楊正久，錢 靜，梁大敏，董紅梅

(遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 醫(yī)學(xué)技術(shù)系，貴州 遵義 563006)

論著

川黨參的基因組DNA提取與ISSR引物篩選

楊正久，錢 靜，梁大敏，董紅梅

(遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 醫(yī)學(xué)技術(shù)系，貴州 遵義 563006)

目的篩選最適黨參基因組DNA的提取方法及ISSR (inter-simple sequence repeat)引物, 為研究黨參種植資源遺傳多樣性及DNA鑒定奠定基礎(chǔ)。方法以黨參嫩葉作為材料，采用常規(guī)SDS法、改良CTAB法和試劑盒法3種提取方法基因組DNA，用優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)對(duì)100條引物進(jìn)行篩選。結(jié)果以黨參嫩葉為材料提取基因組DNA，改良CTAB法效果最佳。從公布的100條ISSR引物中篩選出10條引物，能擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的DNA條帶。結(jié)論以黨參嫩葉為材料提取基因組DNA進(jìn)行ISSR分子標(biāo)志研究遺傳多樣性時(shí)應(yīng)采用改良CTAB法，篩選出合適的引物在ISSR分子標(biāo)志中很重要。

川黨參；DNA提取；ISSR引物篩選

黨參為桔?？泣h參屬植物，產(chǎn)于四川、重慶、貴州、湖北等地，歷史悠久，品種較多，已大量人工栽種，味甘、性平，具有補(bǔ)中益氣、養(yǎng)血補(bǔ)肺、生津和胃及健脾等作用[1-2]。黨參種質(zhì)遺傳多樣性在對(duì)黨參的研究、評(píng)價(jià)、利用及新種質(zhì)的培育中具有十分重要的作用。DNA分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于各類種植資源遺傳多樣性的研究，常見的方法有RAPD(random amplified polymorphic DNA)、SSR(simple sequence repeat)、ISSR (inter-simple sequence repeat)、RFLP(restriction fragment length polymorphism)等，其中ISSR分子標(biāo)記技術(shù)由于具有操作簡單、快速、高效、成本低、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，成為理想的分子標(biāo)記技術(shù)[4-5]。但用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多樣性研究時(shí)，需要提取一定純度及濃度的基因組DNA，且還需對(duì)公開的100條引物進(jìn)行篩選，得到適合黨參ISSR分子標(biāo)記的ISSR引物，才能進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記研究種質(zhì)資源遺傳多樣性。然而用不同的黨參植物組織作為研究材料，其提取DNA的方法、ISSR引物均不一樣，本文以黨參的嫩葉為材料，對(duì)四川、重慶、遵義等地種植川黨參個(gè)體基因組DNA提取方法與ISSR引物篩選進(jìn)行了研究, 為進(jìn)一步從DNA水平揭示其遺傳多樣性奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及來源

本研究所用的實(shí)驗(yàn)材料分別來自四川、重慶、遵義道真縣及湖北等地的種植黨參種子萌發(fā)的嫩葉(表1)。方法為：選取成熟種子，去除破損和雜色籽粒，用38 ℃溫水置于沙堆上進(jìn)行催芽，然后在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，于放有濾紙的培養(yǎng)皿上萌發(fā)，待發(fā)芽至3～5 cm 高時(shí)，取幼苗嫩葉，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)材料及來源

1.2 儀器與試劑

主要儀器：光照培養(yǎng)恒溫箱SPX-250B-G(上海博迅)，GelDocXR+凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)，艾本德普通PCR 儀，VE-180 型電泳槽(上海天能)，EPS-300 型電泳儀(上海天能)，TGL-16G 臺(tái)式離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)。主要試劑：丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、硝酸銀、37%甲醛、TEMED、DNA提取試劑盒來自上海生工生物工程，產(chǎn)品編號(hào)B518231-0050，ISSR 引物采用加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的序列，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.3 黨參基因組DNA的提取

常規(guī)SDS法：取黨參實(shí)驗(yàn)材料200 g充分研磨→加入SDS提取液，2%體積的巰基乙醇，2 mL 10%的SDS，于65 ℃水浴20 min→加入等體積的飽和酚/氯仿/異戊醇(v/v/v=25/24/1)混勻并離心(12000 r/min)10 min→取上清加入等體積氯仿/異戊醇(v/v=24/1)混勻并離心(12000 r/min)10 min→去上層水相加入2倍體積的沉淀液，室溫孵育30 min，12000 r/min離心15 min→70%乙醇洗滌2次→加入100 μL 1×TE液溶解DNA→4 ℃保存。

改良CTAB法[6-7]：取黨參實(shí)驗(yàn)材料200 g于預(yù)冷的研缽中研磨成粉直至 “發(fā)白”→置于65 ℃的CTAB提取液保溫45 min→室溫下用氯仿/異戊醇(v/v=24/1)萃取，10000 r/min離心10 min(重復(fù)2次) →上清液用0.6倍體積的異戊醇于冰中靜置30 min→8000 r/min(4 ℃)離心10 min，70%乙醇洗滌2次→加入500 μL 1×TE液溶解DNA→加入5 μL RNAase酶于37 ℃溫育30 min去除RNA→70%乙醇洗滌2次→100 μL 1×TE液溶解→4 ℃保存。

試劑盒法：取黨參實(shí)驗(yàn)材料200 g充分研磨后，按試劑盒說明書進(jìn)行提取。

提取后的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳測定其純度，分光光度計(jì)測定其濃度，將提取的DNA稀釋到終濃度40 ng/μL，用作PCR擴(kuò)增的模板進(jìn)行ISSR引物篩選。

1.4 ISSR引物的篩選與檢測

選用提取的黨參基因組DNA為模板，采用優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行ISSR引物篩選。優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系的總體積為20 μL：模板DNA 1 μL(約40 ng)，ISSR引物1 μL(約5 pmol)，PCRmix 18 μL。PCR上機(jī)擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 ℃5 min預(yù)變性，94 ℃循環(huán)1 min，56 ℃退火 45 s， 72 ℃延伸 1 min，共35輪循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，72 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR結(jié)束后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測采用取非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，取擴(kuò)增產(chǎn)物4 μL 進(jìn)行電泳分離，以0.5×TBE 為緩沖液，穩(wěn)壓150 V，電泳至溴酚藍(lán)距凝膠邊緣2～3 cm處結(jié)束，最后進(jìn)行銀染法染色，照相及觀察讀帶。

2 結(jié) 果

2.1 黨參基因組DNA的提取

以黨參鮮嫩葉片為材料，采用了傳統(tǒng)SDS 法、改良CTAB 法和試劑盒法3種方法提取黨參的基因組DNA ，經(jīng)凝膠電泳檢測其純度，如圖1。泳道1～6、7～12與13～18依次為材料1、3、5、6、8、10(表1)提取的基因組DNA，結(jié)果表明3種方法所提的DNA 純度都較好，各點(diǎn)樣孔及泳道都很干凈，DNA無雜帶，且DNA完整性好，無降解，DNA條帶亮度與其含量有關(guān)，3種方法中，改良CTAB 法電泳條帶最亮，試劑盒法次之，傳統(tǒng)SDS法亮度最小(見圖1)，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測其濃度，傳統(tǒng)SDS 法提取的DNA平均濃度為0.83 μg/mL，改良CTAB 法提取的DNA平均濃度為4.21 μg/mL，試劑盒法提取的DNA平均濃度為2.24 μg/mL，3種方法提取基因組DNA的OD 260/280均在1.67左右。說明3種方法提取川黨參基因組DNA的純度均很高，但改良CTAB 法提取DNA的效率最高，符合ISSR研究要求?？梢娨渣h參鮮嫩葉片為材料，采用傳統(tǒng)SDS 法、改良CTAB 法和試劑盒法3種方法提取基因組DNA時(shí)，改良CTAB 法最好。

M: BM5000 DNA Marker; 1～6為常規(guī)SDS法，7～12為改良CTAB法，13～18為試劑盒法圖1 基因組DNA提取電泳檢測結(jié)果Fig 1 The result of genomic DNA detected by electrophoresis

2.2 ISSR引物的篩選

以改良CTAB法提取的兩個(gè)黨參基因組DNA為模板，從100條引物中初步篩選出10條擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的引物。見表2。

2.3 對(duì)所選引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)

利用篩選出10 條引物和經(jīng)優(yōu)化的PCR優(yōu)化體系對(duì)來自四川、重慶、湖北及遵義道真縣的12個(gè)川黨參樣品進(jìn)行擴(kuò)增檢驗(yàn)，所有引物擴(kuò)增出的DNA條帶清晰、重復(fù)性高、多態(tài)性豐富，具體擴(kuò)增結(jié)果見表3。10條引物共擴(kuò)增出136個(gè)清晰且能區(qū)分的DNA條帶，平均每條引物擴(kuò)增出13.6個(gè)DNA條帶；多態(tài)性條帶共有114個(gè)，每條引物平均擴(kuò)增多態(tài)性條帶為11.4個(gè)，占比率為83.82%；其中引物UBC811擴(kuò)增的條帶數(shù)及多態(tài)性條帶數(shù)較為豐富(圖2)，DNA總條帶數(shù)為19個(gè)，多態(tài)性條帶數(shù)為16個(gè)。

表2篩選出的ISSR引物及退火溫度

Tab 2 Sequence of the selected ISSR primers and annealing temperature

引物編號(hào)引物序(5'-3')退火溫度(℃)*UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGT50UBC809AGAGAGAGAGAGAGAGG52UBC811GAGAGAGAGAGAGAGAC54UBC816CACACACACACACACAT50UBC825ACACACACACACACACT50UBC826ACACACACACACACACC52UBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYT52UBC835AGAGAGAGAGAGAGAGCC56UBC836AGAGAGAGAGAGAGAG-CA56UBC881GGGTGGGGTGGGGTG54

*：理論退火溫度Ta=Tm = 4 ℃(G+C)+ 2 ℃(A+T)

3 討 論

分子標(biāo)記技術(shù)已飛速發(fā)展，并被廣泛地應(yīng)用于動(dòng)植物的種植資源的鑒定及遺傳多樣性的研究。藥用植物的遺傳多樣性涵蓋了種內(nèi)所有個(gè)體全部的基因和變異的總和，其研究是鑒定藥用植物種質(zhì)、評(píng)估基因資源的開發(fā)、研究優(yōu)良藥用形狀、藥用植物的引種栽培及資源保護(hù)提供理論依據(jù)與信息[11]。而黨參大面積的種植通常采用種子和種根兩種繁殖方式，零星種植也常采用野生種及半野生種的馴化栽培，導(dǎo)致黨參種源復(fù)雜，遺傳多樣性豐富；但受到地理位置的阻隔，基因流動(dòng)也受到一定的限制。目前有關(guān)于川黨參的種植資源遺傳多樣性研究報(bào)道不多，因此黨參種植資源遺傳多樣性的研究與基因資源的保護(hù)與利用刻不容緩。

表3 引物擴(kuò)增檢驗(yàn)結(jié)果

M: BM5000 DNA Marker;1～12:1～12號(hào)材料圖2 引物UBC811擴(kuò)增結(jié)果Fig 2 Amplification results with primer UBC811

ISSR標(biāo)記根據(jù)生物廣泛存在SSR的特點(diǎn)，利用在生物基因組常出現(xiàn)的SSR本身設(shè)計(jì)引物，無需預(yù)先克隆和測序。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有檢測性靈敏、多態(tài)性豐富、反應(yīng)體系穩(wěn)定、結(jié)果可靠、成本低、操作簡單、快速及所需模板量少等特點(diǎn)[12]，而成為理想的分子標(biāo)記技術(shù)。但是ISSR分子標(biāo)記技術(shù)除了對(duì)模板DNA的濃度和純度有一定的要求外，其選用的引物和PCR反應(yīng)體系及條件也必需符合其擴(kuò)增要求，加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的ISSR-PCR引物序列共有100條，并不是每條引物都適用所用的物種，且不同引物所要求的PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件也不一樣，因此針對(duì)特定的物種，篩選出合適的引物和優(yōu)化ISSR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件就顯得尤為重要。

目前用于基因組DNA的提取方法主要有傳統(tǒng)SDS 法、改良CTAB 法和試劑盒法。這3種方法中，雖然試劑盒法具有快速高效等優(yōu)點(diǎn)而深受歡迎，但是由于成本較高，通常在實(shí)驗(yàn)室里首選的還是前兩種方法。SDS法和CTAB法均是20世紀(jì)80年代后發(fā)展起來的DNA提取技術(shù)[8-9]，經(jīng)過30多年的發(fā)展在技術(shù)上得到了不斷的改進(jìn)，但更多是對(duì)提取液的配比進(jìn)行調(diào)整，形成了各種針對(duì)不同物種不同配比的獨(dú)特優(yōu)化提取體系[10]。本研究表明，采用傳統(tǒng)SDS 法、改良CTAB 法和試劑盒法均能從供試黨參嫩葉材料中提取到純度較高的基因組DNA，但是傳統(tǒng)SDS 法提取DNA得率較低，這從電泳圖譜上可以看出，其電泳帶較淡，而改良CTAB 法和試劑盒法提取的DNA電泳帶較亮，表明這兩種方法提取DNA的得率均較高。另外值得一提的是本文中所采用的試劑盒法提取的黨參基因組DNA在瓊脂糖電泳中，總是存在拖尾現(xiàn)象(圖1)，可能是本研究中購買的試劑盒原因所導(dǎo)致。綜合起來，本研究中以黨參嫩葉為材料提取基因組DNA時(shí)，采用改良CTAB 法提取效果最佳。

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GenomicDNAextractingandISSRprimerscreeningofCodonopsistangshen

YANG Zhengjiu, QIAN Jing, LIANG Damin, DONG Hongmei

(DepartmentofMedicalTechnology,ZunyiMedicalandPharmaceuticalCollege,Zunyi563006,China)

ObjectiveIn order to study the genetic diversity and DNA identification of Codonopsis pilosula , DNA extracting methods and primers screening were explored.MethodsThe genomic DNA was extracted from the young leaves using the traditional SDS method, modified CTAB method and DNA isolation kit. The optimized ISSR-PCR reaction was used to screen 100 primers.ResultsThe modified CTAB method was better in extracting genomic DNA from the young leaves. Ten primers were selected to amplify the DNA bands with clear, stable and high polymorphism after screening 100 ISSR primers.ConclusionThe modified CTAB method and ten primers selected could be used in the study of genetic diversity by ISSR molecular markers.

Codonopsis tangshen; DNA extracting; ISSR primer screening

遵義市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(遵義市科合社字[2013]16號(hào))

楊正久 (1975-)，男，副教授。E -mail: yang282@163.com

10.11724/jdmu.2017.06.04

Q7

A

1671-7295(2017)06-0536-04

楊正久，錢靜，梁大敏，等.川黨參的基因組DNA提取與ISSR引物篩選[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,39(6)：536-539，543.

2017-09-12;

2017-11-13)