3種三萜類化合物對(duì)黃胸散白蟻生物活性及纖維素酶的影響

徐偉麗+韓萌+袁忠林

摘要：為明確馬纓丹葉片中分離提純的馬纓丹酸、馬纓丹烯A和馬纓丹烯B 3種三萜類化合物對(duì)白蟻的毒殺活性及對(duì)其體內(nèi)纖維素酶的影響，采用濾紙片飼喂法測(cè)定了3種化合物對(duì)黃胸散白蟻的毒殺作用，并用酶標(biāo)儀測(cè)定了不同濃度、不同處理時(shí)間白蟻體內(nèi)內(nèi)切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）、β-葡萄糖苷酶（BGL）活性。結(jié)果表明，3種三萜類化合物對(duì)白蟻具有一定的毒殺作用。酶活性測(cè)定表明，不同濃度馬纓丹酸處理黃胸散白蟻12～72 h，白蟻體內(nèi)的EG、CBH、BGL活性均有不同程度的變化，其對(duì)白蟻體內(nèi)EG活性總體有抑制作用，2 mg/mL在12～36 h抑制作用最為顯著；對(duì)CBH活性則有一定的促進(jìn)作用，2 mg/mL 對(duì)CBH活性促進(jìn)作用較為明顯，但與對(duì)照相比差異不顯著；對(duì)BGL活性則表現(xiàn)為抑制作用。馬纓丹烯B和馬纓丹烯A對(duì)黃胸散白蟻體內(nèi)3種酶活性均表現(xiàn)為抑制作用，且隨濃度的增大抑制作用顯著。因此，3種三萜類化合物對(duì)黃胸散白蟻體內(nèi)的纖維素酶活性均有一定影響，尤其是馬纓丹烯B、A抑制作用較強(qiáng)，它們對(duì)3種酶活性的影響與濃度和時(shí)間有關(guān)。

關(guān)鍵詞：馬纓丹；馬纓丹酸；馬纓丹烯A；馬纓丹烯B；黃胸散白蟻；纖維素酶；生物活性

中圖分類號(hào)：S433文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）11-0098-07

Effects of 3 Triterpenoids on Bioactivity and Cellulase

Activity of Reticulitermes flaviceps （Isoptera： Rhinotermitidae）

Xu Weili， Han Meng， Yuan Zhonglin

（College of Plant Health and Medicine， Qingdao Agricultural University/Key Laboratory of

Integrated Crop Pest Management of Shandong Province， Qingdao 266109， China）

AbstractIn order to define the bioactivity and effects on the cellulose activity of termite， three triterpenoids， lantanolic acid， lantadene A and B， which isolated and purified from leaves of Lantana camara， were used to feed Reticulitermes flaviceps by filter paper method. The activities of 3 enzymes of endo-1，4-β-glucanase （EG）， exo-β-1，4-glucanase（CBH） and β-1，4-glucosidase （BGL） in termite were tested with ELIASA at different concentrations and treatment times. The results showed that the 3 triterpenoids all had certain toxic activity on termite. The enzyme activity test showed that EG， CBH and BGL all had different changes when treated with lantanolic acid for 12～72 hours. In general， lantanolic acid had an inhibitory effect on EG， and it was significant at the concentration of 2 mg/mL in 12～36 hours. Lantanolic acid had certain active effect on CBH， and the effect of 2 mg/mL was more obvious， but it was not significantly different compared with control. On BGL， lantanolic acid showed an inhibitory effect. Lantadene A and B showed inhibitory effects on all three kinds of enzymes， and the inhibitory effects became significant with the increase of concentration. Therefore， three triterpenoids all had certain effects on the cellulase activity in Reticulitermes flaviceps which depended on the concentration and treatment time， especially the inhibitory effect of lantadene B and A.

KeywordsLantana camara； Lantanolic acid； Lantadene A； Lantadene B； Reticulitermes flaviceps； Cellulase； Bioactivity

白蟻（termite）是世界性五大害蟲（須舌蠅、蜱、蚊子、粘蟲和白蟻）之一，總數(shù)不少于2 500種，遍布全世界，特別是熱帶、亞熱帶國(guó)家，為害面積約占全球總面積的50%[1]。白蟻為害十分廣泛，如房屋建筑、園林綠化苗木、鐵道枕木、船舶橋梁、江河堤圍、水庫(kù)土壩、地下電纜、經(jīng)濟(jì)林木、名勝古跡、倉(cāng)庫(kù)物資、文物檔案、家具衣服、室內(nèi)裝飾物等。不僅如此，白蟻對(duì)非纖維素物質(zhì)如塑料、橡膠、瀝青、金屬等也常常進(jìn)行蛀蝕為害。在美國(guó)，每年因地下白蟻為害造成的損失和維修建筑費(fèi)用已超過(guò)火災(zāi)、地震、龍卷風(fēng)和其它自然災(zāi)害損失的總和[2]。

白蟻的一個(gè)明顯特征就是食木性，取食范圍極廣，包括木材（完好的或已腐解的）、植物葉片、腐殖質(zhì)、雜物碎屑以及食草動(dòng)物糞便等。白蟻消化系統(tǒng)內(nèi)存在完整的纖維素酶體系。白蟻后腸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分為P1～P5區(qū)，其中P3區(qū)顯著膨大，棲息著大量微生物，可降解纖維素和半纖維素，發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸供白蟻營(yíng)養(yǎng)[3，4]。根據(jù)酶的性質(zhì)與功能，可將纖維素酶分成內(nèi)切葡聚糖酶（endo-1，4-β-glucanase，EG）、外切葡聚糖酶（exo-β-1，4-glucanase，CBH）和β-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosidase，BGL）。內(nèi)切葡聚糖酶主要作用于非結(jié)晶態(tài)纖維素和水溶性纖維素衍生物，隨機(jī)水解糖苷鍵，將其分解成葡葡糖或纖維二糖、纖維三糖和其他寡聚糖。外切葡聚糖酶包括纖維二糖水解酶（1，4-β-D-glucan cellobiohydrolase，CBH）[5]和外葡萄糖水解酶（1，4-β-D-glucanglucohydrolase），分別作用于晶狀纖維素和可溶性纖維糊精，從多聚糖鏈的非還原端釋放出纖維二糖和葡萄糖。β-葡萄糖苷酶（BGL）將纖維二糖和水溶性纖維糊精水解成葡萄糖[6，7]。

近年來(lái)，由于化學(xué)殺蟲劑的長(zhǎng)期濫用，白蟻抗藥性迅速提高，猖獗危害問(wèn)題日益突出，對(duì)生物、人類健康以及環(huán)境也帶來(lái)大量問(wèn)題，因此，有關(guān)學(xué)者更加重視對(duì)人類健康和環(huán)境影響小的天然殺蟲劑的研究[8]。某些高等植物的代謝產(chǎn)物有抗菌和殺蟲的生物活性，這些高等植物可成為良好的生物資源[9，10].

本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，馬纓丹葉片提取物對(duì)黃胸散白蟻（Reticulitermes flaviceps）具有拒食和毒殺活性[11]，馬纓丹精油對(duì)黃胸散白蟻具有拒避和觸殺作用[12]，但具體作用機(jī)理尚不明確。為探究馬纓丹地上部分精油化合物對(duì)黃胸散白蟻的作用機(jī)理，本試驗(yàn)探究了馬纓丹葉片提取物的3種三萜類化合物對(duì)黃胸散白蟻的毒殺活性及體內(nèi)纖維素酶活性的影響，以明確其生物活性及初步作用機(jī)理。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試植物馬纓丹葉片，于2013年8月采自福建省福州市，陰干粉碎，裝入自封塑料袋中于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2供試害蟲黃胸散白蟻，采自山東省青島嶗山，放在濾紙保持濕潤(rùn)的保鮮盒（體積為11 cm×17 cm×6 cm）內(nèi)飼養(yǎng)，并將保鮮盒放入相對(duì)濕度為98%、溫度25℃的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2試驗(yàn)試劑

馬纓丹酸（lantanolic acid）、馬纓丹烯A（lantadene A）和馬纓丹烯B（lantadene B），均由本實(shí)驗(yàn)室從馬纓丹中提取、分離與鑒定，純度為100%。羥甲基纖維素（天津市巴斯夫化工有限公司，含量為98%）；微晶纖維素（成都市科隆化工試劑廠，含量為99%）；水楊酸（天津博迪化工有限公司，含量為98%）；乙酸鈉（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，含量>99%）；DNS（3，5-二硝基水楊酸，上海展運(yùn)化工有限公司）；氫氧化鈉（天津鼎盛新化化學(xué)試劑廠，含量>96%）；酒石酸（天津市紅巖化學(xué)試劑廠，含量>99%）；苯酚（北京化工有限公司，含量為99%），葡萄糖、丙酮、甲醇等均為分析純。

1.3試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)先通過(guò)毒殺試驗(yàn)明確3種三萜類化合物對(duì)黃胸散白蟻的毒殺作用，確定合適的試驗(yàn)濃度，并在試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)白蟻取食過(guò)的濾紙片進(jìn)行稱重，初步確定對(duì)白蟻的拒食作用；用合適的試驗(yàn)濃度通過(guò)胃毒作用處理黃胸散白蟻，在不同的處理時(shí)間進(jìn)行取樣，測(cè)定3種三萜類化合物對(duì)黃胸散白蟻纖維素酶活性的影響。

1.3.13種三萜類化合物對(duì)黃胸散白蟻的毒殺活性測(cè)定毒殺作用測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[14]的方法，并加以改進(jìn)。將直徑為35 mm的濾紙片，均勻滴加100 μL不同濃度3種化合物丙酮藥液（馬纓丹酸、馬纓丹烯A、馬纓丹烯B濃度均設(shè)為2、1、0.5 mg/mL），使濾紙片中化合物濃度分別為20、10、5 μg/cm2，滴加100 μL丙酮處理的濾紙片為溶劑對(duì)照，滴加清水處理的濾紙片為空白對(duì)照。通風(fēng)櫥內(nèi)放置24 h，待丙酮溶劑揮發(fā)后稱重，用100 μL蒸餾水濕潤(rùn)濾紙片，分別放入6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔接入30頭白蟻，放于人工氣候箱內(nèi)（25℃、相對(duì)濕度98%）黑暗條件下培養(yǎng)。每天統(tǒng)計(jì)存活白蟻數(shù)，10 d后結(jié)束試驗(yàn)，對(duì)濾紙片干燥后稱重，統(tǒng)計(jì)白蟻死亡率。每處理重復(fù)3次。

1.3.2黃胸散白蟻纖維素酶的測(cè)定

①黃胸散白蟻的處理方法

參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。將直徑為35 mm的濾紙片，均勻滴加100 μL不同濃度3種化合物丙酮藥液（馬纓丹酸、馬纓丹烯A、馬纓丹烯B濃度均設(shè)為2、1、0.5 mg/mL），丙酮處理為溶劑對(duì)照。待丙酮溶劑揮發(fā)后稱重，用100 μL蒸餾水濕潤(rùn)濾紙片，分別放入6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔接入50頭白蟻（白蟻處理的培養(yǎng)孔數(shù)根據(jù)試驗(yàn)需要設(shè)定），放于人工氣候箱內(nèi)（25℃、相對(duì)濕度98%）。分別于處理后12、24、36、48、72 h從培養(yǎng)皿內(nèi)取出活蟲進(jìn)行酶活性測(cè)定。

②黃胸散白蟻體內(nèi)纖維素酶粗酶液的提取

參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行測(cè)定。取不同處理的白蟻成年工蟻20 mg，用0.1 mol/L Hac-NaAc緩沖液（SAB，pH 5.6）反復(fù)多次漂洗。然后放入研缽中，分步加入1.0 mL SAB緩沖液（pH 5.6）在冰浴條件下進(jìn)行研磨。4℃、12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，即為反應(yīng)的粗酶液。把提取的粗酶液保存在-20℃冰箱中備用。測(cè)定時(shí)用SAB緩沖液（pH 5.6）稀釋5倍。

③ 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程[15]

配置1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照表1所示進(jìn)行反應(yīng)，以1號(hào)試管反應(yīng)為對(duì)照，在OD540nm下記錄各管吸光值，以所測(cè)吸光值為縱坐標(biāo)、葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

④內(nèi)切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）、β-葡萄糖苷酶（BGL）活性測(cè)定

黃胸散白蟻體內(nèi)纖維素酶測(cè)定方法按照許利霞[16]、張時(shí)妙等[17]的方法，并加以改進(jìn)。

內(nèi)切葡聚糖酶活性測(cè)定：以0.1 mol/L SAB緩沖液（pH 5.6）為溶劑，1%（W/V）羥甲基纖維素（carboxymethylcellulose，CMC-Na）為底物，取950 μL底物與50 μL酶液充分混合，在35℃條件下水浴加熱15 min，加入1.00 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴加熱5 min，水解產(chǎn)生的還原糖通過(guò)微量法進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)酶標(biāo)儀MultiskanMK3（上海賽默飛世爾儀器有限公司）檢測(cè)540 nm下的吸光值，設(shè)3個(gè)重復(fù)。

外切葡聚糖酶活性測(cè)定：以0.1 mol/L SAB緩沖液（pH 5.6）為溶劑，1%（W/V）微晶纖維素（microcrystalline cellulose）溶液為底物，取950 μL底物與50 μL酶液充分混合，在35℃條件下水浴加熱15 min，加入1.00 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴加熱5 min，水解產(chǎn)生的還原糖通過(guò)微量法進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm下的吸光值，設(shè)3個(gè)重復(fù)。

β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定：以0.1 mol/L SAB緩沖液（pH 5.6）為溶劑，0.6%（W/V）水楊酸（salicin）溶液為底物，取950 μL底物與50 μL酶液充分混合，在35℃條件下水浴加熱15 min，加入1.00 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴加熱5 min，水解產(chǎn)生的還原糖通過(guò)微量法進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm下的吸光值，設(shè)3個(gè)重復(fù)。

⑤酶活力單位定義

纖維素酶活力單位定義采用國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定的國(guó)際單位U，即在特定條件下，每分鐘底物產(chǎn)生1 μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）[18]。

酶活（U）=[生成葡萄糖的量（mg）×稀釋倍數(shù)]/[反應(yīng)時(shí)間（min）×0.18 mg/μmol×所用酶量（mL）]。

1.4數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用Microsoft Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖。

2結(jié)果與分析

2.1馬纓丹葉片三萜類化合物對(duì)黃胸散白蟻的毒殺活性測(cè)定結(jié)果

取食不同濃度三萜類化合物處理的濾紙片10 d后，對(duì)黃胸散白蟻都有一定的毒殺作用，均隨著濃度增加毒殺效果增加（圖2）。在最高濃度20 μg/cm2時(shí)，3種化合物對(duì)黃胸散白蟻的毒殺作用相差不大，黃胸散白蟻的死亡率基本都在30%左右。3種化合物不同濃度處理對(duì)白蟻的毒殺效果均顯著高于溶劑（丙酮）對(duì)照和空白（水）對(duì)照處理（P<0.05），而兩對(duì)照間差異不顯著（P>0.05）。馬纓丹酸3種濃度處理間差異不顯著（P>0.05），馬纓丹烯A和B 3個(gè)濃度處理間差異顯著（P<0.05）。

黃胸散白蟻對(duì)3種化合物不同濃度處理濾紙片的消耗量結(jié)果顯示（圖3），較高濃度馬纓丹酸對(duì)黃胸散白蟻有明顯的拒食活性，并且隨著濃度的增加，濾紙消耗量減少，拒食作用增強(qiáng)（P<0.05）；馬纓丹烯A和B對(duì)黃胸散白蟻拒食作用不顯著 （P>0.05）。

2.23種三萜類化合物對(duì)黃胸散白蟻體內(nèi)3種纖維素酶活性的影響

2.2.1馬纓丹酸對(duì)黃胸散白蟻體內(nèi)3種纖維素酶活性的影響不同濃度馬纓丹酸處理12～72 h后，黃胸散白蟻體內(nèi)的EG、CBH、BGL均有不同程度的變化（表2），溶劑對(duì)照和空白對(duì)照均無(wú)顯著差異，從總體來(lái)看，3種酶的活性不同程度受到抑制。馬纓丹酸處理12 h時(shí)，EG活性顯著低于對(duì)照，0.5、1、2 mg/mL處理相較溶劑CK，抑制率分別為1.77%、13.27%和42.48%；處理24 h時(shí)，除2 mg/mL對(duì)EG抑制率降低26.32%外，其他濃度處理酶活性均無(wú)顯著變化；處理36 h時(shí)對(duì)EG活性均具有顯著的抑制作用，0.5、1、2 mg/mL處理的抑制率分別為30.09%、30.09%、25.66%；不同濃度的馬纓丹酸在處理48、60 h對(duì)EG活性均無(wú)顯著影響；72 h時(shí)除0.5 mg/mL顯著降低了酶活性外，其他濃度對(duì)酶活性均無(wú)顯著影響（P> 0.05）。

處理12 h時(shí)，0.5、1 mg/mL馬纓丹酸均能抑制CBH活性，相較溶劑CK，抑制率分別為10.68%和14.53%，但2 mg/mL則有一定的促進(jìn)作用，與對(duì)照差異不顯著；24 h時(shí)3種濃度均提高了CBH活性，1、2 mg/mL處理分別提高了74.62%和77.69%，而0.5 mg/mL對(duì)CBH活性無(wú)顯著影響；處理36、72 h時(shí)不同濃度馬纓丹酸對(duì)CBH活性也表現(xiàn)為促進(jìn)作用，但無(wú)顯著變化；48、60 h時(shí)，除1 mg/mL處理對(duì)CBH活性有顯著抑制作用外，其他濃度對(duì)CBH有一定的促進(jìn)作用，但差異不顯著。

馬纓丹酸對(duì)BGL總體表現(xiàn)為抑制作用，在12、48、72 h對(duì)BGL無(wú)顯著影響。在24 h時(shí)只有2 mg/mL顯著抑制了BGL活性，相較溶劑CK，抑制率為15.67%；36 h時(shí)0.5、1 mg/mL顯著抑制了BGL活性，抑制率分別為13.29%和13.99%。60 h時(shí)只有 0.5 mg/mL處理顯著抑制了BGL活性，抑制率為20.59%。

2.2.2馬纓丹烯B對(duì)黃胸散白蟻體內(nèi)3種纖維素酶活性的影響不同濃度馬纓丹烯B處理白蟻后，對(duì)其體內(nèi)酶活性均有不同程度影響（表3）。0.5 mg/mL馬纓丹烯B對(duì)白蟻體內(nèi)EG在所有時(shí)間內(nèi)與對(duì)照均無(wú)顯著差異（P>0.05）。在12、24、36、60 h時(shí)，只有2 mg/mL處理顯著抑制了EG活性，相較溶劑CK，抑制率分別為38.98%、27.78%、17.50%和26.38%；在48、72 h只有1、2 mg/mL對(duì)EG具有顯著抑制作用，抑制率分別為14.63%、23.58%和37.72%、38.32%。

馬纓丹烯B對(duì)CBH在12 h時(shí)無(wú)顯著影響，但其他時(shí)間有不同抑制作用，且隨著濃度的增加抑制作用增大。24 h時(shí)，0.5、1、2 mg/mL處理對(duì)CBH均有顯著抑制作用，相較丙酮處理，其抑制率分別為6.12%、10.20%和52.86%；36 h時(shí)，其抑制率分別是2.00%、5.99%和6.61%，但0.5 mg/mL對(duì)CBH的影響與對(duì)照差異不顯著。在48 h時(shí)，只有2 mg/mL對(duì)CBH有顯著的抑制作用，抑制率為11.40%。60、72 h時(shí)，1、2 mg/mL對(duì)CBH均有顯著抑制作用，抑制率分別為19.16%、27.42%和39.91%和42.92%。

馬纓丹烯B對(duì)BGL活性的影響也與其他酶相似。12、24、36 h時(shí)，雖然0.5、1、2 mg/mL都對(duì)BGL活性有抑制作用，但只有2 mg/mL處理抑制作用顯著，抑制率分別為30.33%、30.37%和26.09%。48 h時(shí)，1、2 mg/mL對(duì)BGL有顯著的抑制作用，抑制率分別為13.53%和27.65%。60 h時(shí)，0.5、1、2 mg/mL對(duì)BGL均有顯著抑制作用，抑制率分別為13.33%、8.89%和23.70%。72 h時(shí)只有2 mg/mL對(duì)BGL抑制作用顯著，抑制率為19.26%。3討論與結(jié)論

有研究表明，白蟻通過(guò)自身分泌或者體內(nèi)共生物分泌的纖維素酶消化纖維素類食物，并能消化木質(zhì)材料的纖維素達(dá)到74%～99%[19，20]。白蟻體內(nèi)的纖維素酶主要成分是內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶，3種酶在白蟻體內(nèi)的作用部位不同，但都是將木質(zhì)纖維素降解為可以完全被自身吸收利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[21]。孫驪珠等[22]研究表明，馬纓丹不同溶劑提取物對(duì)黃胸散白蟻體內(nèi)纖維素酶活性具有不同程度的抑制作用。本研究結(jié)果表明，馬纓丹葉片中的3種三萜類化合物對(duì)白蟻有一定毒殺作用，能夠抑制其體內(nèi)3種纖維素酶的活性，且隨著濃度的增大抑制作用增強(qiáng)。黃胸散白蟻對(duì)不同濃度化合物處理濾紙片的消耗顯示，較高濃度（20、10 μg/cm2）的馬纓丹酸處理對(duì)黃胸散白蟻具有一定的拒食作用，其他化合物及濃度處理對(duì)白蟻拒食作用差異不顯著。由于對(duì)纖維素酶活性的抑制作用，使得其不能有效分解纖維素而缺乏營(yíng)養(yǎng)，可能是造成白蟻死亡的主要原因。3種三萜類化合物對(duì)白蟻生物活性的其他機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2017-08-09

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303027）； 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CXGC2016B11）

作者簡(jiǎn)介：陳浩（1986—），男，山東乳山人，助理研究員，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)害蟲綜合防治研究。E-mail： cha.active@163.com

通訊作者：于毅（1965—），男，山東寧津人，研究員，主要從事農(nóng)業(yè)害蟲防治研究。E-mail：robertyuyi@163.com

周仙紅（1982—），女，山東威海人，助理研究員，研究方向?yàn)楹οx綜合防治研究。E-mail： zhouxianhong82@163.com