王偉，冷凱良，劉均忠，郝建華，孫謐*

1(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部極地漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島，266071)2(青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室，海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島，266235)

微生物擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)在水產(chǎn)品加工與貯藏中的應(yīng)用

王偉1,2，冷凱良1，劉均忠1,2，郝建華1,2，孫謐1,2*

1(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部極地漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島，266071)2(青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室，海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島，266235)

簡介了微生物擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)，簡述該技術(shù)在水產(chǎn)品加工與貯藏研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀。在發(fā)酵水產(chǎn)品、水產(chǎn)品低溫加工和保鮮防腐等方向，眾多研究以高通量方法測定細(xì)菌和古菌的16S rRNA基因片段，準(zhǔn)確獲得水產(chǎn)品中微生物的種類和數(shù)量信息。微生物擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)的可培養(yǎng)法，也優(yōu)于許多非培養(yǎng)分析技術(shù)。同時還指出了該技術(shù)的存在問題及對策，并探討了該技術(shù)的發(fā)展方向和應(yīng)用前景。

擴(kuò)增子高通量測序;16S rRNA基因;水產(chǎn)品加工與貯藏;微生物檢測

新1代測序(next-generation sequencing, NGS)是區(qū)別于經(jīng)典的桑格測序法的革命性技術(shù)，近十幾年迅速發(fā)展，已成為主流的測序方法，實(shí)現(xiàn)了高通量測序(high throughput sequencing, HTS)[1]。高通量測序使核酸測序成本大幅度下降，從而推動了生命科學(xué)各學(xué)科的發(fā)展[2]。在食品微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，高通量測序技術(shù)已成為最重要的非培養(yǎng)技術(shù)，主要用于16S rRNA等基因的擴(kuò)增子(amplicon)測序[3]。擴(kuò)增子高通量測序可以檢測食品中微生物群落的結(jié)構(gòu)及時空動態(tài)變化[4]，為提高食品質(zhì)量和安全管理水平提供指導(dǎo)。在水產(chǎn)品加工與貯藏領(lǐng)域，目前國內(nèi)外學(xué)者在發(fā)酵水產(chǎn)品、水產(chǎn)品低溫加工和保鮮防腐等方向也開始應(yīng)用微生物擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)，獲得了理想的結(jié)果。本文述評微生物擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)在水產(chǎn)品加工與貯藏研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并展望該技術(shù)的發(fā)展趨勢。

1 微生物擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)簡介

16S rRNA基因是用于細(xì)菌和古菌分類鑒定的主要基因[5]，目前應(yīng)用廣泛的第2代測序儀的測序讀長無法覆蓋該基因的1.5 kbp全長，只能測定16S rRNA基因的一段序列。該基因序列含有間隔排列的10個保守區(qū)和9個高變區(qū)(V1-V9)，可以根據(jù)高變區(qū)側(cè)翼的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并PCR引物，選擇性擴(kuò)增特定的高變區(qū)[6]。提取待測樣品的總DNA后，以PCR方式獲得其中細(xì)菌和古菌的16S rRNA基因片段并構(gòu)建擴(kuò)增子文庫。對文庫中的PCR產(chǎn)物高通量測序，就能獲得每個樣品中數(shù)萬條甚至十幾萬條16S rRNA基因片段的序列，再以生物信息學(xué)的方法去除錯誤的測序結(jié)果，劃定微生物操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)，并和參考數(shù)據(jù)庫中已知的微生物基因比較，確定OTU的分類學(xué)地位。最后進(jìn)行微生物生態(tài)學(xué)分析，計(jì)算多樣性指數(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹分析、菌群差異分析、多維度分析和功能預(yù)測分析等[7]。

基于焦磷酸測序原理的454測序系統(tǒng)是最先上市的高通量測序平臺[8]，但由于測序費(fèi)用偏高目前已被最主流的Illumina公司測序儀取代。Illumina的HiSeq2500和MiSeq測序儀是16S rRNA基因擴(kuò)增子測序的最常用平臺，最大讀長分別為2×250 bp和2×300 bp。賽默飛世爾公司的基于半導(dǎo)體測序原理的Ion PGM測序儀讀長可達(dá)400 bp，也用于16S rRNA基因擴(kuò)增子測序[9]；較新的Ion S5測序儀讀長可達(dá)600 bp。Pacific Bioscience公司的第3代測序儀PacBio RS II和Sequel的讀長都超過20 kbp；Oxford Nanopore公司的第3代測序儀MinION讀長超過6 kbp[2]。目前以第3代測序儀開展16S rRNA基因高通量測序的研究報(bào)道較少。

2 微生物擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)的主要優(yōu)勢

水產(chǎn)品微生物的研究技術(shù)中，16S rRNA基因擴(kuò)增子高通量測序是一種非培養(yǎng)分析法(culture-independent analysis)，它克服了傳統(tǒng)的培養(yǎng)法對培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度等培養(yǎng)條件的依賴，直接從樣品DNA中確定門、綱、目、科、屬等各個分類學(xué)等級上的微生物的種類和相對豐度，可以獲得樣品中大多數(shù)微生物的信息。在其他非培養(yǎng)分析法中，熒光定量PCR(qPCR)只能檢測微生物總量和某類微生物數(shù)量；限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)，變性梯度膠凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)，溫度梯度膠凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)等技術(shù)都以PCR擴(kuò)增16S rRNA基因片段，但后續(xù)分析依賴電泳和傳統(tǒng)的桑格測序，結(jié)果的準(zhǔn)確度以及檢測到的微生物種類數(shù)都無法和16S rRNA擴(kuò)增子的高通量測序相比。微生物擴(kuò)增子高通量測序還易于開展樣品的高通量分析，即同時對大量樣品開展研究[4]。因此，這一技術(shù)在水產(chǎn)品加工和貯藏領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛(表1)。

表1 微生物16S rRNA基因擴(kuò)增子高通量測序在水產(chǎn)品加工和貯藏中的應(yīng)用Table 1 High-throughput microbial 16S rRNA amplicon sequencing in the study of processing and storage of aquatic food

注：*V1-V3區(qū)為細(xì)菌測序，V3-V5區(qū)為古菌測序。

3 水產(chǎn)品加工領(lǐng)域的應(yīng)用

微生物擴(kuò)增子高通量測序可用于檢查水產(chǎn)品加工過程中微生物污染。M?RETR?等[12]監(jiān)測7個加工廠的大西洋鮭魚片，發(fā)現(xiàn)主要污染菌是假單胞菌(Pseudomonas)和希瓦菌(Shewanella)。在水產(chǎn)品發(fā)酵工藝中應(yīng)用高通量測序的報(bào)道較多：ROH等[21]發(fā)現(xiàn)7種發(fā)酵海鮮產(chǎn)品的古菌種類都多于細(xì)菌，其中6種產(chǎn)品的嗜鹽古菌為優(yōu)勢菌；KOYANAGI等[22-24]發(fā)現(xiàn)在咸魚壽司發(fā)酵過程中，乳酸菌占絕對優(yōu)勢；鹽發(fā)酵的日本毛蝦在不同的溫度、鹽濃度和發(fā)酵時間等條件下取樣檢測，菌群變化情況為最優(yōu)發(fā)酵條件的選擇提供了重要依據(jù)[25-27]；吳燕燕等比較傳統(tǒng)法和新型乳酸菌法腌干魚的發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)新工藝方法獲得的樣品中有益微生物占優(yōu)勢[29]；于美娟等發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵魚制品中細(xì)菌多樣性豐富，但具有潛在危害的細(xì)菌種類也較多[30]。

4 水產(chǎn)品貯藏領(lǐng)域的應(yīng)用

國內(nèi)外學(xué)者以擴(kuò)增子高通量測序法對各種水產(chǎn)品在不同保藏條件下菌群隨時間的變化及腐敗菌進(jìn)行了檢測。CHAILLOU等[10]發(fā)現(xiàn)腐敗的鱈魚片中優(yōu)勢菌為未知的梭桿菌(Fusobacteriales)，而腐敗的鮭魚片中有高溫菌Hydrogenophilushirshii和Geobacillusdebilis，可能來自低溫養(yǎng)殖環(huán)境；CALLIAUW等[13]發(fā)現(xiàn)4 ℃氣調(diào)包裝的去皮褐蝦(Crangoncrangon)腐敗時，可培養(yǎng)方法和高通量測序法能檢測出的細(xì)菌種類相似，但相對豐度差別較大；王晶晶等[16]檢測輻照真空包裝的象拔蚌(Panopeaabtupta)，當(dāng)電子束和γ射線兩類輻照劑量高于4 kGy時，兩類產(chǎn)品中優(yōu)勢腐敗菌均為變形細(xì)菌(Proteobacteria)；儲建軍等[17]發(fā)現(xiàn)縊蟶(Sinonovaculaconstricta)冰溫?；钇诮K點(diǎn)的優(yōu)勢腐敗菌為假單胞菌；朱迎春等[18]發(fā)現(xiàn)氣調(diào)包裝協(xié)同冰溫貯藏革胡子鯰(Calariasgariepinus)魚片顯著降低了細(xì)菌的多樣性和豐度，添加保鮮液能抑制主要腐敗菌乳球菌(Lactococcus)。

高通量測序法在應(yīng)用中充分展示出前述的優(yōu)勢，能檢出培養(yǎng)法無法檢出的難培養(yǎng)的優(yōu)勢微生物，還能確定樣品中大多數(shù)微生物的相對豐度。不過上述部分研究也說明其檢測結(jié)果和傳統(tǒng)培養(yǎng)法及其他非培養(yǎng)方法的結(jié)果不是完全一致的[13-14]。

5 存在問題

微生物擴(kuò)增子高通量測序在水產(chǎn)品加工和貯藏中的應(yīng)用研究報(bào)道幾乎均為細(xì)菌和古菌的16S rRNA基因測序，未見真菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)，18S rRNA或26S rRNA基因測序。這可能和水產(chǎn)品研究中對真菌關(guān)注較少有關(guān)。對真菌進(jìn)行高通量測序檢測，有可能發(fā)現(xiàn)潛在的有益或有害真菌。

由于DNA穩(wěn)定性較好，高通量測序前提取樣品的總DNA中含有暫未降解的已死亡的微生物DNA，以致研究者無法確定檢測到的微生物是否存活[31]。有3種方案可解決該問題：根據(jù)RNA易降解的性質(zhì)，直接提取樣品中總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，就能檢測活菌的基因[32]。CHAILLOU等[10]使用NucleoSpin?Plant II試劑盒去除已裂解死亡的微生物的DNA。肖莉莉等[15]使用疊氮溴化丙錠(PMA)預(yù)處理南美白對蝦樣品，去除死亡菌體DNA后再進(jìn)行完整細(xì)胞中DNA的提取。PMA作為一種無法進(jìn)入完整細(xì)胞內(nèi)部的DNA結(jié)合光敏試劑，已用于熒光定量PCR檢測的預(yù)處理[32]。和常規(guī)DNA提取法相比，上述3種方法成本高且操作復(fù)雜，并未廣泛使用，但今后可能會成為主流方法。

樣品總DNA中16S rRNA基因的拷貝數(shù)在不同種的菌體中存在差異，一般在1～15；同一菌體的16S rRNA基因多個拷貝之間也存在差異[33]。而16S rRNA基因高通量測序的結(jié)果默認(rèn)一個微生物細(xì)胞產(chǎn)生1條序列，這就導(dǎo)致多樣性和豐度被高估或低估[34]。真菌ITS區(qū)也存在類似問題[31]。樣品總RNA還存在基因轉(zhuǎn)錄數(shù)的差異。對不同種類的微生物16S rRNA基因拷貝數(shù)變異問題，有報(bào)道以新算法和新軟件改進(jìn)分析結(jié)果的準(zhǔn)確度[35]，但尚未廣泛使用。對于細(xì)菌種內(nèi)16S rRNA基因多拷貝差異導(dǎo)致多樣性被高估的問題，SUN等認(rèn)為16S rRNA基因V4～V5區(qū)的種內(nèi)變異度最低，推薦作為高通量測序的目標(biāo)區(qū)域[36]。

目前16S rRNA基因擴(kuò)增區(qū)域的選擇沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，也沒有針對某類水產(chǎn)品或其他食品微生物檢測的專門引物。由于16S rRNA基因的差異，不存在能擴(kuò)增所有原核生物類群的通用引物[6]。有報(bào)道，選擇V1～V2區(qū)有利于乳酸菌的分類鑒別[37]，但一般選擇V3～V4或V4～V5區(qū)。這兩個區(qū)域的基因片段長度滿足Illumina測序儀的測序能力，也有相應(yīng)的通用簡并引物能擴(kuò)增大多數(shù)原核生物的類群[38-39]。

增加16S rRNA基因片段的測序長度有助于提高微生物分類的準(zhǔn)確性。基于單分子實(shí)時測序原理的第3代測序儀PacBio RS II測定近16S rRNA基因全長的V1～V9區(qū)，證明了近全長基因能提供更完整的微生物群落組成信息[40]。ZHENG等以此方法檢測了嬰兒配方奶粉中細(xì)菌的種類[41]?；诩{米孔測序原理的小型便攜式第3代測序儀MinION可以將模擬細(xì)菌群落的全長16S rRNA基因鑒定到種[42]。第3代測序儀不僅讀長較長，測序時間也較短[2,43]；MinION還有現(xiàn)場測序的優(yōu)勢。第3代測序技術(shù)有取代現(xiàn)有2代測序平臺的潛力，但測序準(zhǔn)確度尚不及2代測序，且成本過高；現(xiàn)有分析軟件和數(shù)據(jù)庫多數(shù)都是基于2代平臺的測序數(shù)據(jù)[43]。因此3代測序平臺在微生物擴(kuò)增子測序領(lǐng)域暫時無法廣泛應(yīng)用。預(yù)計(jì)Illumina測序平臺在今后一段時期內(nèi)仍是主流，細(xì)菌多樣性研究仍將基于16S rRNA基因部分區(qū)域的測序結(jié)果[6]。檢測真菌也和檢測細(xì)菌的16S rRNA基因類似，擴(kuò)增真菌的ITS1，ITS2，18S rRNA V4等區(qū)域的許多通用引物都用于食品微生物多樣性研究[3]。今后高通量測序研究內(nèi)容仍將是眾多引物擴(kuò)增各種基因片段，不同基因片段測序結(jié)果之間的比較仍存在問題。

6 發(fā)展趨勢與展望

隨著高通量測序成本不斷降低和生物信息學(xué)的發(fā)展，宏基因組(metagenome)測序有可能成為研究水產(chǎn)品加工和貯藏中微生物種類、豐度和功能的重要方法。目前食品領(lǐng)域該技術(shù)僅在乳制品發(fā)酵研究中有報(bào)道[3]。宏基因組測序無需PCR擴(kuò)增，能夠克服上述基因拷貝數(shù)和基因片段選擇的問題，同時檢測水產(chǎn)品中的原核生物、真菌、其他真核微生物及病毒的基因組，獲得微生物群落中重要的功能基因[2]。因此宏基因組測序可以補(bǔ)充擴(kuò)增子高通量測序的結(jié)果。

微生物擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)在水產(chǎn)品加工與貯藏研究中尚未為主流研究方法，主要原因是其費(fèi)用不僅高于培養(yǎng)法，還高于16S rRNA基因克隆文庫RFLP/qPCR/DGGE等非培養(yǎng)方法；而且高通量測序?qū)ρ芯考寄芴岢隽烁咭?，研究人員要掌握生物信息學(xué)相關(guān)的分析能力[4]。高通量測序耗時較長無法快速獲得結(jié)果，這也是影響其應(yīng)用的重要原因。因此近期內(nèi)高通量測序不會替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法成為水產(chǎn)品加工和貯藏的常規(guī)檢測技術(shù)。不過隨著食品質(zhì)量和安全越來越受到政府和群眾的重視，水產(chǎn)品加工和貯藏各環(huán)節(jié)的質(zhì)量提升和隱患排查也越來越依賴先進(jìn)的科技手段；由于微生物對水產(chǎn)品質(zhì)量和安全的重要影響，微生物擴(kuò)增子高通量測序也將更多地應(yīng)用于水產(chǎn)品加工和貯藏研究中，并綜合其他檢測方法，指導(dǎo)改善生產(chǎn)管理，提高產(chǎn)品質(zhì)量和安全性能。

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High-throughputmicrobialrRNAampliconsequencinginthestudyofprocessingandstorageofaquaticfoodproducts

WANG Wei1,2, LENG Kai-liang1, LIU Jun-zhong1,2, HAO Jian-hua1,2, SUN Mi1,2*

1(Key Laboratory of Development of Polar Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)2(Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266235, China)

Food microbiology has been revolutionized by the advances in molecular genetic technology of microbial ecology. Novel microbial detection methods have been applied in the study of processing and storage of aquatic food products. The microbial diversity in the sample to be studied could be detected by high-throughput sequencing (HTS) approaches as culture-independent analyses. The aim of this review is to give a brief introduction of the microbial amplicon HTS technology, to present a survey of recent aquatic food investigations via 16S rRNA amplicon HTS and to illustrate the potential of this approach for a valuable tool in the better characterization of aquatic foods and their processing and storage.

shigh-throughput amplicon sequencing; 16S rRNA gene; processing and storage of aquatic products; microbe detection

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014760

博士，副研究員(孫謐研究員為通訊作者,E-mail：sunmi@ysfri.ac.cn)。

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2016HY-ZD0902)；青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室鰲山科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2016ASKJ14)

2017-05-14，改回日期：2017-06-29