吳發(fā)帥， 高 楓， 浦飛飛， 邵增務

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科，武漢 430022

長鏈非編碼RNA在骨肉瘤中的研究進展

吳發(fā)帥， 高 楓， 浦飛飛， 邵增務△

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科，武漢 430022

長鏈非編碼RNA； 骨肉瘤； 分子標志物

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是青少年最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，年發(fā)病率為(1～4)/100萬，男女發(fā)病率之比為1.22∶1[1]。骨肉瘤患者預后極差，目前我國骨肉瘤患者的5年生存率為37.5%～77.6%，而治療后復發(fā)、肺部轉(zhuǎn)移的患者，其平均生存時間更是不超過1年[2-3]。因此，為提高骨肉瘤患者的診治率及改善預后，進一步探究骨肉瘤發(fā)病分子機制，找尋新的早期診斷、預后判斷分子標志物及靶向治療位點顯得尤為迫切。

以往，骨肉瘤分子機制研究多集中于蛋白質(zhì)編碼基因，而將非蛋白質(zhì)編碼基因視為“垃圾”序列[4]。來源于非蛋白質(zhì)編碼基因的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度大于200 nt，不具有或僅具有少許蛋白質(zhì)編碼能力的內(nèi)源性RNA序列[5]。近年來研究表明，LncRNA可在染色體修飾、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平等多層面上發(fā)揮調(diào)控作用，廣泛參與腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡及耐藥等生物學過程[6]。因LncRNA所顯露出的抑瘤或致瘤效應，及其在腫瘤的診治及預后判斷中的潛在巨大作用，其已成為繼microRNA后腫瘤研究的新熱點。本文就LncRNA在骨肉瘤中的研究進展作一綜述，旨在為骨肉瘤的進一步研究及提出新的有效的診療策略提供有益指導。

1 LncRNA對骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的影響

Li和Liu等[7-8]運用微矩陣基因芯片技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，較于瘤旁非腫瘤組織，骨肉瘤組織中某些LncRNA表達下調(diào)，另一些LncRNA表達上調(diào)。這些LncRNA可通過多種途徑、機制對骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展起抑制或促進作用。

1.1 LncRNA抑制骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展

截止目前，細胞水平驗證對骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展起抑制作用的LncRNA有：MEG3[9]、TUSC7[10]、HIF2PUT[11]、LOC285194[12]等。Zhou等[9]在HCT116及U2OS細胞中發(fā)現(xiàn)，MEG3主要通過抑制MDM2的表達，使p53蛋白水平增高，促進p53蛋白結(jié)合至GDF15啟動子近端的p53蛋白結(jié)合位點，促進GDF15表達而發(fā)揮抗腫瘤作用。骨肉瘤組織中TUSC7的表達水平降低，降低骨肉瘤細胞中TUSC7的表達，可促進腫瘤細胞增殖與集落形成，抑制細胞凋亡；在裸鼠異種腫瘤移植模型中，TUSC7低表達可顯著促進骨肉瘤的生長[10]。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織、細胞中HIF-2 mRNA表達水平與HIF2PUT表達水平相關(guān)，HIF2PUT可通過HIF-2發(fā)揮骨肉瘤抑制作用，若降低HIF2PUT的表達，骨肉瘤細胞的增殖、侵襲與遷移能力明顯提高，若增加HIF2PUT的表達則得到相反的結(jié)果。LOC285194位于osteo3q13.31位點，Pasic等[12]首先報道osteo3q13.31基因表達水平降低可能是骨肉瘤發(fā)生多步驟過程中的早期事件，但其具體機制還未明確。這些LncRNA對骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的抑制作用，提示我們可以上調(diào)某些LncRNA的表達來作為骨肉瘤的治療策略，但此設(shè)想的具體臨床運用尚需更深入的探究。

1.2 LncRNA促進骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展

1.2.1 LncRNA通過影響基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)節(jié)作用 LncRNA可在表觀遺傳及轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控、影響相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮促瘤作用。例如：ZEB1-AS1可招募p300并結(jié)合至ZEB1基因啟動子區(qū)域，誘導染色質(zhì)結(jié)構(gòu)開放，表觀活化ZEB1基因，促使ZEB1基因轉(zhuǎn)錄，而促進骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展[13]；EWSAT1可通過與HNRNPK(核內(nèi)不均一核糖核蛋白)的相互作用在轉(zhuǎn)錄水平抑制LncRNA MEG63的表達，進而促進骨肉瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。此外，Bida等[15]發(fā)現(xiàn)LncRNA MA-linc1至少可部分通過順式作用抑制鄰近pura基因的表達，促進細胞周期進程。有研究提示PACER可在轉(zhuǎn)錄水平上激活COX-2基因表達而促進骨肉瘤細胞的增殖和遷移[16-17]；還有，陳聲燦等[18]研究表明BCAR4可與GLI2靶基因(包括RPS3、IL-6、MUC5AC、TGF-β1等)的啟動子相互作用，促進基因轉(zhuǎn)錄，使RPS3、IL-6、MUC5AC和TGF-β1等表達水平增高，促進骨肉瘤的進展、轉(zhuǎn)移，若降低BCAR4的表達水平，骨肉瘤細胞的增殖、遷移能力則被抑制。

1.2.2 LncRNA在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用 Fang等[19]發(fā)現(xiàn)高濃度雌炔醇可上調(diào)骨肉瘤細胞中miR-9水平，促進miR-9與MALAT1的相互作用，使MALAT1降解而抑制骨肉瘤發(fā)展，這表明microRNA可通過LncRNA發(fā)揮作用。反之，我們也發(fā)現(xiàn)，有些LncRNA可通過作為競爭性內(nèi)源RNA與microRNA結(jié)合，抑制microRNA活性而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。例如：LncRNA TUG1作為競爭性內(nèi)源RNA與miR-9-5p、miR-335-5p結(jié)合，下調(diào)microRNA的水平，使POU2F1、ROCK1等表達水平升高，促進骨肉瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，抑制凋亡[20-23]；LncRNA PVT1作為競爭性內(nèi)源RNA而調(diào)節(jié)miR-195的水平，影響骨肉瘤細胞的生物學行為[24]。Chan等[25]的研究表明，小鼠成熟成骨細胞中Hedgehog(Hh)信號上調(diào)，可以使Yap1和LncRNA H19表達增高而促進成骨細胞型骨肉瘤的發(fā)生；在進一步研究中，Li等[26]發(fā)現(xiàn)LncRNA H19通過與miR-200家族(包括miR-200a、miR-200b、miR-200c等)的競爭性結(jié)合，造成miR-200水平降低，使miR-200與ZEB1 mRNA、ZEB2 mRNA的3’UTR的作用減弱，ZEB1和ZEB2表達水平增高，促進骨肉瘤轉(zhuǎn)移和侵襲。Taniguchi等[27]應用合成的吡咯咪唑聚酰胺(Myc-6)可部分下調(diào)MALAT1水平而發(fā)揮骨肉瘤抑制作用；Luo等[28]研究揭示，MALAT1能直接與miR376a相互作用，降低miR376a水平，使TGF-α表達增高，促進骨肉瘤進展。

除與microRNA發(fā)生相互作用外，LncRNA還可通過與mRNA直接相互作用及其他多種方式在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。例如：Sun等[29]研究顯示FGFR3-AS1(LncRNA-BX537709)通過與其自然反義轉(zhuǎn)錄本FGFR3 3’UTR的相互作用，增加FGFR3 mRNA的穩(wěn)定性，使FGFR3的含量增高，促進骨肉瘤發(fā)展；SATB2-AS1通過在翻譯水平上影響SATB2基因的表達而促進骨肉瘤細胞的增殖、生長[8]；SPRY4-IT1通過翻譯后修飾調(diào)節(jié)Snail蛋白的穩(wěn)定性而抑制E-cadherin的表達水平，誘導骨肉瘤細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[30]；MALAT1通過與SFPQ的相互作用，使SFPQ與PTBP2的相互作用減弱而影響骨肉瘤細胞的生物學行為[19]。

1.2.3 LncRNA通過影響信號通路發(fā)揮調(diào)控作用信號通路異?？捎绊慙ncRNA表達水平[25]，反之，LncRNA也可通過影響信號通路發(fā)揮腫瘤調(diào)控作用。例如：有研究在細胞水平揭示HNF1A-AS1、HOTTIP可通過激活Wnt/beta-catenin通路而促進骨肉瘤的進展，若降低骨肉瘤細胞中HNF1A-AS1、HOTTIP表達水平可下調(diào)Wnt/beta-catenin通路的活性，發(fā)揮骨肉瘤抑制作用，而應用Wnt/beta-catenin通路激活劑則可逆轉(zhuǎn)HNF1A-AS1、HOTTIP低表達所引起的骨肉瘤抑制效應[31-33]。另外，Cai和Dong等[34-35]的研究分別揭示MALAT1可通過RhOA/ROCK通路和PI3K/Akt通路促進骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展，降低MALAT1水平后，骨肉瘤細胞中RhoA、ROCKs及PCNA、MMP-9、磷酸化的PI3Kp85α、Akt等表達水平均降低。Feng等[20]的研究表明TUG1至少可部分通過Akt通路促進骨肉瘤的發(fā)展。

p53蛋白是多條信號通路中的關(guān)鍵分子，多種LncRNA可通過影響p53蛋白而調(diào)節(jié)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展，例如MEG3[9]、HOTAIR[36]、PANDA[37]等。HOTAIR即HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA，研究表明HOTAIR至少可部分通過調(diào)控p53蛋白而促進骨肉瘤發(fā)生發(fā)展，降低骨肉瘤細胞中HOTAIR表達水平后，TGF-β和Bcl-2表達顯著降低，p53和TNF-α表達水平顯著增高，同時MMP-2和MMP-9的分泌減少[36，38]。還有研究顯示，多柔比星或依托泊甙可造成骨肉瘤細胞DNA損傷并促進PANDA的表達，在DNA損傷情況下，PANDA通過提高p53蛋白穩(wěn)定性而抑制骨肉瘤細胞凋亡，促進細胞生存[37]；而在DNA未受損情況下，PANDA通過抑制P18轉(zhuǎn)錄而促進腫瘤細胞G1-S期的進程，促進骨肉瘤細胞增殖[39]。

1.2.4 其他機制 LncRNA除由上述機制調(diào)控骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展外，還可通過其他機制發(fā)揮作用。例如：Yin等[40]發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中FOXP4表達水平與LncRNA MFI2的表達水平正相關(guān)，MFI2可通過調(diào)節(jié)FOXP4的表達而促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。Ruan等[41]的研究顯示，骨肉瘤中AMOT mRNA表達水平與SNHG12表達水平正相關(guān)，SNHG12能通過上調(diào)骨肉瘤細胞中AMOT基因的表達而促進骨肉瘤細胞的增殖和遷移。Min等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，ANCR在骨肉瘤中起致瘤作用，可以促進骨肉瘤的增殖，降低骨肉瘤細胞中ANCR水平可抑制骨肉瘤細胞的增殖和集落形成，同時骨瘤細胞內(nèi)p21水平增高而CDK2水平降低。由此可見，這些LncRNA的作用機制并未十分清楚，需要進一步闡明。

還有些LncRNA也可促進骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展。Naemura等[43]在非小細胞肺癌、宮頸癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)ANRIL可通過抑制與細胞周期相關(guān)的P15或其他基因的表達而促進腫瘤細胞增殖，而在骨肉瘤中，Wei等[44]研究表明，在缺氧條件下，HIF1-α通過直接結(jié)合ANRIL上游區(qū)域的缺氧反應元件，促進ANRIL的表達，進而促進缺氧骨肉瘤細胞侵襲，抑制凋亡，但ANRIL對骨肉瘤的具體促進機制并不明確。Sun等[45]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織、細胞中HULC水平增高，降低U2OS細胞中HULC的表達可以顯著抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲等生物學行為；Xia等[46]揭示骨肉瘤患者血清及骨肉瘤細胞中LncRNA 91H的水平增高，降低骨肉瘤細胞中91H水平可以抑制骨肉瘤細胞增殖，促進凋亡；Zhou等[47]降低骨肉瘤細胞CCAL的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力；Li等[48]的研究表明，調(diào)高UCA1表達可促進骨肉瘤的進展，而降低UCA1水平則抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲及遷移，促進凋亡；另外，F(xiàn)an等[49]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Oct4可通過調(diào)節(jié)LncRNA AK055347促進骨肉瘤進展，降低Oct4的水平可以使AK055347的水平下降，并抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲，促進凋亡；這些LncRNA對骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的作用機制都有待研究。

2 LncRNA與骨肉瘤化療敏感性

研究顯示，某些LncRNA可影響骨肉瘤對化療藥物的敏感性。Zhu等[50]發(fā)現(xiàn)MG63/DXR細胞系中有些LncRNA表達水平上升，另一些LncRNA表達下降，其中LncRNA EST00000563280(即ODRUL、FOXC2-AS1)表達升高最多，NR-036444表達降低最多。他們預測ODRUL和NR-036444可能通過調(diào)節(jié)MAPK、NF-κB等通路中的某些基因及多種經(jīng)典MDR基因(包括ABCB1、HIF1A、FOXC2等)的表達而影響MG63/DXR細胞對阿霉素的敏感性。隨后，Zhang等[51]的細胞學研究證實，ODRUL可促進ABCB1基因的表達，使p-gp水平增高而增強骨肉瘤細胞對阿霉素耐藥。

Wang等[52]研究發(fā)現(xiàn)，順鉑可使骨肉瘤細胞LINC00161表達增高，并通過LINC00161-miR-645-IFIT2路徑促進骨肉瘤細胞凋亡；在對順鉑耐藥的骨肉瘤細胞系中，LINC00161的表達水平降低，若調(diào)高LINC00161水平則可通過LINC00161-miR-645-IFIT2路徑逆轉(zhuǎn)骨肉瘤對順鉑的耐藥性。Li等[32]發(fā)現(xiàn)，HOTTIP可通過激活wnt/β-catenin通路增強MG63細胞對順鉑的耐藥性；若降低HOTTIP水平，則骨肉瘤細胞對順鉑敏感性增強。

Feldstein等[53]以依托泊甙處理骨肉瘤細胞使DNA損傷，可造成細胞凋亡和LncRNA XLOC006942(即ERIC)表達水平上升；若同時抑制ERIC的水平，則可進一步促進依托泊甙誘導的細胞凋亡，表明ERIC可抑制骨肉瘤細胞對依托泊甙的敏感性。

Bida等[15]的研究表明，LncRNA MA-linc1在促進骨肉瘤細胞周期進程及影響細胞對紫杉醇敏感性中具有作用。紫杉醇是通過抑制M期細胞微管解聚而誘導細胞凋亡的，若降低骨肉瘤細胞中MA-linc1水平，則可使M期腫瘤細胞增多，進而增強骨肉瘤細胞對紫杉醇的敏感性，使骨肉瘤細胞凋亡增加。

Fellenberg等[54]在一項包含35例高度惡性骨肉瘤患者的研究中發(fā)現(xiàn)：與化療反應較好組相比較，化療效應差組的MALAT1平均表達水平升高5.97倍，表明MALAT1水平與患者化療敏感性顯著相關(guān)，但MALAT1影響化療敏感性的具體機制并不明確。

3 LncRNA表達水平與骨肉瘤患者預后的關(guān)系

骨肉瘤惡性程度高，易復發(fā)、轉(zhuǎn)移，預后極差，早期診斷和準確判斷預后有助于疾病的及時、規(guī)范治療，改善臨床結(jié)局，故積極挖掘、尋找合適的早期診斷和預后判斷分子標志物具有重要臨床意義[55]。LncRNA與骨肉瘤患者預后關(guān)系的相關(guān)研究結(jié)果如表1，但是，LncRNA能否作為骨肉瘤早期診斷和預后判斷的分子標記物，還須長期臨床實踐的檢驗。

4 結(jié)語與展望

相對于蛋白編碼基因及miRNA的研究，LncRNA的研究還處于起步階段。截止目前，進行過細胞水平探究且與骨肉瘤密切相關(guān)的LncRNA僅幾十個，其他LncRNA對骨肉瘤的影響及機制還未闡明。在這些已研究的LncRNA中，有些在骨肉瘤中低表達，有些在骨肉瘤中高表達，相關(guān)研究初步揭示了引起LncRNA在骨肉瘤中異常表達的機制以及LncRNA異常表達對骨肉瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡和耐藥性等的影響及作用機制，但更具體的機制還需更深入的研究。上述研究為進一步尋找骨肉瘤的治療方法和逆轉(zhuǎn)骨肉瘤耐藥奠定了理論基礎(chǔ)，但是否可以利用阻斷在骨肉瘤中過表達的LncRNA或者上調(diào)在骨肉瘤中低表達的LncRNA作為潛在的骨肉瘤治療和逆轉(zhuǎn)骨肉瘤耐藥的策略，亦有待更深入的探索。此外，LncRNA能否作為骨肉瘤患者臨床診斷與判斷預后的分子標志物，也需要經(jīng)過長期的臨床實踐檢驗。在研究中，研究者通常獲取骨肉瘤組織來測定LncRNA水平，但在臨床運用中，患者的組織并不容易獲得，因此通過血液、尿液等標本來測定LncRNA水平將值得研究與關(guān)注。

LncRNA保守，但其原始序列所包含的信息少，功能難以預測，序列相差很大的LncRNA可能具有相似的功能，序列相似的LncRNA又可能功能相差很大。另外，同一種LncRNA在骨肉瘤中可能有多種作用機制，不同機制間錯綜復雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系都會給研究帶來巨大困難，探索LncRNA與骨肉瘤的關(guān)系是一項長期而艱巨的任務。隨著生命科學技術(shù)的進步，對LncRNA的認識將越來越深刻，LncRNA在骨肉瘤中的作用機制也將越來越明確，相信在不久的將來，具有細胞和組織特異性的LncRNA將成為一類全新的有效的骨肉瘤新藥治療靶點及診斷和預后判斷的分子標志物。

表1 LncRNA表達水平與骨肉瘤患者預后的關(guān)系Table 1 Associations between LncRNA expression and prognosis of osteosarcoma patients

*：HIF2PUT表達水平與骨肉瘤患者預后的關(guān)系存在矛盾

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吳發(fā)帥，男，1991年生，博士研究生，E-mail：18771036347@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：szwjj@medmail.com.cn

R738.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.022

(2017-02-28 收稿)