畜禽養(yǎng)殖環(huán)境金黃色葡萄球菌耐藥性及毒力因子分析

寧自林+儲衛(wèi)華

摘要：從江蘇、云南等省8家不同類型的養(yǎng)殖場的排放物及其周邊的水、土壤采樣進行金黃色葡萄球菌的分離，通過紙片擴散法進行藥敏試驗調查金黃色葡萄球菌的耐藥情況，并對其產生主要毒力因子及生物膜形成能力進行測定。結果發(fā)現，從養(yǎng)殖場周圍環(huán)境分離出20株金黃色葡萄球菌，對青霉素、氨芐西林、復方新諾明的耐藥性較高，而對氟本尼考、頭孢唑啉、丁胺卡那這三類藥物的耐藥性較低。表明畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中金黃色葡萄球菌耐藥性嚴重，大部分環(huán)境分離菌株能產生溶血素和胞外蛋白酶，并能夠形成生物膜。這些菌株在自然環(huán)境中的存在，對環(huán)境生態(tài)具有一定的風險，應予以重視。

關鍵詞：畜禽養(yǎng)殖場；金黃色葡萄球菌；耐藥性；毒力因子；生物膜

中圖分類號：X713 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2017）12-0007-03

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到，可以在動物和人類之間交叉感染，是醫(yī)學和獸醫(yī)臨床上最常見的病原[1]。作為革蘭陽性菌的代表，它可引起人和動物的皮膚軟組織感染、敗血癥、心內膜炎、肺炎、腸炎、腦膜炎、骨髓炎和中毒性休克綜合征等疾病[2]。獸醫(yī)臨床上常因養(yǎng)殖場飼養(yǎng)密度過大、通風不良、衛(wèi)生條件差、動物皮膚由于護欄等劃破而感染金黃色葡萄球菌，該病易傳染，不易治愈，給畜禽養(yǎng)殖造成極大的經濟損失。目前，在動物養(yǎng)殖過程中主要通過抗生素來治療。由于金黃色葡萄球菌對抗生素極易產生耐藥性，且其耐藥周期越來越短，因此金黃色葡萄球菌病已成為臨床治療的難題。近年來，由畜禽糞便污染引起的人畜共患病的傳播與感染現象已引起人們對畜禽糞便病原微生物污染的重視。有報道稱，畜禽糞便廢棄物中有多種潛在的致病微生物，如果畜禽糞便不進行無害化處理，直接排放到環(huán)境中，這些致病菌將污染環(huán)境。此外由于畜禽養(yǎng)殖過程中大量使用抗生素，使得動物體內的細菌耐藥菌株數量增加，而耐藥菌株隨著畜禽糞便和污水排放甚至作為農用有機肥料施用，帶有耐藥基因的菌株進入環(huán)境，其抗藥性基因可能通過接合、轉化等重組方式轉移到新的病原菌，這些耐藥菌可能通過“土壤-植物-動物-人”食物鏈的途徑進入人體，將嚴重威脅人類健康。本研究對畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中金黃色葡萄球菌進行分離，并對其耐藥性、毒力因子進行分析，以期為畜禽養(yǎng)殖糞便無害化處理及排放提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

分別于2013年7月至2015年5月對江蘇省南京、南通、鹽城和云南省嵩明縣、曲靖市等8家不同類型的畜禽養(yǎng)殖場排放物及周圍環(huán)境進行采樣，共采集樣品24個（其中排放物樣品、土壤樣品和水樣各8個）。

畜禽排放物樣品：采集養(yǎng)殖場糞便臨時堆積場的糞便，采集糞堆表層（1～20 cm）和中層（20～40 cm）各3個樣混合。

土壤樣品：采集養(yǎng)殖場附近施用過畜禽糞肥的農田，隨機選擇3個點，采集表層土壤（5～10 cm），混合。

水樣：采集離養(yǎng)殖場污水排放口1 km左右的水體，采集距水面10～15 cm深處水樣， 每個樣品采集1 000 mL。

1.2 金黃色葡萄球菌的分離及鑒定

準確稱取10 g土壤/糞便樣本加入到100 mL無菌水帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10 min，使土壤與水充分混合，制備出10-1土壤/糞便懸液。用無菌吸管吸取1 mL土壤/糞便懸液，倍比稀釋到10-2、10-3稀釋度，用移液器分別從10-2、10-3稀釋度試管中各吸取0.1 mL涂布至Baird-Parker培養(yǎng)基上；水樣取100 mL進行過濾，將濾膜直接貼在Baird-Parker培養(yǎng)基，經37 ℃培養(yǎng)48 h培養(yǎng)，挑取可疑菌落用VITEK2 Compact全自動微生物生化鑒定儀作生化鑒定及凝固酶試驗。

1.3 藥敏試驗

采用美國臨床實驗室標準委員會推薦的Kirby-Bauer瓊脂擴散法[3]，選擇醫(yī)療和畜禽養(yǎng)殖最常用的10種抗生素進行藥物敏感性試驗?？股丶埰ê贾菸⑸镌噭┯邢薰荆┓N類及其抗生素含量為：復方新諾明（23.75、1.25 μg/片），環(huán)丙沙星（5 μg/片），諾氟沙星（10 μg/片），青霉素（15 U/片），氨芐西林（10 μg/片），頭孢唑啉（30 μg/片），丁胺卡那（30 μg/片），慶大霉素（10 μg/片），氟苯尼考（30 μg/片），羅紅霉素（15 μg/片），OXOID公司，從瓊脂斜面分別挑取各試驗菌株1～2鉑耳圈接種于營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，用生理鹽水進行適當稀釋至菌含量在105個/mL，吸取0.1 mL加到MH平板上，涂布均勻，貼上藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，測量抑菌圈直徑，按照CLSI標準判斷耐藥性。

1.4 毒力因子檢測

溶血素的檢測：將分離獲得的菌株純培養(yǎng)物接種在含5%綿陽鮮血LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，觀察溶血狀況。

胞外蛋白酶的檢測：將分離獲得的菌株純培養(yǎng)物點種在含1%脫脂奶粉LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，觀察是否形成透明圈。

1.5 生物膜檢測

將獲得的菌株接種到裝有2 mL LB培養(yǎng)基的試管中，37 ℃培養(yǎng)48 h后，將試管中的培養(yǎng)液倒凈，加入3 mL的1%結晶紫溶液，室溫下孵育5 min，將結晶紫溶液倒凈，用PBS沖洗試管3～5 min，將試管倒置在濾紙上去除試管中多余的水分，把試管放在37 ℃烘箱中烘干，觀察記錄[3]。

2 結果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌分離鑒定

從不同類型的畜禽養(yǎng)殖場糞便、施用過畜禽糞便作為肥料的土壤以及水體樣品中共分離出金黃色葡萄球菌20株，在LB平板上形成典型的濕潤且呈黃色的菌落。

2.2 金黃色葡萄球菌耐藥性檢測結果endprint

分離得到的20株金黃色葡萄球菌對10種常用抗菌藥物具有不同程度的耐藥性，對青霉素、氨芐西林、復方新諾明耐藥性較高，對氟苯尼考、頭孢唑啉、丁胺卡那敏感性較高（表1）。

2.3 毒力因子的檢測結果

在5%綿羊血平板上，20株金黃色葡萄球菌環(huán)境分離菌株生長良好，菌落較大，呈圓形、光滑凸起的金黃色菌落，有15株分離菌株的菌落周圍生成完全溶血的透明圈（圖1）。在脫脂奶粉平板上有18株菌株能形成溶蛋白圈（圖2），說明這些菌株都能夠產生溶血素和胞外蛋白酶。

2.4 生物膜檢測結果

在沒有外界因素誘導的條件下，20株環(huán)境分離菌株中共有17株在試管上能形成肉眼可見的生物膜， 有的在試管上形成很厚的生物膜，經結晶紫染色后試管液面部分和底部都留有結晶紫，生物膜形成能力弱的菌株僅在底部可以看到有結晶紫存在，而不能形成生物膜的菌株試管壁上幾乎沒有結晶紫存在（圖3）。

3 討論

隨著畜禽養(yǎng)殖集約化的發(fā)展，抗生素作為禽畜疾病預防及藥物治療、促生長飼料添加劑等被廣泛應用，而抗生素的濫用，導致耐藥菌不斷出現。畜禽養(yǎng)殖場廢棄物如果不經過無害化處理直接排放到自然界，其中的抗生素將可能對土壤和水體造成嚴重的污染，表現為破壞土壤和水體中的菌群結構、打破微生態(tài)平衡并誘導耐藥菌產生，威脅人類健康安全。近年來， 由畜禽糞便污染引起的人畜共患病傳播與感染，已引起人們對畜禽糞便病原微生物污染的重視。

金黃色葡萄球菌在自然界廣泛分布，是人畜皮膚、呼吸道、消化道黏膜上的常見菌群。當機體黏膜和皮膚破損或者抵抗力降低時，可通過損傷的皮膚、黏膜、呼吸道及消化道感染導致發(fā)病。金黃色葡萄球菌是畜禽養(yǎng)殖過程中最為常見的一種化膿性病原菌之一，能夠引起畜禽多種疾病。以斷奶后的仔豬易多發(fā)葡萄球菌病，主要表現為滲出性皮炎。牛常表現為壞疽性乳房炎和傳染性乳房炎。禽在臨床上表現癥狀很多，幼雛和中雛多呈敗血癥、浮腫性皮炎，成年雞則多表現為關節(jié)炎、關節(jié)滑囊炎、腱鞘炎、腳球瘤等，還可見到化膿性骨髓炎、膿性眼炎、心內膜炎等。金黃色葡萄球菌的致病性跟其能否產生毒力因子有關，這些毒力因子能協助金黃色葡萄球菌侵襲組織細胞、逃避機體免疫系統的清除、產生耐藥性等，其主要的毒力因子是胞外毒素和酶以及產生生物膜[4]。金黃色葡萄球菌侵入與產生的胞外蛋白酶有關，而進入機體后產生另外一些毒力因子進一步破壞宿主的組織器官，特別是α溶血素， 能夠引起組織損傷，破壞宿主的免疫系統[5]，本研究發(fā)現，從養(yǎng)殖場糞便及周邊環(huán)境中分離的菌株大部分能產生蛋白酶和溶血素，說明這些菌株具有一定的致病性。對分離菌株進行生物膜形成能力的測定發(fā)現，這些菌株在一定程度上能形成生物膜。生物膜一旦形成便可保護細菌不受傳統抗菌藥物的作用，導致長期的抗生素治療無效。生物膜還可以保護細菌逃離體內的免疫反應，在惡劣的環(huán)境中持續(xù)存活下來[6]。

本研究通過對江蘇和云南不同養(yǎng)殖場環(huán)境中金黃色葡萄球菌的調查，從養(yǎng)殖場的糞便以及周邊的土壤和水體中都能夠分離到金黃色葡萄球菌，通過對分離菌株進行藥物敏感試驗，結果顯示，大部分環(huán)境分離菌株對10種養(yǎng)殖場常用藥物都具有一定程度的耐藥。孫燕萍[7]對來源于畜禽生肉和養(yǎng)殖環(huán)境表面的25株金黃色葡萄球菌進行藥敏試驗，顯示對10種抗生素都有不同程度的耐藥性，對苯唑西林紅霉素、慶大霉素、克林霉素耐藥率大于50%，對復方磺胺敏感。本研究中10株環(huán)境分離株對青霉素、氨芐西林、復方新諾明耐藥性較高，對氟苯尼考、頭孢唑啉、丁胺卡那敏感性較高，該結果可為養(yǎng)殖場的畜禽疾病防治提供指導，為進一步提高畜禽健康，保護人類安全。

畜禽養(yǎng)殖場周圍環(huán)境源性微生物在很長時間被人們忽視，隨著社會大眾對環(huán)境安全認識的不斷提高，環(huán)境源病原菌的危害越來越受到重視。本試驗結果表明，養(yǎng)殖場周邊環(huán)境中的金黃色葡萄球菌的耐藥性以及致病性都很高，其對人和動物的潛在危害不可小覷。需要加強環(huán)境衛(wèi)生管理并積極開展細菌耐藥性監(jiān)測，合理規(guī)范使用抗菌藥物。

參考文獻：

[1] DAHMS C，H？譈BNER N O，WILKE F，et al. Mini-review：Epidemiology and zoonotic potential of multiresistant bacteria and Clostridium difficile in livestock and food[J].GMS Hyg Infect Control，2014（3）：21.

[2] 王江橋，羅 君，蔡 珠，等.金黃色葡萄球菌感染的特征及其耐藥性[J].實用預防醫(yī)學，2007，14（4）：990-992

[3] 賀建忠，陳宏偉，王貴強，等.金黃色葡萄球菌生物被膜形成與生物被膜相關基因的調查研究[J].江蘇農業(yè)科學，2015，43（4）：55-59.

[4] CHEUNG A L，PROJAN S J，GRESHAM H. The genomic aspect of virulence，sepsis，and resistance to killing mechanisms in Staphylococcus ausaur[J].Curr Infect Dis ReP，2002（4）：400-410.

[5] RICHA J，MICHELLE C，JUDY M，et al .Specific roles of alpha-toxin and beta-toxin during Staphylococcus aureus cornea l infection[J].Infect Immun，1997，65（5）：1571-1578.

[6] 黃忠強，韋雪菱.生物膜陽性致病菌對常用消毒劑耐受性研究[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2011，21（16）：3420-3422.

[7] 孫燕萍.對畜禽生肉及養(yǎng)殖環(huán)境表面分離的金黃色葡萄球菌的藥敏分析[J].中國藥物經濟學，2015（3）：178-179.endprint