PASMCs and increase G1 phase PASMCs,compare to blank control,negative siRNA ,P<0.05.ConclusionCLC-3 siRNA can interfere the CLC-3 expression in PASMC,and can decrease the proliferation of PASMC and affect the process of PASMC cell cycle.

Pulmonary hepertension；Pulmonary artery smooth muscel cells(PASMC)；Chloride channel CLC-3；siRNA

國家自然基金項目(81572082);吉林省科技廳資助(2015010153JC,20140311092YY)

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2171-03

R543.2

A

2017-03-14)