戴建華，孟春春，高 崧，丁 鏟

（1.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225403；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，泰州 225300）

Class I/II新城疫弱毒株誘導SPF雞免疫損傷及黏膜免疫應答的比較分析

戴建華1,2,3，孟春春2，高 崧1，丁 鏟2

（1.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225403；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，泰州 225300）

為了比較Class I新城疫弱毒JS10株和Class II新城疫弱毒La Sota株免疫雛雞后的免疫損傷和黏膜應答情況。本研究將60只SPF白來航雞，隨機分成A、B、C 3組。7日齡時，A組和B組分別用JS10株和La Sota株進行滴鼻、點眼免疫，C組以同樣方式接種PBS，并于免疫后的d1、4、7、14，每組隨機抽取5只撲殺，分別收集唾液、氣管、肺和腸的沖洗液，使用雙夾心ELISA試劑盒測定SIg A、Ig M 和Ig Y的抗體水平。結果顯示，2株病毒均未產(chǎn)生免疫損傷；JS10株產(chǎn)生的黏膜抗體水平均高于La Sota株，并且免疫后的d7、14的唾液、氣管和腸沖洗液中的SIg A的抗體水平以及肺中Ig Y抗體水平均顯著高于La Sota（p＜0.05）。研究表明，2株新城疫弱毒滴鼻、點眼后都能誘導消化道和呼吸道產(chǎn)生強烈的黏膜免疫反應，并且與免疫后的日齡存在明顯相關性。由于JS10株可誘導更好的黏膜免疫應答，提示其可作為新型新城疫弱毒疫苗的候選株。

Class I/II新城疫弱毒；免疫損傷；黏膜免疫；抗體水平

黏膜免疫應答是指動物機體與外界直接或間接相通的腔道（呼吸道、消化道、泌尿生殖道等）黏膜表面的免疫反應，它是機體抵御感染的重要環(huán)節(jié)[1]。黏膜免疫系統(tǒng)（mucosal immune system，MIS）是由黏膜相關的淋巴組織構成的免疫系統(tǒng)，MIS主要是分布在淚道、唾液腺分泌管、呼吸道、胃腸道、乳腺、泌尿生殖道等黏膜內(nèi)的淋巴組織[2,3]。黏膜免疫系統(tǒng)的表面有著十分重要的免疫組織結構與免疫功能，具有明顯的體液和細胞免疫功能，局部抗原刺激即能有效地使黏膜分泌大量的分泌型免疫球蛋白A（SIg A），其可阻止病原微生物在黏膜上皮層定植和繁殖并限制它們進入上皮層[4,5]。

許多禽類傳染性疾病的病原都可通過感染黏膜傳播，如：新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎等[6-8]。因此研制和開發(fā)能夠充分調(diào)動黏膜免疫應答的疫苗，對提高抗感染效果將會有顯著提升。有關新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）誘導的黏膜免疫反應目前的研究還知之甚少，僅局限于楊倩等[9]利用雞新城疫病毒（NDV）弱毒疫苗免疫蛋雞，通過免疫組織化學染色顯示在腸黏膜相關淋巴樣組織（gut associated lymphoid tissue，GALT）和呼吸道黏膜相關淋巴組織（respiratory tract associated lymphoid tissue，BALT）中均檢測到SIg A細胞的生成及分布[9]。馬金萍等[10]報道NDV 弱毒苗滴鼻、點眼后能夠誘導消化道產(chǎn)生共同黏膜免疫反應，并且與日齡存在相關性[10]。由于新城疫弱毒疫苗存在價格低廉、使用方便等滅活疫苗不可比擬的優(yōu)勢，故仍在我國廣泛使用[11-13]。但以上研究都未聚焦于黏膜免疫是否影響NDV弱毒疫苗的保護效果這一最為迫切解決的臨床問題。本實驗室前期在國內(nèi)外首次報道了Class I新城疫弱毒的免疫原性優(yōu)于Class II 新城疫弱毒，具體表現(xiàn)為能夠克服遺傳距離遠的不利因素，對當前流行的Class II 強毒提供更有效的保護和減少免疫雞群感染后的排毒[14]，但其具體機理并不清楚，本文選擇比較Class I/II新城疫弱毒誘導SPF雞黏膜損傷的情況和黏膜免疫應答水平作為研究方向，嘗試從黏膜免疫角度來解釋Class I新城疫弱毒免疫原性良好的確切機制，并為日后綜合評價NDV弱毒疫苗提供新的參考方向。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF種蛋購自北京梅里亞維通有限公司。SPF雞為本實驗室將SPF種蛋自行孵化，出殼后置于隔離器中飼養(yǎng)，期間自由采食和飲水。

1.2 病毒與主要試劑

Class II新城疫弱毒La Sota株均為本實驗室自行保存，9～11日齡SPF雞胚尿囊腔接種進行復壯，并測定EID50，最終統(tǒng)一標定為106EID50/0.1 mL。雞Ig Y、Ig M和Ig A 雙夾心ELISA試劑盒均購自上海艾博抗有限公司。

1.3 實驗設計

1.3.1 黏膜損傷測定 將JS10和La Sota均以106EID50的劑量分別通過滴鼻、點眼的方式感染2只1日齡SPF雞。感染后72 h統(tǒng)一撲殺，采集肺、腸和脾用多聚甲醛固定24～48 h，經(jīng)常規(guī)方法制備石蠟切片，經(jīng)HE染色后光鏡觀察。

1.3.2 黏膜應答測定 選取60只SPF雛雞，隨機分為A、B、C共3組，每組20只。A組和B組分別于7日齡免疫JS10和 La Sota，免疫劑量均為106EID50，免疫方式為滴鼻、點眼。C組為對照組不接種病毒。各組均在免疫后的d1、4、7、14采集檢測樣品，每組抽取5只雞，處死后采集各種黏膜洗脫液（包括唾液、氣管沖洗液、肺沖洗液和回腸沖洗液），-20℃凍存。

1.4 黏膜免疫抗體的測定

操作。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析各試驗組之間的差異性。

參照試劑盒說明書步驟

Class I新城疫弱毒JS10株和

2 結果

2.1 2株弱毒株在SPF雞體內(nèi)增殖比較

為了比較2株弱毒株在SPF雞體內(nèi)是否會引起損傷，我們用病理切片觀察了2株病毒株感染后不同臟器的病理變化差異，見圖1。結果顯示，JS10株和La Sota株感染后與對照組相比其肺臟、腸道和脾臟均無眼觀異常。結果顯示，JS10是1株弱毒株，它不對雞體產(chǎn)生免疫損傷，可作為疫苗候選株。

2.2 唾液中抗體水平測定

圖1 NDV JS10株和La Sota株免疫的SPF雞的主要器官病理切片F(xiàn)ig 1 Histopathology examination of NDV JS10 and La Sota Strain in vaccinated SPF

免疫新城疫弱毒苗后唾液中抗體變化水平，見圖2。免疫后在d1，2個免疫組均檢測不到抗體（SIg A、Ig M和Ig Y），與空白對照C組差異不顯著（P＞0.05）。在免疫后d4，JS10和La Sota免疫組的抗體水平均有上升，與空白對照組相比差異具備顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；抗體水平在免疫后d7比d4有明顯升高（P＜0.05），但到d14時，抗體水平與d7相比變化不大。相同時間段（d7 和d14）比較，JS10免疫組的抗體水平均高于La Sota免疫組，其中SIg A抗體水平差異具備顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但Ig M和Ig Y抗體水平差異不具備顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 氣管沖洗液中抗體水平測定

免疫新城疫弱毒苗后氣管沖洗液中，抗體變化水平，見圖3。在氣管沖洗液中，免疫后d1 2個免疫組均檢測不到抗體（SIg A，Ig M和Ig Y），與空白對照C組差異不具備顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在免疫后d4，JS10和La Sota免疫組的SIg A和Ig M抗體水平顯著上升，與空白對照組相比差異具備顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而抗體Ig Y水平則在免疫后d7才明顯升高，但到d14時三組抗體水平與d7相比均變化不大。相同時間段（d4，d7和d14）比較，JS10免疫組的抗體水平均略高于La Sota免疫組，其中SIg A抗體水平差異具備顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但Ig M和Ig Y抗體水平差異不具備顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 肺沖洗液中抗體水平測定

免疫新城疫弱毒苗后肺沖洗液中抗體變化水平，見圖4。在肺沖洗液中，免疫后d1 2個免疫組均檢測不到抗體（SIg A，Ig M和Ig Y），與空白對照組差異不具備顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在免疫后d4 JS10和La Sota免疫組的抗體水平均有上升，與空白對照組相比差異具備顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?？贵w水平在免疫后d7和d14比d4有明顯升高（P＜0.05）；而d7與d14時抗體水平變化不大，但SIg A和Ig Y的抗體水平呈現(xiàn)出繼續(xù)升高的趨勢，Ig M的抗體水平則比d7有下降趨勢。相同時間段（d7和d14）比較，JS10免疫組的抗體水平均高于La Sota免疫組，其中Ig Y抗體水平差異具備顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但SIg A和Ig M抗體水平差異不具備顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。2.5 腸沖洗液中抗體水平測定 免疫新城疫弱毒苗后腸沖洗液中抗體變化水平見圖5。在腸沖洗液中，免疫后d1 2個免疫組均檢測不到抗體（SIg A，Ig M和Ig Y），與空白對照C組差異不具備顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。直到免疫后d7，JS10和La Sota免疫組的3種抗體水平才均有上升，與空白對照組相比差異具備顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。三種抗體水平在免疫后d7和d14比d4有明顯升高（P＜0.05）；而d7與d14時抗體水平變化不大。相同時間段（d7和d14）比較，JS10免疫組的抗體水平均高于La Sota免疫組，其中SIg A抗體水平差異具備顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但Ig M和Ig Y抗體水平差異不具備顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

前期單獨用La Sota疫苗株通過點眼途徑免疫，來研究雞哈氏腺中Ig A、Ig M、Ig Y型漿細胞的數(shù)量變化及分布特點，結果表明Ig A、Ig M、Ig Y型漿細胞的出現(xiàn)比對照組早，而且數(shù)量多，其中IgA型漿細胞數(shù)量最多[15-17]。馬金萍[10]等人使用自行建立的間接ELISA方法，檢測了La Sota活苗滴鼻、點眼免疫SPF雞，并分別于免疫后不同時間采集消化道洗脫液和膽汁樣品，測定SIg A、Ig M和Ig Y的抗體水平。結果表明NDV 弱毒苗滴鼻、點眼后能夠誘導消化道產(chǎn)生共同黏膜免疫反應，并與免疫后的日齡存在相關性。本研究結果與以上報道類似，而且在消化道粘膜和呼吸道黏膜的洗脫液中都能檢測到3種抗體滴度顯著上升，近一步證實了NDV 弱毒疫苗可以誘導雞體產(chǎn)生大量的黏膜抗體。

圖2 雞唾液中NDV特異性SIg A、Ig M 和Ig Y的變化Fig.2 The changes of NDV specific SIg A, Ig M and Ig Y levels in saliva of chicken at different stage

圖3 雞氣管沖洗液中NDV特異性SIg A、Ig M 和Ig Y的變化Fig.3 The changes of NDV specific SIg A, Ig M and Ig Y levels in trachea of chicken at different stage

圖4 雞肺沖洗液中NDV特異性SIg A、Ig M 和Ig Y的變化Fig.4 The changes of NDV specific SIg A, Ig M and Ig Y levels in lung of chicken at different stage

圖5 雞腸沖洗液中NDV特異性SIg A、Ig M 和Ig Y水平的變化Fig.5 The changes of NDV specific SIg A, IgM and Ig Y levels in intestine of chicken at different stage

IgA 在黏膜免疫中起著重要的作用，Ig A 在黏膜表面以分泌型Ig A（SIg A）為主，它是消化道黏膜免疫的主要效應因子。目前，小腸中Ig A 分泌細胞數(shù)量的變化已成為評價小腸局部黏膜免疫力的標準之一。黏膜免疫抵抗病毒感染主要通過SIg A發(fā)揮作用的，其最大特點是將抗體的反應控制在感染的門戶部位—黏膜局部，當病毒抗原入侵時，SIg A大量分泌并通過SIg A與進入黏膜表面的病毒結合，阻止病毒不與上皮細胞結合引起致病作用，這是作為機體對病毒感染第一道防御屏障，也是最容易清除病毒感染的部位[18-21]。本文研究結果表明，Class I弱毒JS10 株產(chǎn)生的黏膜抗體水平均高于La Sota株，并且在d7和d14的唾液、氣管和腸沖洗液中SIg A的抗體水平以及肺液的Ig Y 抗體水平均顯著高于La Sota（P＜0.05）。這一現(xiàn)象與之前發(fā)現(xiàn)JS10 可以顯著降低免疫雞群在NDV攻毒后的排毒量有較好的吻合性，暗示或許是由于該毒株可以誘導高水平的黏膜免疫能力，故在清除強毒感染時效率更高。

隨著養(yǎng)禽業(yè)的不斷發(fā)展，規(guī)模化、集約化程度不斷提高，禽類的疾病防治問題也越來越突出，除了加強飼養(yǎng)管理，還應該合理使用疫苗。家禽通過疫苗誘導黏膜免疫反應，可以更加有效地防御病原微生物的入侵。因此，在預防一些經(jīng)黏膜途徑感染的病原微生物如禽流感病毒、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒等傳染病時應考慮到黏膜免疫的重要性。具體表現(xiàn)為在開發(fā)新型禽用疫苗的時候應考慮到選育最大限度激發(fā)動物機體黏膜免疫功能的毒株，若黏膜免疫功能被很好地激發(fā)則可以做到減少疫苗的使用劑量和更好地保護免疫動物，從而達到提高控制傳染病的感染效率這一根本目標。

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ANALYSIS OF IMMUNE INJURY AND MUCOSAL RESPONSES INDUCED BY ATTENUATED CLASS I/II NEWCASTLE DISEASE VIRUSES

DAI Jian-hua1,2,3, MENG Chun-chun2, GAO Song1, DING Chan2
(1. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225403, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS,Shanghai 200241, China; 3 Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300, China)

The objective of the present study was to investigate the immunological injury and mucosal response induced by attenuated Newcastle disease virus strains JS10（Class I）and La Sota (Class II). In this experiment, 60 SPF chicks were randomly divided into group A, B and C. At the age of 7 days, chicks in group A and B were respectively immunized with JS10 strain and La Sota strain and chicks in group C

PBS as controls. 5 chicks in each group were randomly terminated at d1, 4, 7 or 14 post immunization. Saliva,trachea, lung and intestinal samples were collected for detection of mucosal antibodies SIg A, Ig M and Ig Y using double sandwich ELISA kits. The results showed that these two NDV strains did not cause any immune injury. The JS10 strain induced higher levels of mucosal antibodies as compared with La Sota strain and significant differences (p＜0.05) were revealed at d 7 and d 14 post immunization.

Newcastle disease virus; immunological injury; mucosal response; antibody lever

2017-10-09

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費項目（2017JB08）；中國農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新工程“水禽病毒病團隊”項目

戴建華，男，博士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

高崧，E-mail:gsong@yzu.edu.cn

S852.659.5

A

1674-6422（2017）06-0037-06