田云方，葉瑩瑩，吳常文，傅澤欽

（浙江海洋大學海洋科學與技術學院，國家海洋設施養(yǎng)殖工程中心，浙江舟山 316022）

基于線粒體COI基因序列的麗文蛤群體遺傳多樣性和遺傳結構分析

田云方，葉瑩瑩，吳常文，傅澤欽

（浙江海洋大學海洋科學與技術學院，國家海洋設施養(yǎng)殖工程中心，浙江舟山 316022）

為了評估麗文蛤的遺傳多樣性，為麗文蛤的保護與開發(fā)提供基礎遺傳信息，本研究利用線粒體COI基因片段序列比較分析了我國沿海麗文蛤4個地理群體（漳州、珠海、?？诤捅焙＃┑倪z傳多樣性和遺傳結構。4個群體共54個樣本的線粒體COI基因部分序列經(jīng)處理得到長度均為623 bp的核苷酸片段，檢測到19個單倍型。群體遺傳多樣性分析顯示，4個群體的單倍型多樣性為0.464～0.889，核苷酸多樣性為0.000 80～0.011 04。單倍型多樣性較高的是漳州群體和?？谌后w，北海群體單倍型多樣性相對較低。核苷酸多樣性中漳州群體最高，而北海群體同樣顯示最低，北海群體多樣性較低的原因可能是樣本量小。分子變異分析（AMOVA）結果顯示96.20%的變異來自群體內。群體間遺傳分化指數(shù)顯示漳州與珠海和北海群體之間存在較大的遺傳分化（FST值分別為0.162 49和0.117 31），且均達到顯著水平；而漳州與?？谌后w之間遺傳分化小且分化不顯著。珠海、?？诤捅焙Ｈ后w之間遺傳分化小（FST值0.070 99～0.094 30）且分化不顯著。聚類分析和單倍型網(wǎng)絡圖均顯示麗文蛤漳州群體與珠海和北海群體分化明顯，而珠海、?？诤捅焙Ｈ后w之間分化不明顯，其結果與FST值相一致。

麗文蛤；線粒體COI；遺傳多樣性；遺傳結構

麗文蛤Meretrix lusoria屬瓣鰓綱，簾蛤科，文蛤屬，生活在潮間帶和淺海沙質海底。它內含豐富的蛋白質，具有高營養(yǎng)、易養(yǎng)殖的特點，是我國沿海灘涂養(yǎng)殖的主要品種之一。麗文蛤外觀與文蛤極為相似，莊啟謙[1]提出文蛤屬在我國僅有3種，即文蛤M.meretrix、麗文蛤和斧文蛤M.lamarckii。關于文蛤和斧文蛤的研究有很多，但是對于麗文蛤的研究僅限于形態(tài)學[2]及外緣凝集素[3]和貝殼采集[4]的相關研究。而關于麗文蛤遺傳差異的研究僅有陳愛輝等[5]基于線粒體COI基因序列的文蛤屬（軟體動物門：簾蛤科）系統(tǒng)發(fā)育關系。針對于麗文蛤線粒體DNA標記研究麗文蛤的遺傳結構的文章，未有報道。

由于近年來過度捕撈和比較嚴重的海洋污染，文蛤屬各物種的群體多樣性面臨極大挑戰(zhàn)，由于麗文蛤在外形上與文蛤存在著諸多相似，一直被忽視，游離在研究之外，尚未從分子水平加以研究分析。潘寶平等[6]首先利用分子生物學手段對麗文蛤和文蛤、斧文蛤的親緣性進行了研究。陳愛輝等[7]基于線粒體COI基因序列的文蛤屬的系統(tǒng)發(fā)育研究。TORRI，et al[8]中國，韓國和印度的麗文蛤的研究，標明是關于麗文蛤的形態(tài)及遺傳特征的研究，但是文章內容著重研究形態(tài)學及麗文蛤的分類，并沒有采用分子手段對麗文蛤群體遺傳多樣性進行研究。而國內尚未有采用分子手段對麗文蛤的群體多樣性進行研究的報道。

細胞色素C氧化酶亞基I（COI）是線粒體DNA中一個重要基因，基因變異性較大、進化速率比較快，在采用分子手段研究貝類[9-10]和物種群體的遺傳多樣性及結構分析[11-13]等方向應用廣泛。本文采用線粒體COI基因進行標記，對麗文蛤四個不同沿海地理種群的分子遺傳學研究分析，為我國麗文蛤種質資源的研究和麗文蛤及文蛤屬物種多樣性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和DNA提取

本研究所用麗文蛤分別來源于4個地理群體，為廣西北海（BH）、海南?？冢℉K）、廣東珠海（ZH）、福建漳州（ZZ）如圖1。每個地點隨機采樣活體解剖取閉殼肌(表1)，保存于無水乙醇中，用于DNA提取。采用改良鹽析法[14]提取總DNA，利用1%的瓊脂糖電泳進行檢測，無菌超純水稀釋至50 ng/μL備用。

1.2 線粒體COI序列擴增

麗文蛤線粒體COI擴增引物來源于通用引物LCO1490和HCO2198[15]，COI-F 5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'COI-R 5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'PCR反應體系為 25.0 μL，內含 Taq 酶 mix 12.5 μL，正、反向引物各 1.0 μL（10 μmol/L），模板 DNA 1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應程序為 94 ℃預變性為 2 min，94 ℃變性時間為30 s，52℃退火時間為30 s，72℃延伸時間為1 min，35個循環(huán)反應后，72 ℃延伸時間為10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%～2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，PCR產(chǎn)物最后送杭州擎科（杭州擎科梓熙生物技術有限公司）進行雙向測序。

圖1 本研究麗文蛤地理群體采集點地圖Fig.1 Collection locations of M.lusoria geographical populations in this study

表1 麗文蛤4個群體單倍型多樣性及核苷酸多樣性Tab.1 Haplotype diversity and nucleotide diversity of four populations of M.lusoria

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗測序全部采用雙向測序，為了確認樣品分類的準確性，序列結果均在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行Blast對比，統(tǒng)計好單倍型并上傳NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫，并獲得登錄號（表2）。利用Mega版本5.0[16]對獲得的COI序列進行整理編輯，結合人工對編輯結果進行矯正。利用DNASP[17]統(tǒng)計單倍型，計算每個實驗群體的單倍型多樣性（h）和核苷酸多樣性（π）。利用Arlequin 3.5[18]軟件計算群體間及群體內的遺傳分化指數(shù)（FST），并進行P檢驗，通過10 000次重復置換檢驗（Permutation test）分析其顯著性。同時分析群體內和群體間的分子方差（Analysis of Molecular Variance，AMOVA），以10 000次重復抽樣檢驗其顯著性，并進行Fu`s Fs檢驗。利用Network 5.0.0.1以核苷酸進化模型計算各單倍型之間的遺傳距離并構建單倍型網(wǎng)絡圖，利用 Mega 5.0[15]以Kimura 2-parameter模型建立4個群體的Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean（UPGMA）單倍型系統(tǒng)進化樹，抽樣次數(shù)設置為1 000次。

2 結果

2.1 群體內遺傳變異

對4個麗文蛤地理群體的DNA進行PCR擴增，獲得所需的COI基因片段，經(jīng)BLAST比對分析，確認所得片段為麗文蛤COI序列，經(jīng)Mega同源排序，去除部分端部序列，獲得54條623 bp的COI基因片段。序列組成顯示平均 A、T、G、C 堿基含量分別為 A：11.43%、T：41.54%、C：23.92%、G：23.11%。其中 A+T：52.97%、C+G：47.03%。A+T含量大于G+C的含量，具有明顯的堿基組成偏倚性。共檢測出單倍型19個（表2）（登錄號MF285209-MF285227），其中H1被漳州、珠海、?？诤捅焙Ｈ后w共享，H3被漳州和?？谌后w共享，Hap9被珠海和?？谌后w共享。H2、H5、H6、H7、H8為漳州群體特有單倍型，H10-19為海口群體特有單倍型。

麗文蛤4個地理群體的遺傳學參數(shù)見表2，平均單倍型及核苷酸多樣性處于中等水平（h=0.851，π=0.040 01）。單倍型多樣性最高的是漳州群體（h=0.945）和?？谌后w（h=0.917），北海群體單倍型多樣性相對較低（h=0.750）。核苷酸多樣性中漳州群體最高（π=0.179 7），而北海群體核苷酸多樣性顯示最低（π=0.014 7）。北海群體和珠海群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性偏低，這可能是由于樣本量比較小，但是我們不排除樣品本身的原因造成珠海和北海本身麗文蛤的遺傳多樣性低于其他地區(qū)。

2.2 群體遺傳結構研究

用MEGA5.0構建4個群體單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2，系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，單倍型9以下沒有珠海和?？谌后w出現(xiàn)。漳州和?？谌后w大部分群體都聚集在下方，且沒有明顯分化。用Network5.0.1.1構建單倍型網(wǎng)絡圖如圖3，結果顯示單倍型網(wǎng)絡圖右側沒有珠海和北海群體出現(xiàn)，這表明漳州與珠海和北海群體發(fā)生了顯著分化。這與系統(tǒng)發(fā)育樹和FST值結果一致。

麗文蛤4個群體COI序列的分子變異分析（AMOVA）結果見表4，群體間遺傳變異占5.38%，群體內遺傳變異占94.60%，群體內的遺傳變異大于群體間，群體間分化系數(shù)P值小于0.05，達到顯著水平，表明群體間發(fā)生顯著的遺傳分化（P＜0.05）。

表2 單倍型序列比對Tab.2 Sequence comparison of haplotypes

表3 麗文蛤4個群體的COI序列選擇中性檢驗Tab.3 Selective neutrality test analysis of 4 populations of M.lusoria based on COI sequences

圖2 麗文蛤4個群體的單倍型UPGMA系統(tǒng)進化樹Fig.2 Haplotype UPGMA tree of 4 populations of M.lusiria

圖3 麗文蛤4個群體的單倍型網(wǎng)絡圖Fig.3 Haplotype network of 4 populations of M.lusiria

表4 麗文蛤COI序列遺傳差異的分子方差分析（AMOVA）Tab.4 Analysis of molecular variance(AMOVA)of COI gene of M.lusiria

麗文蛤群體間的FST顯著性檢測見表5，兩兩之間的差異數(shù)值介于0.018 16～0.162 49之間，其中珠海群體和漳州群體（FST=0.162 49）（P＜0.05）、北海群體和漳州群體（FST=0.117 31）（P＜0.05），說明珠海群體和漳州群體，北海群體和漳州群體發(fā)生了顯著分化。從地理位置來看，珠海所在地理位置位于珠江三角洲，海洋生物類易于堆積。而北海所在位置與漳州之間隔有陸地，這可能就是阻擋基因交流的重要原因。漳州與?？谥g沒有阻隔，斧文蛤群體以及幼體均可以隨海流和潮流四處移動，基因間交流較大，分化不明顯。中性檢驗結果顯示，平均Fu`s Fs值為-0.501 04（P＞0.05）（表3），F(xiàn)u`s Fs值未達到顯著水平，表明麗文蛤未偏離中性選擇，麗文蛤群體沒有經(jīng)歷過群體擴張。

表5 基于線粒體COI序列的麗文蛤群體遺傳分化Tab.5 Estimates of population genetic differentiation based on COI genefor the M.lusiria

3 討論

線粒體COI基因具有高度的保守性，一般多可以用于物種的多樣性比較。本研究檢測到麗文蛤線粒體COI序列的單倍型多樣性為0.790，核苷酸多樣性為0.007 27，與我國其他海水貝類[19-21]相比，遺傳多樣性不高。這可能與我們實驗樣本量不足引起的，但也有可能我們實驗所采集的樣本中有效群體小、群體之間親本性別比例不平衡等[22]造成，從而導致麗文蛤群體得COI基因序列遺傳多樣性偏低。從單倍型網(wǎng)絡圖來看，各群體單倍型2～10個不等。本實驗研究樣品來源于我國主要的文蛤養(yǎng)殖海域，由于麗文蛤與文蛤在形態(tài)學上難以鑒定，文蛤各群體的養(yǎng)殖規(guī)模大，我們也可以說是麗文蛤養(yǎng)殖規(guī)模比較大。養(yǎng)殖群體的群體遺傳多樣性偏低，放殖到野生環(huán)境中與野生群體想混合生殖，導致野生群體的遺傳多樣性整體偏低。

群體遺傳中的遺傳分化系數(shù)是衡量物種分化的重要指標，本文4個群體麗文蛤群體間的FST為0.053 8（P＜0.05），表明群體間的相似性不大，群體間發(fā)生了顯著分化，而群體內的遺傳變異達到0.946 2（P＜0.05），群體內分化顯著。其中群體間珠海群體和漳州群體（FST=0.162 49）（P＜0.05）、北海群體和漳州群體（FST=0.117 31）（P＜0.05），漳州與珠海和北海群體間分化顯著。某些雙殼類必要時可憑借貝殼的急劇開合和外套膜觸手的作用在海中進行蝶式游泳。大部分水生貝類營底棲生活，或在水底匍匐、爬行，或在底質中挖穴隱居，或附著在其他外物上生活。所以貝類會隨著海流和潮流進行移動[23]，本研究中的四個地理位置中珠海位于珠江三角洲，海洋生物易于堆積，而不易于遷移。北海與漳州之間被海峽阻隔，基因交流不大。相對來說珠海、?？谂c北海之間相距較近，基因交流的機會較大，所以群體間沒有明顯的遺傳分化。漳州與?？谥g雖然相距甚遠但是地理位置間沒有阻隔，隨著海流與潮流，基因交流的可能性較大，因此群體間分化不明顯。實驗所采用的樣品為野生樣品，流動性較大，這可能與野生群體的異地養(yǎng)殖和增殖放流有關。李宏俊等[24]也認為貝類的養(yǎng)殖可能對當?shù)匾吧后w的遺傳結構造成影響。單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，漳州群體和珠海和北海群體發(fā)生了顯著分化，系統(tǒng)發(fā)育樹H9以下沒有珠海和北海群體出現(xiàn)，單倍型網(wǎng)絡圖顯示右側沒有珠海和北海群體出現(xiàn)，表明珠海群體和北海群體與漳州群體發(fā)生明顯的分化，這與地理環(huán)境和海流有關[23]，也可能物種本身經(jīng)過長時間的自身遺傳進化所引起的。

我們衡量物種進化潛力的依據(jù)是分析物種的遺傳多樣性和遺傳結構，通常情況下，遺傳多樣性的高低代表物種適應環(huán)境的能力。本研究表明麗文蛤群體在經(jīng)歷長時間的進化，已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的分化，這表明麗文蛤自身的適應能力在逐步提升。但是由于近年來海洋污染的加劇，海洋生物面臨極大的挑戰(zhàn)，很多物種面臨滅絕的危險。文蛤屬僅有三種貝類，文蛤及斧文蛤的研究明顯對于麗文蛤，麗文蛤的分子研究也一直游離于研究之外，由于麗文蛤與文蛤在外形上極為相似，不易分辨，所以麗文蛤的養(yǎng)殖及野生群體的總體數(shù)量并不是很清楚，這很不利于麗文蛤種資資源的保護與開發(fā)。我們的研究結果將為麗文蛤的深入研究及其開發(fā)保護提供幫助。

4 小結

本文采用4個野生麗文蛤為樣本對麗文蛤的遺傳差異進行線粒體COI分子研究，結果顯示群體間發(fā)生了明顯的分化，群體內分化較為明顯，這可能與文蛤群體的野生異地養(yǎng)殖和增值放流有關，但不排除麗文蛤本身的基因特點。麗文蛤作為文蛤屬其中一種，研究麗文蛤的遺傳差異對文蛤屬的整體物種多樣性具有重要意義。目前關于麗文蛤的研究相對較少，這對其本身的發(fā)展及保護不利。麗文蛤和文蛤相類似，比較容易養(yǎng)殖，而且味道鮮美，所以今后麗文蛤的養(yǎng)殖和野生馴養(yǎng)以及野生群體和養(yǎng)殖群體的差異性比較等都是值得研究的課題。

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Genetic Diversity and Genetic Structure of Meretrix lusoria Population based on Mitochondrial COI Gene Sequences

TIAN Yun-fang,YE Ying-ying,WU Chang-wen,et al
(School of Ocean Science and Technology of Zhejiang Ocean University,National Engineering Research Center For Marine Aquaculture,Zhoushan 316022,China)

In order to evaluate the genetic diversity of Meretrix lusoria,make a contribution to protect and develope the M.lusoria.In this study,the genetic diversity of four geographical populations(Zhangzhou,Zhuhai,Haihou and Beihai)of M.lusoriawas calculated based on the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I(COI)gene sequences.A 623 bp nucleotide fragment was obtained in the 54 individuals in all 4 populations and 19 haplotypes were detected in them.Population genetic diversity analysis showed that the haplotype diversity of each population was 0.464-0.889.Zhangzhou shows the highest haplotype diversity in the four populations,and the haplotype diversity of Beihai is relatively low.This may be caused by a small sample size.Molecular variation analysis(AMOVA)results showed 96.20%variation from within the population.The genetic differentiation indexes between Zhangzhou/Zhuhai and Zhangzhou/Beihai populations showed a large genetic differentiation (FSTvalues is 0.162 49 and 0.117 31,respectively),and reached a significant level.The genetic differentiation between Zhangzhou and Haikou was not significant.The genetic differentiation between Zhuhai/Beihai and Haikou/Beihai populations were not significant.Cluster analysis and haplotype network map showed that the differentiation between Zhangzhou and Zhangzhou populations was significant,while the differentiation among Zhuhai,Haikou and Beihai populations werenot obvious,and the results were consistent with the FSTvalues.

Meretrix lusoria;MT COI;genetic diversity;genetic structure

Q959.215+.4

A

2096-4730(2017)04-0320-06

2017-05-10

浙江海洋大學“水產(chǎn)”省一流學科開放課題（20160002）

田云方（1990-），女，河南上蔡人，碩士研究生，研究方向：海洋生物學.E-mail：xiaotian081215@126.com

葉瑩瑩，研究方向：分子遺傳育種.E-mail：Yeyingying5559@163.com