胡曉薇+田原+喬夢(mèng)+付金梅+張小紅+閔東紅

摘要： 非生物脅迫可引起蛋白的功能紊亂，維持蛋白的功能構(gòu)象和阻止非天然蛋白的聚合，對(duì)于細(xì)胞存活很關(guān)鍵。伴侶素可以幫助蛋白質(zhì)在脅迫條件下復(fù)性，在植物抵抗非生物脅迫中扮演著非常重要的角色。為分析伴侶素TaTCP22的分子特性，解析伴侶素的脅迫響應(yīng)機(jī)制，以小麥的cDNA為模板擴(kuò)增得到TaTCP22 ，利用生物信息學(xué)方法分析小麥TaTCP22 的分子特性，使用MEGA5對(duì)小麥TaTCP22蛋白序列及其同源序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析并構(gòu)建同源物種間的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；利用GSDS和PHYRE2在線(xiàn)工具分別對(duì)小麥TaTCP22 基因結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；從Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取小麥TaTCP22 上游2 000 bp序列作為啟動(dòng)子，用PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)小麥TaTCP22 啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行分析；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TaTCP22 在不同組織及在脫落酸（abscisic acid，簡(jiǎn)稱(chēng)ABA）、聚乙二醇（polyethylene glycol，簡(jiǎn)稱(chēng)PEG）、水楊酸（salicylicacid，簡(jiǎn)稱(chēng)SA）、氯化鈉（NaCl）、低溫脅迫處理下的表達(dá)量；利用In-Fusion技術(shù)構(gòu)建TaTCP22 -16318GFP載體，采用PEG介導(dǎo)法將外源基因轉(zhuǎn)到小麥原生質(zhì)體中，在激光共聚焦顯微鏡下觀察基因定位情況。小麥TaTCP22 全長(zhǎng)1 643 bp，基因編碼區(qū)包含UTR區(qū)和13個(gè)內(nèi)含子以及13個(gè)外顯子；啟動(dòng)子元件分析表明，TaTCP22 包含多種逆境脅迫應(yīng)答元件；亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，TaTCP22蛋白主要定位在細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，TaTCP22在不同組織中的表達(dá)水平不同；TaTCP22 對(duì)于多種非生物脅迫均有不同程度的響應(yīng)，說(shuō)明TaTCP22 可能參與了多種脅迫應(yīng)答途徑。

關(guān)鍵詞： 小麥；分子伴侶；TCP-1；脅迫響應(yīng)；亞細(xì)胞定位

中圖分類(lèi)號(hào)： Q785；S512.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）22-0027-05

小麥?zhǔn)侵饕募Z食作物之一，其生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量及品質(zhì)受到干旱、低溫、鹽和病蟲(chóng)害等生物和非生物脅迫的極大限制。僅鹽害就影響約20%的灌溉農(nóng)業(yè)[1]，因此揭示小麥抗逆的分子機(jī)制，對(duì)提高小麥產(chǎn)量和品質(zhì)有重要意義。非生物脅迫通常造成蛋白質(zhì)功能紊亂，維持蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域和阻止與非功能蛋白質(zhì)聚合是細(xì)胞在非生物脅迫下存活的關(guān)鍵。熱激蛋白/分子伴侶是一類(lèi)在細(xì)胞中幫助其他蛋白折疊、組裝、運(yùn)輸、降解的蛋白質(zhì)，在非生物脅迫下，可幫助其他蛋白質(zhì)復(fù)性。熱激蛋白/分子伴侶可分為5類(lèi)：HSP70家族、伴侶素（HSP60）、HSP90家族、Hsp100/Clp家族、小分子熱休克蛋白家族[2-3]。TCP-1屬于伴侶素（HSP60）家族，伴侶素廣泛存在于生物界，被分為2類(lèi)：GroE（Ⅰ型）和伴侶素CCT（Ⅱ型）[4]。Ⅰ型是在細(xì)菌、線(xiàn)粒體、葉綠體中發(fā)現(xiàn)的，Ⅱ型是在古細(xì)菌和真核生物的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的[5]。CCT是一種廣泛存在于細(xì)胞漿中的異型寡聚蛋白，在肌動(dòng)蛋白、微管蛋白的組裝和折疊中發(fā)揮重要的作用，具有相同的雙環(huán)背靠背垛疊結(jié)構(gòu)（back to back stacked rings），由14～18個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基的分子量約為60 ku。真核細(xì)胞的CCT由2個(gè)花托樣結(jié)構(gòu)構(gòu)成，只有少數(shù)蛋白是與CCT結(jié)合的天然底物[6]。除哺乳動(dòng)物睪丸中發(fā)現(xiàn)的一種組織特異性亞基類(lèi)型CCTζ-2外，所有生物的CCT都由8個(gè)相同的亞基（α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ）構(gòu)成[7]。Yamada等從紅樹(shù)林cDNA中克隆BsCCTα轉(zhuǎn)化的大腸桿菌能增強(qiáng)對(duì)鹽和滲透脅迫的忍耐性[8]。前期研究主要集中在CCT伴侶素的結(jié)構(gòu)、功能及作用底物方面，且在動(dòng)物中的研究較多，而對(duì)CCT在植物體中響應(yīng)脅迫的功能研究較少。本研究從小麥中克隆到1個(gè)伴侶素基因TaTCP22，并對(duì)小麥TaTCP22 的生物學(xué)特性以及參與非生物脅迫的應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行研究，為闡述CCT提高小麥抗逆性的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥輪選987種子由西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥育種課題組提供。16318 GFP載體由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。小麥播種在土中（蛭石、泥炭土體積比=1 ∶ 1），在溫室適宜的條件中生長(zhǎng)2周，取出后用蒸餾水將根沖洗干凈，置于濾紙上進(jìn)行干燥處理，將干燥后的整株放入液氮中冷凍10 min后取出并迅速保存到 -80 ℃ 冰箱中準(zhǔn)備提取RNA。

1.2 方法

1.2.1 基因TaTCP22 的全長(zhǎng)克隆

利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站的相關(guān)程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，找出小麥TaTCP22 基因的全長(zhǎng)序列，利用DNAMAN設(shè)計(jì)正向引物5′-ATGGGCGGCCCAGGC-3′和反向引物5′-TTAAGGCTTGAGAGCAATCG-3′。以小麥cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段總長(zhǎng)為828 bp，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并利用DNA純化回收試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行膠回收。用Zero Back Fast Ligation Kit（TIANGEN） pZeroBack/blunt載體快速連接膠回收產(chǎn)物，利用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，然后進(jìn)行菌液PCR陽(yáng)性鑒定，對(duì)陽(yáng)性菌液進(jìn)行測(cè)序，將其中正確的保菌備用。

1.2.2 進(jìn)化樹(shù)和基因蛋白序列分析

根據(jù)小麥TaTCP22蛋白序列進(jìn)行同源性搜索，下載與小麥TaTCP22蛋白序列相似度>50%的其他物種蛋白序列。使用MEGA5對(duì)TaTCP22蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，將分析結(jié)果使用鄰接法生成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，其中Bootstrap值設(shè)為1 000。endprint

1.2.3 基因結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

根據(jù)GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線(xiàn)工具對(duì)基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，制作小麥TaTCP22 基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)示意圖。利用PHYRE2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page. cgi？id=index）在線(xiàn)工具對(duì)基因的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4 啟動(dòng)子順式作用元件分析

從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Phytozome（http：//www.phytozome.net/search.php）中選取基因起始密碼子上游2 000 bp序列作為啟動(dòng)子區(qū)，利用植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫(kù)PLACE26.0（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）分析基因的順式作用元件。

1.2.5 亞細(xì)胞定位

利用In-Fusion技術(shù)構(gòu)建TaTCP22 -16318GFP載體，利用聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將外源基因轉(zhuǎn)到小麥原生質(zhì)體中，25 ℃培養(yǎng)18 h，在激光共聚焦顯微鏡下觀察其定位情況。

1.2.6 組織特異性及表達(dá)模式分析

分別取小麥品種輪選987的根、莖、葉、雌蕊、雄蕊、穎殼、胚性愈傷組織為試驗(yàn)材料，液氮速凍保存。對(duì)生長(zhǎng)2周的小麥幼苗分別進(jìn)行脫落酸 （ABA，200 μmol/L）和水楊酸（SA，1 mmol/L）、干旱（6% PEG）、低溫（4 ℃）、NaCl（200 mmol/L）處理，并分別于處理后0、1、2、4、 8、12、24、48 h取樣，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

用TRIzol試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）提取總RNA，分別利用小麥不同組織和5種脅迫下的總RNA為模板，以SYBR Green染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad CFX96）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：2×Taq PCR Master Mix（含熒光染料）12.5 μL、10 μmol/L 引物各 1 μL、ddH2O 7.5 μL、cDNA模板3 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個(gè) 循環(huán)。PCR引物序列為F：5′-AGCCTGACCGCATCCTATTA- 3′，R：5′-AGCGACTTTGGCCTGAACT-3′。以小麥β-actin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，其引物序列為β-actin-F：5′-CTCCCTCACAA CAACCGC-3′和β-actin-R：5′-TACCAGGAACTTCCATA CCAAC-3′。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaTCP22 的特性分析

小麥TaTCP22 全長(zhǎng)1 674 bp，編碼557個(gè)氨基酸，其對(duì)應(yīng)蛋白的分子量為60.0 ku，等電點(diǎn)為9.13。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，小麥TaTCP22蛋白包含1個(gè)Porin3保守域，屬于Porin3轉(zhuǎn)錄因子家族第一大類(lèi)。運(yùn)用MEGA5軟件對(duì)TaTCP22蛋白及其他物種中的同源蛋白做系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析（圖1）。用DNAMAN分析二穗短柄草、玉米、高粱、柳枝稷、水稻等作物的蛋白保守域，圖2結(jié)果顯示，小麥TaTCP22與短柄草親緣關(guān)系最近，親緣關(guān)系越近，蛋白結(jié)構(gòu)越相似。

從Phytozome基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得基因組序列和編碼序列（coding sequence，簡(jiǎn)稱(chēng)CDS），對(duì)小麥TaTCP22外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。圖3結(jié)果表明，該基因編碼區(qū)包含非編碼區(qū)（untranslated region，簡(jiǎn)稱(chēng)UTR）和13個(gè)內(nèi)含子以及13個(gè)外顯子；對(duì)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，小麥TaTCP22 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的可信度為100%，包含18個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)和19個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)。

2.2 啟動(dòng)子順式作用元件分析

用PLACE在線(xiàn)工具分析小麥TaTCP22 啟動(dòng)子順式作用元件，結(jié)果（表1）發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子區(qū)域中包含ABRE、ACGT、LTRE、MYB、MYC等逆境相關(guān)的順式作用元件[9]，其中MYC元件數(shù)量最多，為24個(gè)，其次為ACGT。據(jù)報(bào)道，這些元件在植物處于ABA、低溫、干旱等脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用[10-11]。

2.3 亞細(xì)胞定位

將TaTCP22與GFP蛋白融合的TaTCP22-hGFP融合表達(dá)載體和GFP空載體分別轉(zhuǎn)入小麥原生質(zhì)體中，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)入空載體的小麥原生質(zhì)體整個(gè)細(xì)胞中可見(jiàn)明亮的綠色熒光（圖4-A），轉(zhuǎn)入 TaTCP22-hGFP融合表達(dá)載體的小麥原生質(zhì)體主要在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中可見(jiàn)綠色熒光（圖4-B）。結(jié)果說(shuō)明小麥TaTCP22主要分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。

2.4 表達(dá)模式分析

TaTCP22 在小麥組織中的特異性表達(dá)分析結(jié)果（圖5-A）顯示，TaTCP22 基因在根、莖、葉、雌蕊、雄蕊、穎殼、愈傷中都有表達(dá)，根中表達(dá)量最高，說(shuō)明TaTCP22 主要在根中發(fā)揮作用。莖、葉中的表達(dá)量次之，雄蕊、愈傷和穎殼的表達(dá)量相似，雌蕊中表達(dá)量最少。

迄今為止，不同物種中鑒定出的大部分TaTCP22 基因參與[CM（25]了對(duì)生物和非生物逆境的響應(yīng)。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)

ABA（200 μmol/L）和SA（1 mmol/L）、干旱（6% PEG）、低溫（4 ℃）、NaCl（200 mmol/L）等不同脅迫處理下TaTCP22 基因的表達(dá)量，圖5結(jié)果表明，PEG、SA、NaCl處理下TaTCP22 基因的表達(dá)量下調(diào)；4 ℃低溫處理下，TaTCP22 在處理2 h后被誘導(dǎo)表達(dá)，2 h后表達(dá)量波動(dòng)變化，24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值。ABA處理下，TaTCP22 表達(dá)量在處理2 h達(dá)到最大值，之后都低于正常水平。上述結(jié)果表明，TaTCP22 基因的表達(dá)，受ABA、SA、干旱、低溫和NaCl的誘導(dǎo)，在ABA、干旱、NaCl處理下的表達(dá)模式有些相似。endprint

3 討論

TCP-1廣泛存在于真核及原核生物中，是一個(gè)典型的分子伴侶，受多種生物逆境和非生物逆境的誘導(dǎo)[12]。真核細(xì)胞中雙環(huán)背對(duì)背堆疊的多聚體分子伴侶素（chaperonin）TRiC/CCT是最為復(fù)雜的分子伴侶，可以幫助5%～10%的胞質(zhì)蛋白進(jìn)行折疊[13-15]，包括許多重要的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白，如細(xì)胞骨架組成的微管蛋白和肌動(dòng)蛋白、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CDC20和CDH1[16-17]。

TRiC/CCT蛋白質(zhì)的折疊是依賴(lài)ATP[18-19]進(jìn)行的。本研究中的TaTCP22 編碼557個(gè)氨基酸，其保守域C端和N端包含β折疊結(jié)構(gòu)，其頂端結(jié)構(gòu)域包含1個(gè)螺旋突出結(jié)構(gòu)域；赤道結(jié)構(gòu)域形成1個(gè)環(huán)形接口，包含參與核苷酸表達(dá)的大部分殘基，可與ATP結(jié)合并有微弱的ATP酶活性；中間區(qū)域形成的頂端表面口袋與核苷酸結(jié)合。CCT底物蛋白別構(gòu)后形成單鏈，進(jìn)入CCT中間內(nèi)腔，與頂端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成復(fù)合物，該復(fù)合物與ATP結(jié)合后，可依賴(lài)ATP水解釋放的能量改變CCT頂端結(jié)構(gòu)螺旋突出結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象，并帶動(dòng)環(huán)內(nèi)構(gòu)象的改變，完成蛋白質(zhì)的折疊與組裝[7，20]。

目前關(guān)于植物分子伴侶功能特性的研究是有限的，當(dāng)植物遭受脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的酶和結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的改變，因此細(xì)胞可在應(yīng)激條件下維持蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，防止非天然蛋白質(zhì)的聚集使得細(xì)胞在應(yīng)激條件下的存活顯得尤為重要[21]。為維持細(xì)胞間的穩(wěn)態(tài)，sHsp、Hsp70可維持蛋白質(zhì)的功能構(gòu)象，阻止在脅迫下對(duì)細(xì)胞存活非常重要的蛋白質(zhì)的聚合，Hsp60、Hsp70和Hsp90可維持非天然蛋白的復(fù)性。當(dāng)聚合形成一些變性蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白時(shí)，Hsp100/Clp蛋白可溶解錯(cuò)誤蛋白，重新折疊形成有功能的蛋白，或通過(guò)蛋白酶降解這些蛋白[22]。本研究中，TaTCP22 基因在ABA和 4 ℃ 低溫處理下被誘導(dǎo)表達(dá)，可能參與了維持一些非天然蛋白質(zhì)復(fù)性的過(guò)程，推測(cè)其參與了脅迫應(yīng)答。在啤酒酵母屬中，CCTα在低溫條件下，mRNA和蛋白的表達(dá)水平都提高了[23]，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致；將4 ℃條件下的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10 ℃條件下，其蛋白表達(dá)水平也明顯提高，表明CCTα蛋白對(duì)于初期從低溫恢復(fù)轉(zhuǎn)至高溫生長(zhǎng)條件非常重要，與其他熱激蛋白從高溫恢復(fù)一致，猜測(cè)本試驗(yàn)中的TaTCP22 基因也有相似的功能。植物對(duì)干旱的脅迫響應(yīng)分為ABA依賴(lài)和ABA不依賴(lài)2種途徑，TaTCP22 基因?qū)Ω珊当憩F(xiàn)為負(fù)調(diào)控，對(duì)ABA表現(xiàn)為正調(diào)控，說(shuō)明該基因在干旱脅迫下不依賴(lài)ABA的信號(hào)途徑。因此推測(cè)該基因可能參與了低溫調(diào)控和非依賴(lài)ABA的干旱調(diào)控，在小麥適應(yīng)非生物脅迫中起作用，為研究小麥的抗逆機(jī)制提供了幫助。

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