應(yīng) 震，李紀(jì)元*，殷恒福，范正琪，倪 穗，吳 斌，呂 燾

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400； 2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

紅葉山茶品種花青素苷相關(guān)基因表達(dá)水平及代謝產(chǎn)物分析

應(yīng) 震1，李紀(jì)元1*，殷恒福1，范正琪1，倪 穗2*，吳 斌1，呂 燾2

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400； 2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

目的通過對花青素苷相關(guān)合成基因的表達(dá)水平和代謝產(chǎn)物的分析，系統(tǒng)地闡明‘金華美女’葉色變異與基因表達(dá)的關(guān)系。方法以‘金華美女’為材料，‘貝拉大玫瑰’、杜鵑紅山茶和紅山茶為參照組，使用NCBI Primer Designing Tool設(shè)計(jì)山茶DFR、ANS、LAR、ANR和UFGT基因的熒光定量引物，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀測定這5個(gè)基因在葉片4個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量；采用高效液相色譜儀測定對應(yīng)時(shí)期的多酚合成途徑的主要次生代謝產(chǎn)物(兒茶素、表兒茶素)，以及花青素苷合成途徑的主要代謝產(chǎn)物矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量。結(jié)果表明：(1)在4個(gè)時(shí)期中，紅葉品種葉片中DFR基因表達(dá)量與對照組差異不顯著，ANS、LAR、ANR和UFGT基因在4個(gè)時(shí)期的表達(dá)量與對照組存在顯著差異，這說明‘金華美女’類黃酮代謝途徑相關(guān)基因在表達(dá)水平上發(fā)生了改變；(2)‘金華美女’葉片中多酚含量明顯低于對照組，其中，表兒茶素含量僅為0.040.21 mg·g-1，這說明在生理水平上，‘金華美女’葉片中多酚合成途徑可能受阻；(3)‘金華美女’葉片中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量達(dá)1.21.4 mg·g-1，4個(gè)生長階段均顯著高于對照組，這說明‘金華美女’葉片具備持續(xù)合成花青素苷的能力。結(jié)論根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，推斷‘金華美女’葉色變異的主要原因可能是由于花青素還原酶基因的表達(dá)水平受到了抑制，降低了矢車菊素催化成表兒茶素的效率，使葉片類黃酮代謝途徑中以多酚為主的合成方向轉(zhuǎn)向花青素苷合成方向。

山茶花；花青素苷；多酚；合成途徑；基因表達(dá)量；葉色

‘金華美女’(Camelliajaponica‘Jinhua Meinü’)是山茶(C.japonicaL.)名貴品種‘貝拉大玫瑰’(C.japonicaNuccio’s Bella Rossa)的芽變品種。相比綠色葉片的‘貝拉大玫瑰’， ‘金華美女’葉芽呈紅色，展葉期間的嫩葉呈深紫色，隨著葉片生長，深紫色的葉片顏色逐漸淡化并變?yōu)榧t紫色，待葉片成熟后，呈現(xiàn)暗紅色，該特性使其具有既可觀花也可觀葉的特性，提高了其觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

已有研究表明，花青素苷含量變化是影響植物葉片呈紅色或者紫色最主要的因素。常見的紅葉或紫葉觀賞植物，如紅葉石楠(Photinia×fraseri‘Red robin’)、紅花檵木(Loropetalumchinense(R. Br.) Oliver var.rubrumYieh)、紫色酢漿草(OxaliscorniculataL.)、紫葉李(PrunuscerasiferaEhrh.)等植物的葉片中，都含有較多的花青素苷[1-4]。花青素苷為一種類黃酮化合物，其最初是由苯丙氨酸開始，經(jīng)過一系列復(fù)雜的黃酮代謝途徑形成花青素，再通過UDP類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶催化，與糖類化合物通過糖苷鍵形成穩(wěn)定的花青素苷。目前，花青素苷合成途徑中主要的酶以及對應(yīng)的功能基因在多種植物中均已經(jīng)研究，在花青素苷合成過程中均發(fā)揮重要的作用。在黃洋蔥(AlliumcepaL.)DFR啟動(dòng)子區(qū)域堿基發(fā)生突變后，導(dǎo)致該基因無法正常表達(dá)，使該洋蔥品種表皮從紫色變成黃色[5]。將百子蓮(Agapanthuspraecoxssp.)的DFR基因轉(zhuǎn)化到煙草(NicotianatabacumL.)中，并在煙草中進(jìn)行過量表達(dá)，會(huì)使煙草花色由白色變?yōu)榧t色[6]。在連翹(ForsythiasuspenseL.)轉(zhuǎn)化體系中，只有同時(shí)過量表達(dá)DFR和ANS基因才能夠改變花色(由白色變紅色)[7]。在荔枝(LitchichinensisSonn.)和石榴(PunicagranatumL.)的果皮從青色變?yōu)榧t色的過程中，可以檢測到UFGT基因表達(dá)明顯上調(diào)[8-10]。雖然ANR表達(dá)產(chǎn)物不直接催化花青素苷合成，但也有證據(jù)顯示，該基因的功能與花青素苷合成存在反向調(diào)控的關(guān)系[11-13]。目前，在模式植物的基因功能水平上已經(jīng)對花青素苷合成相關(guān)基因及部分化合物進(jìn)行含量分析，但很少有報(bào)道能夠系統(tǒng)地分析基因表達(dá)水平與生物化學(xué)水平之間的關(guān)系。在經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的紅葉或紫葉觀賞植物葉片變色機(jī)理的研究中，并沒有相關(guān)報(bào)道分析相關(guān)基因與化合物含量變化的關(guān)系。

本研究以‘金華美女’葉片為材料，以綠葉山茶‘貝拉大玫瑰’、杜鵑紅山茶(C.azaleaWei)和紅山茶(C.japonicaL.)原種作為參照，分別測定葉片4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的DFR、ANS、UFGT、LAR和ANR基因的表達(dá)量，以及多酚合成途徑中表兒茶素、花青素苷合成途徑中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在葉片中的含量變化，以期從兩類合成途徑主要產(chǎn)物及相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)量層面揭示紅葉品種變化機(jī)理，為今后開展分子育種，培育彩葉山茶新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

自2015年6月25日起，取3株4年生、健康、長勢一致的‘金華美女’扦插苗，種植于中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所苗圃中，于2016年4月23日起待其葉片由葉芽展開后，取頂端第1片葉后，待第2個(gè)葉芽葉片展開后10 d摘取，待第3個(gè)葉芽葉片展開后20 d摘取，待第4個(gè)葉芽葉片展開后30 d摘取，共4個(gè)時(shí)期，分別標(biāo)記為I、II、III和IV。每個(gè)時(shí)期在3個(gè)同品種不同植株上重復(fù)操作5次。所有樣品采摘后均液氮研磨后-80°C冰箱保存?zhèn)溆?。另取生長環(huán)境相同，同株數(shù)的‘貝拉大玫瑰’、杜鵑紅山茶和1株紅山茶原種作為平行對照。

1.2 研究方法

按照試劑盒(PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit，Takara)進(jìn)行cDNA合成并將得到的cDNA儲(chǔ)存于-20℃下備用。

使用試劑盒(SYBR? Premix Ex TaqTM，Takara)和QuantStudioTM7 Flex熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)；采用QuantStudioTMReal-Time PCR Software軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集；采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 熒光定量引物

1.2.3 兒茶素和表兒茶素含量測定 葉片總多酚提取參考Inomata等[14]的方法。分別將兒茶素和表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(購于ChromaDex公司)用甲醇配置成125、62.5、50、25 μg·mL-14個(gè)濃度的混合標(biāo)品溶液。

色譜流動(dòng)相配置及洗脫方法參考Punyasiri等[15]的方法。

1.2.4 矢車菊素-葡萄糖苷含量測定 采用Kerio等[16]的方法進(jìn)行總花青素苷的提取。分別將矢車菊素-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品配置100、50、25、12.5 μg·mL-14個(gè)濃度，使用島津LC-20液相色譜系統(tǒng)(SPD-20A紫外檢測器；Inertsustain C18色譜柱：150 mm×46 mm，5 μm)測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的矢車菊素-葡萄糖苷濃度，具體色譜流動(dòng)相配置及洗脫方法參考Li等[17]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 DFR表達(dá)量比較

DFR基因功能是催化二氫槲皮素轉(zhuǎn)化為無色矢車菊素，這兩類化合物均為無色。圖1顯示:在葉片生長I期到IV期，‘金華美女’和對照組葉片的DFR基因表達(dá)量隨著葉片生長持續(xù)上調(diào)，在IV時(shí)期該基因平均表達(dá)量約是I時(shí)期的3.4倍，這說明隨著植物葉片生長，類黃酮物質(zhì)合成速度也在逐漸加快。在葉片生長的相同時(shí)期內(nèi)，4種山茶葉片中DFR表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，這說明DFR基因可能不是導(dǎo)致‘金華美女’與對照組葉色差異的關(guān)鍵基因。因此，初步排除了DFR基因?qū)θ~色變異的影響。

圖1 不同展葉時(shí)期DFR基因表達(dá)量Fig.1 The DFR expression level in 4 stages

2.2 ANS表達(dá)量差異比較

圖2顯示：‘金華美女’葉片的ANS基因表達(dá)量與對照組的完全不同，呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，到IV時(shí)期，其表達(dá)量僅為I時(shí)期的20%。方差分析結(jié)果表明：Ⅰ時(shí)期，4種山茶的ANS基因表達(dá)量差異不顯著，而隨著葉片的生長，‘金華美女’與其余3種山茶葉片的ANS表達(dá)量差異極顯著。ANS基因翻譯的蛋白質(zhì)功能催化無色矢車菊素轉(zhuǎn)變?yōu)槭杠嚲账?，在‘金華美女’葉片生長過程中該基因表達(dá)量卻不斷降低，這很可能存在某些因素抑制該基因的表達(dá)。

圖2 不同展葉時(shí)期ANS基因表達(dá)量Fig.2 The ANS expression level in 4 stages

2.3 LAR表達(dá)量的差異比較

圖3顯示：‘金華美女’LAR基因的表達(dá)量隨著葉片的生長而上調(diào)，在IV時(shí)期，表達(dá)量是I時(shí)期的9倍，高于此時(shí)對照組平均表達(dá)量2.57倍。在對照組中，該基因的表達(dá)量隨著葉片的生長呈逐漸降低的趨勢。兒茶素是植物多酚重要的組分，也是LAR基因?qū)?yīng)酶蛋白催化的重要產(chǎn)物，其水或醇溶液呈無色透明，不會(huì)影響植物組織的呈色。圖4顯示：‘金華美女’葉片中兒茶素含量呈逐漸下降趨勢，而對照組葉片中兒茶素含量呈逐漸上升趨勢。該結(jié)果與圖5對應(yīng)的LAR基因表達(dá)量的趨勢相反。雖然相應(yīng)的基因上調(diào)表達(dá)，但兒茶素的底物即無色矢車菊素可能還是主要通過ANS途徑合成矢車菊素，這導(dǎo)致‘金華美女’兒茶素含量出現(xiàn)降低的趨勢，從最初的0.54 mg·g-1降低至0.27 mg·g-1。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，無色矢車菊素因?yàn)橛朽徫涣u基(圖5)[18]，化學(xué)基團(tuán)不穩(wěn)定，更容易生成矢車菊素。這就可能會(huì)導(dǎo)致LAR基因在上調(diào)表達(dá)的情況下，兒茶素含量仍出現(xiàn)降低。該結(jié)果說明‘金華美女’葉片中兒茶素合成基因LAR的生物學(xué)功能受到了抑制，在表達(dá)量上升的情況下，并不能高效地催化合成兒茶素，這很可能是受到其它代謝途徑的競爭。

圖3 不同展葉時(shí)期LAR基因表達(dá)量Fig.3 The LAR expression level in 4 stages

圖4 不同展葉時(shí)期兒茶素含量Fig. 4 The catechin content in 4 stages

圖5 無色矢車菊素代謝途徑Fig.5 The metabolic pathways of leucocyanidin

2.4 ANR表達(dá)量差異比較

圖6顯示：‘金華美女’葉片的ANR基因表達(dá)量與對照組的差異明顯。在‘金華美女’葉片中，該基因的表達(dá)量水平在不同展葉時(shí)期，均明顯低于對照組。盡管‘金華美女’葉片中的ANR表達(dá)量逐漸上升，但在IV時(shí)期僅上升了1.87倍，此時(shí)對照組的ANR平均表達(dá)量仍高于‘金華美女’5.8倍。由圖6也可以看出：ANR基因在對照組內(nèi)保持較高的一致性，這說明該基因在綠色葉片中的表達(dá)非常穩(wěn)定。

圖6 不同展葉時(shí)期ANR基因表達(dá)量Fig.6 The ANR expression level in 4 stages

表兒茶素是ANR基因?qū)?yīng)蛋白催化合成的重要化合物，該物質(zhì)的水溶液和醇溶液均為無色透明溶液，在植物葉片中不會(huì)改變原有葉色。圖7顯示：‘金華美女’葉片中表兒茶素由I時(shí)期的0.21 mg·g-1下降至Ⅳ期的0.04 mg·g-1，含量降低了81%。在同一葉片生長時(shí)期內(nèi)，‘金華美女’葉片中的表兒茶素含量明顯低于對照組。對照組內(nèi)可能由于植株年份以及生長狀態(tài)的關(guān)系，也有較大的差異，但含量則顯著高于‘金華美女’。這說明,一方面葉片中花青素苷合成過程可能消耗了大量表兒茶素的底物，即矢車菊素；另一方面也可能由于合成表兒茶素對應(yīng)的基因或者酶發(fā)生了改變，迫使矢車菊素在葉片中主要的轉(zhuǎn)化途徑發(fā)生改變。

圖7 不同時(shí)期表兒茶素含量Fig.7 The epicatechin content in 4 stages

綜上所述，‘金華美女’葉片中表兒茶素途徑受到了某些因素的強(qiáng)烈抑制，無論是基因表達(dá)水平還是化學(xué)水平，都大大低于對照組。由于ANR基因所在的生物學(xué)途徑距離花青素苷合成途徑很近，因此，該途徑合成能力強(qiáng)弱很可能會(huì)通過花青素積累的方式影響‘金華美女’葉片中花青素苷的合成能力，進(jìn)而影響葉色。

2.5 UFGT表達(dá)量的差異比較

圖8 不同展葉時(shí)期UFGT基因表達(dá)量Fig.8 The UFGT expression level in 4 stages

圖9 不同展葉時(shí)期矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量Fig.9 The cyanidin 3-O-glucoside content in 4 stages

通常山茶屬植物的嫩葉也呈現(xiàn)短期的紅色，這可能也是UFGT基因發(fā)揮作用；而在III和IV時(shí)期，‘金華美女’葉片中UFGT基因表達(dá)量顯著高于對照組葉片，這也反應(yīng)了葉片顏色變化的實(shí)際情況。在III和IV時(shí)期，對照組葉片顏色已經(jīng)呈現(xiàn)綠色，而此時(shí)‘金華美女’葉片仍然呈紅色。因此，通過UFGT基因表達(dá)量變化，可以初步推測該基因的持續(xù)表達(dá)在葉片變紅過程中起重要作用。

3 討論

目前，在植物多酚研究過程中，已確認(rèn)多酚類物質(zhì)主要由兒茶素和表兒茶素合成途徑得到[19]。從目前的類黃酮合成途徑可以推測，多酚含量降低可能會(huì)導(dǎo)致葉片中花青素含量上升，由于花青素含量的上升，又可能會(huì)促使UFGT基因持續(xù)進(jìn)行表達(dá)，以消耗葉片中化學(xué)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的花青素，減少對葉片生理的影響，使葉片積累化學(xué)性質(zhì)更加穩(wěn)定的花青素苷，這就可能改變整個(gè)葉片的顏色。通過與對照組對比可以看出，本試驗(yàn)中，山茶葉片中的ANR基因和UFGT基因在葉片中存在一定的負(fù)相關(guān)性，這與先前對蘋果(MaluspumilaMill.)果皮、葡萄(VitisviniferaL.)果皮和紅掌(AnthuriumandraeanumLinden)葉色變色的研究結(jié)果基本一致[12]。

過去，很少有文獻(xiàn)報(bào)道多酚和植物葉色之間的相關(guān)性。本試驗(yàn)利用紅葉的‘金華美女’與‘貝拉大玫瑰’、杜鵑紅山茶和紅山茶這3種綠葉山茶進(jìn)行比較，分別從花青素苷合成途徑中基因表達(dá)水平和上下游產(chǎn)物的化學(xué)水平對紅葉山茶品種葉色變異現(xiàn)象進(jìn)行了初步解釋，發(fā)現(xiàn)多酚與葉色之間存在明顯的負(fù)相關(guān)性。根據(jù)現(xiàn)有的類黃酮代謝途徑，本試驗(yàn)結(jié)果顯示：‘金華美女’葉色變異很可能是因?yàn)锳NR基因表達(dá)水平受到了明顯的抑制，并影響了矢車菊素轉(zhuǎn)化為表兒茶素的效率，進(jìn)一步改變了類黃酮代謝途徑正常的走向。因此，今后需要從基因結(jié)構(gòu)、下游產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的角度進(jìn)一步探討多酚合成途徑與葉色形成關(guān)系，從根本上解釋‘金華美女’葉色變異產(chǎn)生的原因，這將有助于通過分子育種方式改造山茶屬植物或者其它科屬植物，培育更多的彩葉觀賞植物。

4 結(jié)論

根據(jù)RT-PCR結(jié)果，初步排除DFR基因表達(dá)量與‘金華美女’葉色變異的相關(guān)性。通過對葉片矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量的分析看出，‘金華美女’葉片中含有較多的矢車菊素-葡萄糖苷，這也可以排除ANS基因發(fā)生功能性突變的可能性。若LAR基因發(fā)生突變導(dǎo)致基因功能改變，則上游底物無色矢車菊素會(huì)在葉片積累，這可能會(huì)促使ANS基因持續(xù)高表達(dá)，也可能會(huì)促使DFR基因下調(diào)表達(dá)；同時(shí)該基因下游的兒茶素含量在葉片生長過程中也會(huì)保持較低水平，而在I時(shí)期，‘金華美女’兒茶素含量0.54 mg·g-1，與對照組相差并不大，根據(jù)這些數(shù)據(jù)，可以排除LAR發(fā)生功能性突變的可能性。在I和II 2個(gè)時(shí)期內(nèi)，‘金華美女’和對照組葉片中UFGT基因表達(dá)量的差異不顯著，但在III和IV時(shí)期，‘金華美女’葉片中該基因表達(dá)量明顯高于對照組。通過對矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量測定和葉色的直接觀察，也能看出‘金華美女’葉片中UFGT基因持續(xù)表達(dá)，這說明UFGT基因的功能是正常的，但不能完全排除UFGT相關(guān)調(diào)控基因發(fā)生突變致使無法下調(diào)UFGT基因表達(dá)量的可能性。通過對ANR基因表達(dá)量和表兒茶素含量的分析看出，‘金華美女’葉片ANR基因表達(dá)量以及表兒茶素含量均明顯低于對照組。通常在生物體內(nèi)基因發(fā)生突變的概率比較低，而2個(gè)基因同時(shí)發(fā)生突變，又恰好改變植物葉片顏色的概率更低，考慮到ANR基因所在合成途徑的關(guān)鍵位置以及該基因下游產(chǎn)物的含量，故推斷ANR基因功能發(fā)生改變的概率較大，并影響了下游轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。

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YINGZhen1,LIJi-yuan1,YINHeng-fu1,FANZheng-qi1,NiSui2,WUBin1,LVTao2

(1. Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Hangzhou 311400, Zhejiang, China;2. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, Zhejiang, China)

ObjectiveBy analyzing the quantitative change of structural genes and metabolite of anthocyanin in 4 growth stages, the relationship between leaf-color mutation and gene expression was systematically illustrated.MethodThe leaves ofCamelliajaponica‘Jinhua Meinü’ were selected taking the leaves ofC.japonica‘Nuccio’s Bella Rossa’,C.azalea, andC.japonicaas control. NCBI Primer Designing Tool was used to design the primers and the gene expressing ofDFR,ANS,UFGT,ANRandLARwere analyzed by real-time PCR and measured the contents of catechins, epicatechins and cyanidin 3-O-glucoside by HPLC.Result(1) In the four growth stages, no significant difference was found in the expressing ofDFR, nevertheless, the expressing ofANS,UFGT,ANRandLARbetween red and green cultivar were obviously different, which indicating the express levels of those genes of flavonoids metabolic pathways had been altered in the leaves ofC.japonica‘Jinhua Meinü’. (2) The content of polyphenols in the leaves ofC.japonica‘Jinhua Meinü’ were at a significantly lower level than the control groups, in particular, the content of epicatechins was only 0.04-0.21 mg·g-1, which suggesting the synthetic route of polyphenols were astricted in physiological level. (3) The average content of cyanidin 3-O-glucoside in the leaves ofC.japonica‘Jinhua Meinü’ was 1.2-1.4 mg·g-1, which was at a significantly higher level than the control groups in all the four growth stages. The content of cyanidin 3-O-glucoside could explain the capacity of synthesizing anthocyanins was kept in the leaves of the red cultivar.ConclusionAccording to above data, it can be preliminary inferred that the leaf color ofC.japonica‘Jinhua Meinü’ related to the change of anthocyanins metabolic pathway.

camellia; anthocyanins; polyphenols; synthetic route; gene expressing; leaf color

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.06.022

2017-01-14

國家林業(yè)局引進(jìn)國際先進(jìn)林業(yè)科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(2014-4-16)；浙江省農(nóng)業(yè)(林木)新品種選育重大科技專項(xiàng)(2016C02056-12)；寧波市農(nóng)業(yè)科技專項(xiàng)項(xiàng)目(2014C11002)

應(yīng)震(1985—)，男，浙江湖州人，博士研究生，主要研究方向?yàn)橛^賞植物分子育種.

* 通訊作者：李紀(jì)元，研究員，博士，主要研究方向?yàn)橛^賞植物育種. E-mail：jiyuan_li@126.com； 倪穗，教授，博士，主要研究方向?yàn)橛^賞植物學(xué).E-mail:nisui@nbu.edu.cn

S718.46

A

1001-1498(2017)06-1034-07

金立新)