張思遠(yuǎn)，徐一芩，張錦濤，吳 偉,2*

(1湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003；2黃岡師范學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 黃州 438000)

金銀花露殘液提取物抑菌活性的研究

張思遠(yuǎn)1，徐一芩1，張錦濤1，吳 偉1,2*

(1湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003；2黃岡師范學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 黃州 438000)

以金銀花露生產(chǎn)殘液為材料，經(jīng)超濾膜過(guò)濾處理后，采用NKA-9大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化，再分別用10%和50%乙醇水溶液(V/V)進(jìn)行洗脫，依次得到一定純度的金銀花露殘液提取物綠原酸和粗黃酮。檢測(cè)了2種提取物的抑菌活性，并對(duì)其在濃度、溫度等因素下的抑菌活性進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，金銀花露生產(chǎn)殘液提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，且粗黃酮的抑菌活性強(qiáng)于綠原酸，與常用防腐劑苯甲酸鈉的抑菌作用相比效果明顯；提取物經(jīng)高溫處理后仍具較強(qiáng)的抑菌活性。該研究為金銀花露殘液的綜合回收利用提供了理論依據(jù)。

金銀花露殘液；提取物；抑菌活性

金銀花(Flos lonicerae)為忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera)植物忍冬(Lonicera japonica thunb)及同屬多種植物的干燥花蕾，是一種“藥食同源”的綠色天然產(chǎn)物，為中醫(yī)常用藥，具有清熱解毒、涼風(fēng)散熱、抗病毒、保肝利膽的功能[1]。金銀花中主要含揮發(fā)油類(lèi)、綠原酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、三萜皂苷類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)及無(wú)機(jī)元素。其中黃酮類(lèi)化合物包括木犀草素-3-O-α-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷、忍冬苷、5-羥基-3',4',7-三甲氧基黃酮和紫堇黃酮等[2]。早期研究認(rèn)為綠原酸是金銀花的主要活性成分之一，其含量被作為評(píng)價(jià)金銀花藥材品質(zhì)優(yōu)劣的指標(biāo)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)化合物也是金銀花的有效成分之一，其含量也應(yīng)成為金銀花質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

目前，國(guó)內(nèi)外都在大力開(kāi)發(fā)高效、低毒、廣譜和經(jīng)濟(jì)實(shí)用的防腐劑。從有關(guān)植物中提取有效抑菌、防腐安全性高的活性成分，開(kāi)發(fā)天然防腐劑代替化學(xué)合成防腐劑是當(dāng)今研究熱點(diǎn)之一[3-6]。金銀花中含有豐富的藥用活性成分，主要為綠原酸和黃酮類(lèi)化合物等。湖北省擁有豐富的金銀花資源，但金銀花深加工企業(yè)主要生產(chǎn)金銀花露，而金銀花露殘液作為金銀花飲品加工的副產(chǎn)物之一，多數(shù)都沒(méi)有得到較好地回收及綜合利用，直接被廢棄，勢(shì)必造成了自然資源的極大浪費(fèi)。

大量研究表明，綠原酸和黃酮類(lèi)物質(zhì)均具有一定的抗菌活性[7-9]。本實(shí)驗(yàn)擬采用微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，研究金銀花露殘液提取物的抗菌功效，以及有關(guān)理化因素對(duì)其抗菌活性的影響，闡明其抗菌特性，為金銀花露殘液的回收及綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花露殘液，由湖北楚天舒藥業(yè)有限公司提供。

苯甲酸鈉(分析純)和氯化鈉(分析純)均購(gòu)于天津市凱通化學(xué)試劑有限責(zé)任公司。實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.2 供試菌種

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和啤酒酵母均系湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基32 g，水1 000 mL，加熱溶化，調(diào)pH值為7.4～7.6。

以上培養(yǎng)基分裝三角瓶，均在121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻至50～60 ℃，備用。

1.4 主要儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱，長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；FA1004N型電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.5 金銀花露殘液中藥用成分的分離純化

取金銀花露生產(chǎn)殘液100 mL，過(guò)濾，濾液中加入蒸餾水200 mL，經(jīng)過(guò)超濾膜過(guò)濾處理后得到濾液約300 mL。將濾液pH值調(diào)節(jié)為5后上樣到NKA-9大孔樹(shù)脂，用10%乙醇水溶液(V/V)洗脫，流速為每小時(shí)2柱體積；再用50%乙醇水溶液(V/V)洗脫，流速為每小時(shí)1柱體積，分別收集洗脫液。在65 ℃，0.09 MPa下減壓濃縮至膏狀；在65 ℃，98 kPa下真空干燥，分別得到一定純度的綠原酸和粗黃酮。

1.6 菌懸液的制備

細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，將供試菌種分別接種到裝有對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基的試管內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h。取活化好的菌種斜面，挑取3～4環(huán)菌體或孢子放入裝有50 mL無(wú)菌生理鹽水的小錐形瓶里，充分振搖10 min配制成約(1～10)×106CFU/mL的菌懸液，備用。

1.7 抑菌實(shí)驗(yàn)

將綠原酸和粗黃酮用無(wú)菌水稀釋?zhuān)恳痪昱渲?個(gè)梯度濃度。將不同濃度的試液分別定量加到熱溶解后的瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，制成分別含有綠原酸或粗黃酮0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL和0.10 mg/mL的7個(gè)不同的培養(yǎng)基平皿。在以上培養(yǎng)基平皿中，分別涂布各菌株的菌液，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。并以未加提取物的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，加常用防腐劑苯甲酸鈉溶液(0.1%)的培養(yǎng)基作為陽(yáng)性對(duì)照。觀(guān)察各平皿的菌落生長(zhǎng)情況，確定出綠原酸和粗黃酮的最低抑菌濃度(MIC)。以平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。為保證所測(cè)數(shù)據(jù)的精確性，每種菌做3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。抑菌率(%)=(1-TX/T0)×100%，式中，TX表示各對(duì)應(yīng)綠原酸和粗黃酮濃度的菌落數(shù)，T0表示空白對(duì)照皿的菌落數(shù)。以完全無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度作為金銀花露殘液提取液最低抑菌濃度，由此測(cè)出每種菌種的最低抑菌濃度MIC。

2 結(jié)果與討論

2.1 金銀花露殘液提取物中綠原酸的體外抑菌實(shí)驗(yàn)

綠原酸的體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可看出，金銀花露殘液提取物中綠原酸對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有較強(qiáng)的抑制作用，就釀酒酵母而言，抑制活性與苯甲酸鈉相當(dāng)。綠原酸對(duì)4種菌的抑制活性強(qiáng)弱順序依次為：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母。由此證明，金銀花露殘液提取物中的綠原酸成分，對(duì)于常見(jiàn)的食品污染微生物具有一定的抑菌活性，特別是對(duì)于細(xì)菌的抑菌作用，與常用防腐劑苯甲酸鈉的相比效果明顯。

表1 綠原酸的體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 金銀花露殘液提取物中粗黃酮的體外抑菌實(shí)驗(yàn)

粗黃酮的體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可看出，金銀花露殘液提取物中粗黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有較強(qiáng)的抑制作用，就釀酒酵母而言，抑菌活性略強(qiáng)于苯甲酸鈉。對(duì)比表2與表1的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，粗黃酮對(duì)3種細(xì)菌的抑制活性要強(qiáng)于綠原酸，對(duì)于大腸桿菌，粗黃酮的抑菌活性是綠原酸的2倍，對(duì)于金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為1.6倍，對(duì)于枯草芽孢桿菌表現(xiàn)為1.25倍。 由此證明，金銀花露殘液提取物中的粗黃酮成分，對(duì)于常見(jiàn)的食品污染微生物具有一定的抑菌活性，特別是對(duì)于3種細(xì)菌的抑菌作用，與常用防腐劑苯甲酸鈉相比效果明顯。

表2 粗黃酮的體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 溫度對(duì)金銀花露殘液提取物抑菌活性的影響

以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，不同溫度下處理綠原酸(0.05 mg/mL)和粗黃酮(0.02 mg/mL)一定的時(shí)間，測(cè)定抑菌活性。溫度對(duì)金銀花露殘液提取物抑菌活性的影響見(jiàn)表3。

表3 溫度對(duì)金銀花露殘液提取物抑菌活性的影響

由表3可以看出，金銀花露殘液提取物經(jīng)不同溫度處理后其抑菌活性有一定差異，在未加熱處理時(shí)，抑菌活性最高，說(shuō)明在接近室溫的條件下金銀花露殘液提取物能發(fā)揮較好的抑菌作用。提取物在121 ℃下滅菌20 min后對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制活性增加幅度明顯，但不呈線(xiàn)性關(guān)系。推測(cè)可能是加熱過(guò)程中，不同成分間發(fā)生一系列的化學(xué)反應(yīng)，生成了新的抗菌物質(zhì)，而不同微生物對(duì)這類(lèi)物質(zhì)的耐性有差異。結(jié)果表明金銀花露殘液提取物的抑菌活性物質(zhì)具有較高的熱穩(wěn)定性。

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Study of Antibacterial Activity of Extracts from Lonicera Japonica Thunb Residual Liquid

ZhangSiyuan1,XuYiqin1,ZhangJintao1,WuWei1,2*

(1School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003;2Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization,Huanggang Normal University,Huangzhou Hubei 438000)

Lonicera japonica thunb residue liquid was tested in this study,which was treated with ultrafiltration membrane and then purified with NKA-9 macroporous resin.Elution was carried out with 10% and 50% aqueous ethanol(V/V),respectively,to obtain a certain purity of chlorogenic acid and crude flavonoids.The antibacterial activities of the extract with diferent concentrations and temperature against the four kinds of bacteria were determined.The results showed that the extracts inhibited the growth of Staphylococcus aureus,Escheichia coli,Bacillus subtilis and Saccharomyces cerevisiae eficaciously,and flavonoids were better than chlorogenic acid.The extract was stable when treated at high temperature.This study provides a theoretical basis for the comprehensive recovery and utilization of Lonicera japonica thunb residual liquid.

lonicera japonica thunb residual liquid;extracts;antibacterial activity

2017-05-23

經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)2017BW02)；湖北理工學(xué)院校級(jí)科研重點(diǎn)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)17xjz07A)。

張思遠(yuǎn)，本科生。

*通訊作者：吳偉，副教授，博士，研究方向：生物技術(shù)制藥。

10.3969/j.issn.2095-4565.2017.06.013

Q932

A

2095-4565(2017)06-0057-03

(責(zé)任編輯吳鴻霞)