贛南柑橘木虱體內(nèi)黃龍病菌psy62株系原噬菌體類型多樣性的研究

陳麗芬，徐昭煥，肖麗芳，張麗卿，王建國*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 南昌330045；2.崇義縣農(nóng)業(yè)與糧食局，江西崇義 341300)

贛南柑橘木虱體內(nèi)黃龍病菌psy62株系原噬菌體類型多樣性的研究

陳麗芬1,2，徐昭煥1*，肖麗芳1，張麗卿1，王建國1**

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 南昌330045；2.崇義縣農(nóng)業(yè)與糧食局，江西崇義 341300)

為探明柑橘木虱體內(nèi)黃龍病菌psy62株系中原噬菌體遺傳多樣性及與柑橘株系的遺傳差異，本研究將利用3對引物在psy62基因組中2個噬菌體FP1和FP2的同源序列區(qū)域內(nèi)對贛南地區(qū)陽性樣品進行PCR擴增和測序。結(jié)果顯示,贛南地區(qū)陽性樣品在此基因區(qū)域內(nèi)有28頭柑橘木虱檢測到原噬菌體，共有5種類型，分別為A, A2, B, C, C1。其中A，B的檢測率相對較高；C1檢測率最低，為7.1%。由此可見,在此基因位點不同地理位置的柑橘木虱原噬菌體種群有較大的遺傳差異,且與美國佛羅里達的“Ca.L. asiaticus”株系，中國柑橘葉片“Ca.L. asiaticus”株系均有顯著的遺傳差異，這有助于進一步研究分析原噬菌體的種類差異對柑橘木虱傳毒機制的影響。

柑橘木虱；黃龍病菌；原噬菌體

柑橘黃龍病(HLB)是柑橘生產(chǎn)上的毀滅性病害，可危害各種柑橘類植物，在中國尤其對江西贛州臍橙造成了嚴(yán)重危害(陳麗芬等, 2017)。因此近些來年研究者對贛南地區(qū)黃龍病的發(fā)生、傳播與防治進行了大量的研究，如劉登全等(2012)利用PCR擴增核苷酸序列測定技術(shù)在江西省大余縣柑橘果園檢測到了柑橘黃龍病菌。為了找到防治黃龍病的方法，其后利用椪柑、晚熟溫州蜜柑、琯溪蜜柚三種柑橘品種對黃龍病的抗性情況進行了測試，結(jié)果表明晚熟溫州蜜柑耐病性最強，而椪柑對柑橘黃龍病表現(xiàn)為高度感染(劉登全 等, 2014)。此外,陳慈相等(2015)對贛南地區(qū)柑橘黃龍病發(fā)生規(guī)律進行了研究。隨后盧占軍等(2016)基于SSR標(biāo)記探討了贛南柑橘黃龍病菌的遺傳多樣性,且同年金丹鳳等(2016)、熊大維等(2016)分析了贛南臍橙柑橘黃龍病株內(nèi)共生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)具有多樣性。

原噬菌體為整合于宿主菌基因組中的噬菌體(Boydetal., 2002; 黎庶等, 2009)，其區(qū)域已成為解析黃龍病病原遺傳多樣性及病害流行規(guī)律的重要靶標(biāo)，且其多個高度變異區(qū)域已被應(yīng)用于黃龍病菌種內(nèi)多樣性分析。如注釋為噬菌體阻遏蛋白的基因位點包含多個重復(fù)單元序列，不同地理來源的黃龍病菌株系間的重復(fù)序列重復(fù)數(shù)差異顯著(Chenetal., 2010; 譚錦, 2013)；利用原噬菌體DNA聚合酶基因研究東南亞各國“Ca.L. asiaticus”的變異水平，將所有株系分為5簇(Tomimuraetal., 2009)；利用原噬菌體末端酶基因位點研究發(fā)現(xiàn)黃龍病菌中國株系具有地區(qū)變異性(Liuetal., 2011)。此外，對黃龍病菌UF506株系中兩種環(huán)狀原噬菌體SC1和SC2基因組序列的測定，有助于在原噬菌體基因組上尋找更多的變異位點，這對病原菌遺傳多樣性的研究起到了重要的推動作用(Zhangetal., 2011; Zhouetal., 2011)。

2013年，Zhou等利用美國佛羅里達黃龍病菌psy62株系基因組中FP1和FP2噬菌體同源序列的基因區(qū)域?qū)Ψ鹆_里達株系種群分化進行了進一步的研究，在此區(qū)域中共檢測到9種噬菌體/原噬菌體類型，并且檢測到在寄主植物和介體昆蟲體內(nèi)黃龍病菌含量情況受噬菌體/原噬菌體調(diào)節(jié)。且在之后有研究發(fā)現(xiàn)中國株系的原噬菌體與佛羅里達株系存在顯著差異(Wangetal., 2014) 。但目前國內(nèi)未有對各黃龍病發(fā)生區(qū)感病植物和柑橘木虱體內(nèi)噬菌體/原噬菌體類型差異的詳細(xì)研究(Morganetal., 2012)，而這對于深入研究原噬菌體在介體傳菌中的作用是至關(guān)重要的。本研究將利用黃龍病菌psy62株系基因組中FP1和FP2噬菌體同源序列區(qū)域內(nèi)的基因位點,對中國贛南地區(qū)各柑橘產(chǎn)區(qū)柑橘木虱體內(nèi)“Ca.L. asiaticus”株系中原噬菌體種群分化進行研究,進而探討不同地理來源的黃龍病菌株系原噬菌體的遺傳差異性；及分析柑橘木虱“Ca.L. asiaticus”株系原噬菌體類型與中國柑橘葉片株系是否存在遺傳差異。對“Ca.L. asiaticus”株系中原噬菌體遺傳差異性的研究，有助于加速找到原噬菌體在介體昆蟲-柑橘木虱傳菌過程中所起的作用，這將對揭秘柑橘木虱專性傳播黃龍病有重大意義。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

根據(jù)柑橘種植及黃龍病發(fā)生情況，選擇贛南贛縣、尋烏、于都、定南、瑞金、南康、崇義等多個柑橘產(chǎn)地為采集地點(采集信息見表1)。并于感染黃龍病的柑橘植株葉片上采集柑橘木虱，放入盛有無水乙醇的離心管中，帶回實驗室、鑒定并保存于-20℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1總DNA提取

采用北京天根生化技術(shù)有限公司的基因組用DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)分別提取67頭柑橘木虱樣品的總DNA，利用引物OI1/OI2c對樣品進行PCR檢測以確定攜帶黃龍病菌。

1.2.2黃龍病菌陽性檢測

利用引物OI1/OI2c對已采集到的67頭柑橘木虱樣品進行黃龍病菌陽性檢測(Jagoueixetal., 1994)。PCR采用30 μL體系，包括15 μL Mix, 10.5 μL ddH2O, 5 μmol濃度引物各1.5 μL,1.5 μL DNA模版。反應(yīng)程序見表2。

PCR擴增產(chǎn)物與6× Loading buffer 混勻后在1.2%瓊脂糖凝膠中100 V電泳40 min，凝膠經(jīng)EB染色后，使用UVI凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。

1.2.2柑橘木虱陽性樣品原噬菌體目標(biāo)位點擴增及檢測

本次實驗主要利用原噬菌體通用引物L(fēng)J753/LJ759和兩個設(shè)計的特異性引物對柑橘木虱陽性樣品進行PCR擴增。PCR采用30 μL體系，包括15 μL Mix, 10.5 μL ddH2O, 5 μmol濃度引物各1.5 μL,1.5 μL DNA模版。引物及反應(yīng)程序見表3。

表1 柑橘木虱樣本信息

表2 PCR引物及反應(yīng)程序

表3 PCR引物及反應(yīng)程序

PCR反應(yīng)產(chǎn)物與-20℃保存?zhèn)溆谩CR產(chǎn)物的檢測置于50×TAE的電泳緩沖液中，以1%瓊脂糖凝膠電泳20 min，EB染色后，紫外凝膠成像儀觀察并照相。

1.2.2PCR產(chǎn)物純化、回收，克隆測序

采用生工生物工程(上海)有限公司的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化、回收。回收的PCR產(chǎn)物直接與pGEM-T Easy載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；選3個菌落PCR陽性樣品送生工生物工程(上海)有限公司進行雙向測序。

1.2.3序列分析

將測序返回的序列利用DNAStar軟件包中的SeqMan功能進行拼接比對，并進行適當(dāng)手工調(diào)整。利用Ediseq模塊去除序列兩端引物。用NCBI中的“BLAST”工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov Blast.cgi)在GenBank中搜索關(guān)于佛羅里達黃龍病菌株系和中國地區(qū)柑橘葉片黃龍病菌株系psy62基因組中原噬菌體的同源序列。利用分子進化遺傳分析軟件MEGA進行系統(tǒng)進化分析，采用鄰近法做Bootstrap驗證(重復(fù)1000次)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘木虱樣品黃龍病菌檢測

利用引物OI1/OI2c 對從贛南贛縣、尋烏、于都、定南、瑞金、南康、崇義等7個柑橘產(chǎn)地所采集到的67頭柑橘木虱樣本進行黃龍病菌PCR擴增，共檢測到42頭柑橘木虱體內(nèi)攜帶黃龍病菌(圖1，表4)。

圖1 引物OI1/OI2c對黃龍病的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification with primer sets OI1/OI2c against HLB注：M, DNA Marker；+CK, 陽性對照；-CK, 陰性對照；其他泳道, 不同來源地的樣品。Note:M, DNA ladder marker;+CK, positive control; -CK, negative control;other lanes, samples from Diaphorina citri.

采集點Locality陽性樣品Positivesamples 類型TypeTypeATypeA2TypeBTypeCTypeC1NoType陰性樣品Negativesamples贛州市師范大學(xué)怡豐果園(GZ)GZ-YF1,4GZ-YF9GZ-YF2,3,6,7,8GZ-YF5,10,11尋烏縣文峰鄉(xiāng)(XW)XW-WF5,8,11XW-WF1,2XW-WF3,12XW-WF6XW-WF7,10XW-WF4,9定南縣龍?zhí)伶?zhèn)柏木村(DN)DN-BM2DN-BM7,10DN-BM5,9DN-BM1,3,4,6,8于都縣銀坑鎮(zhèn)洋涇村(YD)YD-YK5,9YD-YK12YD-YK2,13YD-YK7YD-YK1,3,4,6,8,10,11瑞金縣澤覃鄉(xiāng)(RJ)RJ-ZT3RJ-ZT8RJ-ZT2,5,6RJ-ZT1,4,7南康縣赤土畬族鄉(xiāng)青塘村(NK)NK-QT1,4NK-QT3NK-QT6NK-QT2,5崇義縣麟潭鄉(xiāng)華山村CYCY-HS5,7CY-HS2CY-HS1CY-HS3,4,6

2.2 柑橘木虱陽性樣品原噬菌體目的基因PCR擴增

利用通用引物L(fēng)J753/LJ759對42頭柑橘木虱陽性樣品(表4)進行原噬菌體目的基因PCR擴增，實驗結(jié)果顯示,引物L(fēng)J753/LJ759最優(yōu)PCR反應(yīng)體系為：15 μL PCR Mix，1.5 μL DNA模板，5 μmol/L 引物各2 μL，9.5 μL ddH2O；且最佳退火溫度為54℃(表3)。電泳后能檢測到目的條帶(見圖2)但未能得到相對應(yīng)的完整序列。因此利用Primer Premier 5.0并以佛羅里達黃龍病菌psy62株系已有的序列為序列樣本重新設(shè)計引物，新引物為LJ753/LJ49、LJ27/LJ759，運用這兩對引物對柑橘木虱陽性樣品重新PCR擴增，反復(fù)試驗結(jié)果得出兩對引物原噬菌體目的基因的最佳退火溫度分別是45℃，54℃，電泳后不僅能檢測到目的條帶且測序得到了相對應(yīng)的完整序列。

圖2 柑橘木虱原噬菌體PCR擴增的效果電泳圖Fig.2 PCR amplification for prophage of Diaphorina citri

2.3 柑橘木虱黃龍病菌psy62株系中原噬菌體的擴增類型

利用兩對設(shè)計的新引物對已檢測到的柑橘木虱陽性樣品重新PCR擴增檢測及測序，結(jié)果顯示共28頭柑橘木虱陽性樣品(66.7%)可進行擴增測序，測序結(jié)果見表4，表5。測序結(jié)果表明，在江西贛南不同柑橘產(chǎn)地的柑橘木虱樣品在黃龍病菌psy62株系FP1和FP2噬菌體同源序列基因組中共發(fā)現(xiàn)5種噬菌體/原噬菌體類型，分別為A, A2，B, C, C1；且A的檢測率最高，為35.7%(10/28)，其中贛縣2頭、尋烏3頭、定南1頭、于都2頭、南康2頭。B檢測率次之，為25%(7/28)，其中贛縣1頭、尋烏2頭、于都2頭、瑞金1頭、崇義1頭。C1檢測率最低，為7.1%(2/28)，且只在尋烏和瑞金各一頭柑橘木虱陽性樣品中檢測到。A2樣品中的檢測率為17.9%(5/28)，其中尋烏2頭、于都1頭、崇義2頭。且在定南2頭，南康1頭，崇義1頭等柑橘木虱樣品中檢測到C，檢出率為14.3%(4/28)。

表5 柑橘木虱原噬菌體基于高度變異的FP1和FP2噬菌體基因內(nèi)的不同類型及其檢出率

圖3 柑橘木虱與弗羅里達佛羅里達州株系原噬菌體類型基因序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining tree for prophage gene sequences of Diaphorina citri and Florida strains

圖4 柑橘木虱與中國柑橘原噬菌體類型基因序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbor-joining tree for prophage gene sequences of Diaphorina citri and China citrus

2.4 系統(tǒng)進化分析

運用MEGA 5.0軟件，基于Kimura 2-parameter 模型，采用鄰接法，對本研究得到的28條贛南柑橘木虱體內(nèi)黃龍病菌株系中原噬菌體基因序列和在Genbank中下載的佛羅里達州黃龍病菌株系中原噬菌體參考序列(見表6)構(gòu)建相對應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育進化樹(見圖3)。

此次實驗在柑橘木虱體內(nèi)黃龍病菌中未檢測到原噬菌體A1，C2，D，E，這與佛羅里達州株系存在顯著差異。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出贛南地區(qū)柑橘木虱體內(nèi)不同原噬菌體類型之間存在一定的差異性，且同一原噬菌體類型在不同地區(qū)株系間存在較小的差異。但在贛縣、于都、瑞金、崇義、尋烏等不同地區(qū)株系原噬菌體B的同源性存在較大的差異，原噬菌體A2在崇義和尋烏地區(qū)株系間差異性較大。并且進化樹顯示贛南地區(qū)柑橘木虱體內(nèi)原噬菌體A，A2，B，C，C1分別與佛羅里達州株系原噬菌體A，A2，B，C，C1同源性差異不大，其中原噬菌體A和A1、E的同源性也存在較小差異。

在NCBI中Blast搜索中國地區(qū)柑橘葉片“Ca.L. asiaticus”原噬菌體相關(guān)序列，如云南、貴州、四川、廣東、廣西、福建、江西、浙江等地，并下載同源序列，通過鄰接法(NJ)對所有贛南柑橘木虱“Ca.L. asiaticus”原噬菌體序列和下載的同源序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果顯示下載的中國等地柑橘葉片“Ca.L. asiaticus”株系原噬菌體類型均聚在一大枝上，表明不同中國地區(qū)的柑橘葉片原噬菌體的同源性差異不大，但在這一大枝內(nèi)有些小枝的置信度較低，說明中國不同地理來源的柑橘葉片“Ca.L. asiaticus”株系間的原噬菌體還是存在一定的同源性差異。

表6 佛羅里達原噬菌體同源序列信息

續(xù)上表

序號No.類型Typename序列號AccessionNo.長度(bps)Length地點、寄主、菌株P(guān)lace,host,strain參考文獻References6A1JX2754942747佛羅里達州-小長春花,柑橘,柑橘木虱Zhou等,20137A2JX2754952728佛羅里達州-小長春花,柑橘木虱Zhou等,20138C1JX2754962682佛羅里達州-小長春花,柑橘,柑橘木虱Zhou等,20139C2JX2754972703佛羅里達州-小長春花,柑橘,柑橘木虱Zhou等,2013

從進化樹中還可以看出贛南地區(qū)的柑橘木虱陽性樣品中不同原噬菌體類型與中國不同地區(qū)柑橘葉片“Ca.L. asiaticus”株系的同源性均存在差異，且差異性顯著。

3 結(jié)論與討論

原噬菌體遺傳變異程度的研究可為Ca.L. asiaticus 遺傳多樣性提供更多信息(Zhengetal, 2016)。本試驗先利用通用引物L(fēng)J753/LJ759對42頭陽性樣本進行PCR擴增，檢測到3000 bp左右的目的條帶。但由于其片段過長且存在二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致無法得到完整的測序序列，分析也可能是原噬菌體超變異基因區(qū)域的高度變異性所致。于是利用設(shè)計的兩對特異性引物對42頭陽性樣品重新PCR擴增，其中有14頭柑橘木虱陽性樣品未檢測到目的條帶，嘗試調(diào)整設(shè)計引物的PCR擴增程序卻仍未獲得目的條帶，表明這部分柑橘木虱陽性樣品psy62株系中可能不存在FP1和FP2噬菌體相關(guān)的基因序列，亦或者是原噬菌體序列的缺失導(dǎo)致未能檢測到目的條帶。

且PCR擴增測序結(jié)果顯示，在贛南地區(qū)柑橘木虱陽性樣品體內(nèi)黃龍病菌psy62株系基因組中FP1和FP2噬菌體同源序列區(qū)域內(nèi)共發(fā)現(xiàn)5種噬菌體/原噬菌體類型，且不同類型的原噬菌體檢出率略有差異：A檢測率最高，為35.7%，C1檢測率最低，為7.1%。而在佛羅里達州株系共被檢測出9種，且這9種原噬菌體在柑橘葉片株系、柑橘木虱株系中的分布情況與在贛南地區(qū)柑橘木虱體內(nèi)均有所不同(見表6)。進一步的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示在贛南地區(qū)柑橘木虱陽性樣品中不同原噬菌體類型之間存在一定的差異性，不同地區(qū)株系間的同一原噬菌體類型存在較小的差異。同時發(fā)現(xiàn)美國佛羅里達的“Ca.L. asiaticus”株系，中國各地區(qū)柑橘葉片“Ca.L. asiaticus”株系與中國贛南地區(qū)柑橘木虱“Ca.L. asiaticus”株系也均具有顯著差異。

從以上實驗結(jié)論中可以看出不同地理來源的柑橘木虱體內(nèi)“Ca.L. asiaticus”原噬菌體種群有較大的遺傳差異。但由于本實驗中缺乏中國其他地點的柑橘木虱樣品，缺乏一定的說服力，因此很有必要繼續(xù)補充中國其他地點的數(shù)據(jù)及樣品，在豐富數(shù)據(jù)后再進一步比較中國柑橘木虱體內(nèi)“Ca.L. asiaticus”株系中原噬菌體的多樣性與地理環(huán)境條件的關(guān)系，進而更加詳細(xì)的探明柑橘木虱體內(nèi)“Ca.L. asiaticus”噬菌體/原噬菌體的遺傳差異性。當(dāng)然對贛南地區(qū)黃龍病菌中原噬菌體遺傳差異性的研究更加證實了 “美國黃龍病由中國傳入” 的傳言沒有科學(xué)根據(jù)。

此研究結(jié)果也表明了原噬菌體在介體昆蟲體內(nèi)與柑橘葉片株系確實存在差異。如在中國贛南地區(qū)和佛羅里達柑橘木虱陽性樣品中均未檢測到原噬菌體類型D，且發(fā)現(xiàn)原噬菌體D與噬菌體iFP3有關(guān)，而噬菌體iFP3可能就是由FP1和FP2噬菌體重組產(chǎn)生的(Zhouetal., 2013)。由此推測包含類型D的噬菌體iFP3是否是阻止或減少病原菌傳播的關(guān)鍵：如在傳播過程中類型D在介體昆蟲體內(nèi)殺死病菌終止傳播，或是影響昆蟲傳播病菌重要的表達基因、亦或降低黃龍病菌濃度等方式。因此接下來的任務(wù)是要研究黃龍病菌中D原噬菌體為何在傳播介體柑橘木虱體內(nèi)不存在？且D原噬菌體在柑橘木虱傳播病菌過程中到底擔(dān)任了什么角色？這將有助于更進一步的了解柑橘木虱傳播病菌的真正機制。

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AstudyonthediversityofprophagetypesfromCandidatusliberibacterstrainpsy62inDiaphorinacitricollectedfromSouthernJiangxiProvince

CHEN Li-Fen1,2, XU Zhao-Huan1*, XIAO Li-Fang1, ZHANG Li-Qing1,WANG Jian-Guo1**

(1.School of Agriculture Science, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China；2.Agriculture and Grain Bureau of Chongyi, Chongyi 341300, Jiangxi Province,China)

In order to research on the genetic diversity of prophage region fromCandidatusliberibacter strain psy62 inDiaphorinacitri, and the genetic differenty betweenD.citriand citrus strains. For this experiment, using there PCR primers to detect positive samples ofD.citriwere collected from seven locality in Gannan. Initial result indicated that the percentage of type A and type B was relatively high, the percentage of type C was lowest. The study result suggested that different location of prophage inD.citripopulations have larger genetic differences. And “Ca. L. asiaticus” strains of Florida in the United States, Chinese “Ca. L. asiaticus” strains of citrus are all have significant genetic differences to “Ca.L. asiaticus” strains ofD.citriin Gannan. It will further the research and analysis of the influences of the difference prophage species to the toxic mechanism ofD.citri.

Diaphorinacitri;Candidatusliberibacter asiaticus; prophage

陳麗芬，徐昭煥，肖麗芳,等.贛南柑橘木虱體內(nèi)黃龍病菌psy62株系原噬菌體類型多樣性的研究[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報，2017,39(6):1198-1206.

Q968.1;S433.39

A

1674-0858(2017)06-1198-09

國家自然科學(xué)基金(31360457) ; 江西省教育廳科技計劃項目(GJJ150408)

陳麗芬, 女, 1991年生，研究方向為昆蟲學(xué), E-mail: chenlfjx@126.com

*共同第一作者, 徐昭煥, 女, 1984年生， 博士, 講師, 研究方向為昆蟲學(xué), E-mail: hzzhaohuan@163.com

**通訊作者Author for correspondence, E-mail: jgwangjxau@qq.com

Received: 2017-05-15; 接受日期Accepted: 2017-10-22