塊根塊莖類植物細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用

李鑫　李炎林　李清明　李文佳　蘇小軍

摘要：植物細胞懸浮培養(yǎng)已廣泛用于生產(chǎn)次生代謝物，如多糖、皂苷、生物堿、黃酮類及多酚等物質(zhì)。本文綜述了國內(nèi)外塊根塊莖類植物細胞懸浮培養(yǎng)體系，內(nèi)容涉及懸浮體系方法、技術(shù)及其應(yīng)用領(lǐng)域等方面，同時初步討論大規(guī)模生產(chǎn)次生代謝物問題。

關(guān)鍵詞：塊根莖類植物；細胞懸浮培養(yǎng)；次生代謝物

植物細胞懸浮培養(yǎng)是將植物活體組織或離體組織培養(yǎng)物如愈傷組織、胚狀體等轉(zhuǎn)至合適的液體培養(yǎng)基中，置于特定轉(zhuǎn)速的搖床上進行振蕩懸浮培養(yǎng)，經(jīng)過周期的繼代培養(yǎng)和篩選后形成穩(wěn)定均一的懸浮細胞系。植物細胞由于其分散性好、細胞形狀及細胞團大小大致相同，而且生長迅速、重復性好、易于控制等有利因素，被廣泛用于細胞學、生理學、分子生物學、發(fā)育生物學及遺傳學、生物化學的研究。它不僅可直接用于原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)與雜交、基因轉(zhuǎn)移和生產(chǎn)次生代謝物等，還可短期內(nèi)在細胞水平篩選出預(yù)期突變體，因此，細胞懸浮培養(yǎng)已成為植物生物技術(shù)中最有用的手段之一。

塊根塊莖類植物廣泛存在于大自然中，主要包括馬鈴薯、淮山、半夏、盾葉薯蕷、何首烏、人參、甘草、姜等品種，且多是藥食兼用植物，這類植物根莖內(nèi)含有多種次生代謝物，如多糖、皂苷、生物堿、黃酮類及多酚等物質(zhì)。近年來植物離體培養(yǎng)技術(shù)愈發(fā)成熟，利用植物細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)有效獲取代謝產(chǎn)物是一大研究熱點，但能實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的植物不多。本文筆者對近年來國內(nèi)外對塊根塊莖類植物細胞懸浮培養(yǎng)進行了綜述，內(nèi)容包括懸浮培養(yǎng)影響因子、方法和技術(shù)，應(yīng)用領(lǐng)域涉及突變體選取、次生代謝物提取和生物學研究；同時探討了工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)次生代謝物存在問題及其建議。

1植物細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)

1.1懸浮體系影響因子

懸浮培養(yǎng)技術(shù)在植物次生代謝物大規(guī)模培養(yǎng)中得到了廣泛的應(yīng)用。國內(nèi)外在此方面已經(jīng)取得很大進展。因此，了解影響懸浮培養(yǎng)的影響因子，對快速、準確建立高質(zhì)量的懸浮體系具有重要意義。

1.1.1外植體選取。對于不同的植物，外植體選擇差異較大。塊根塊莖類植物一般選擇用葉片、莖尖、芽尖、胚根等作為外植體。選擇合適的外植體，才能得到胚性愈傷率和再生率較高的再生體系，在胚性愈傷率較高的基礎(chǔ)上更容易快速建立起高頻再生的懸浮細胞系。

1.1.2愈傷組織誘導。塊根塊莖類植物愈傷組織的誘導差異較大，一般植物外植體經(jīng)誘導后通常可產(chǎn)生3種類型的愈傷組織：①質(zhì)地堅硬、塊狀、顏色鮮黃的胚性愈傷組織；②柔軟、水漬、形狀不規(guī)則、顏色淡白的非胚性愈傷組織；③質(zhì)地疏松、易分散、不分泌粘液的顆粒狀胚性愈傷組織。通過對愈傷組織有利誘導，為細胞懸浮培養(yǎng)提供良好的基礎(chǔ)，有利于次生代謝物分泌。

1.1.3培養(yǎng)基成分。基本培養(yǎng)基主要是無機鹽，而不同科屬的植物對營養(yǎng)物質(zhì)的需求不盡相同，所以在植物細胞懸浮培養(yǎng)時，對無機鹽的種類及濃度要求也有所不同。植物主要常用的培養(yǎng)基有White、Heller、MS、ER、B5及N6等幾種。

培養(yǎng)基為塊根塊莖類植物細胞懸浮培養(yǎng)提供營養(yǎng)物質(zhì)，對植物組織生長、細胞分化和次生代謝產(chǎn)物積累等具有重要作用。其內(nèi)營養(yǎng)成分主要包括碳源、氮源、有機物質(zhì)、無機養(yǎng)分、外源激素或生長調(diào)節(jié)劑等。

1.2懸浮培養(yǎng)方法和技術(shù)

植物細胞培養(yǎng)是在離體條件下，以單細胞或細胞團為單位進行植物組織離體培養(yǎng)。該技術(shù)不受外界條件和性狀分離等影響，可在較短時間內(nèi)大規(guī)模培養(yǎng)出較均勻的細胞，便于后續(xù)研究與利用。同時植物細胞需較長的培養(yǎng)過程，需要長時間保持無菌條件，培養(yǎng)過程中易造成污染且細胞常發(fā)生變異。植物細胞在懸浮培養(yǎng)時對氧的需求量較低，但由于植物細胞培養(yǎng)后期密度高、粘度大，氧的傳輸會受到阻礙，因此與微生物相比，在達到同樣濃度時，氧傳遞速率要小得多。另外，植物細胞易于粘附成團使攪拌不勻而導致營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸受到限制，因而其二次代謝途徑更加復雜。

懸浮培養(yǎng)根據(jù)其培養(yǎng)方式可分為分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)2種類型。分批培養(yǎng)是把細胞分散在一定容積的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，目的是獲得細胞懸浮培養(yǎng)物；連續(xù)培養(yǎng)是利用特制的培養(yǎng)容器進行大規(guī)模細胞培養(yǎng)不同的培養(yǎng)方法，其反應(yīng)器選擇也有差異。反應(yīng)器規(guī)模能否放大是選擇反應(yīng)器的一個重要前提，懸浮培養(yǎng)規(guī)模的放大主要通過增加反應(yīng)器體積或者增加反應(yīng)器數(shù)量，增大反應(yīng)器可以節(jié)省大量的配套工程及人員成本，而多臺小的反應(yīng)器雖然操作靈活，但成本相對高。目前國內(nèi)外用于植物細胞懸浮培養(yǎng)的反應(yīng)器主要有攪拌式、鼓泡式、氣升式、振動混合式，此外還有植物固定化培養(yǎng)生物反應(yīng)器、光生物反應(yīng)器及一次性生物反應(yīng)器等。

選擇和配置生物反應(yīng)器還需考慮和滿足生產(chǎn)工藝和產(chǎn)能需求。反應(yīng)器接口的標準化、配件提供速度及售后服務(wù)質(zhì)量等，均應(yīng)作為工業(yè)化選用生物反應(yīng)器考慮的因素，以免造成生產(chǎn)的延誤n珂?？傊谥匾曋参镔Y源保護及有效利用的今天，合理利用植物細胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)來大規(guī)模生產(chǎn)植物中有效成分具有重要意義。

2植物細胞懸浮培養(yǎng)應(yīng)用領(lǐng)域

通過植物細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)，利用懸浮細胞系主要應(yīng)用有：①選擇突變體，離體的單倍體體細胞可以提供一種突變體選擇系統(tǒng)，在很小的空間就可以操作大量潛在的植株。通過單細胞培養(yǎng)，可以在細胞水平上篩選出需要的突變細胞系，再生成理想的植株。②生產(chǎn)天然植物成分，懸浮培養(yǎng)物某些次生化合物含量往往比植物體高出2～5倍，通過植物細胞離體培養(yǎng)生產(chǎn)這些化合物，或利用培養(yǎng)細胞對外供前體化合物或中間產(chǎn)物進行生物轉(zhuǎn)化。③原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)與雜交，懸浮細胞是分離原生質(zhì)體較理想的材料。④細胞生物學研究的工具，利用懸浮細胞進行多方面細胞生物學研究。本文概述了塊根塊莖類植物突變體選取、次生代謝物提取、生物學研究及開發(fā)新產(chǎn)品等方面。

2.1突變體選取

塊根塊莖類植物種類繁多，植物離體培養(yǎng)選取突變體方式也不一樣。經(jīng)報道潘梅等為選取優(yōu)質(zhì)幼苗，以山藥幼嫩莖段進行離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)芽誘導最好培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+活性炭1.0g/L，組培苗移栽適宜基質(zhì)是V河抄：V椰糠：V珍珠巖=2：1：1。而Eun等選取MS+NAA 5.4μM+BA 4.44μM對半夏進行懸浮培養(yǎng)大量繁殖試管塊莖，測定試管塊莖琥珀酸發(fā)現(xiàn)，含量最高達45g/kg，近乎于野生半夏琥珀酸含量，因此體外培養(yǎng)半夏試管塊莖，是一種選擇半夏塊莖突變體方法。Mingjun Li等進行山藥體外培養(yǎng)生產(chǎn)試管塊莖試驗，最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+KT 0.5rag/L+2，4-D0.1mg/L+PP₃₃₃ 0.1mg/L及60g/L蔗糖，每個植株可生產(chǎn)2～3個試管塊莖，大大加速了山藥繁殖。

2.2次生代謝物提取

植物細胞懸浮培養(yǎng)能高效合成許多重要價值的次生代謝物，傳統(tǒng)提取這些產(chǎn)物方式均是從天然植物中獲取，但天然植物生長周期長，其生長受地域和環(huán)境因素影響較大，利用植物細胞懸浮培養(yǎng)能夠極大地彌補這些缺陷。

選擇合適培養(yǎng)基進行細胞懸浮有利于次生代謝物分泌。楊帆等發(fā)現(xiàn)添加2mg/L 2，4-D+1mg/L NAA的MS培養(yǎng)基最適合馬鈴薯‘底西瑞懸浮細胞生長，細胞的最佳接種量為7.5mL/50 mL。張丹等建立人參懸浮細胞系，研究碳源、氮源、磷源及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對其影響，結(jié)果表明：MS+2，4-D 2.0mg/L+NAA2.0mg/L+BA 0.4mg/L為最適培養(yǎng)基，接種量10g，100mL，19%，100r/min轉(zhuǎn)速條件下，人參懸浮細胞系生物量積累最大。Ewa等采用MS+2，4-D 1mg/L+NAA 1mg/L+BAP 0.5mg/L+50mg/L蔗糖液體培養(yǎng)基，利用細胞懸浮培養(yǎng)研究了西洋參6種皂苷的生物合成，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)25～30d之后，人參皂苷達到最高接近30mg/g·dw，但在各個生長時期皂苷的積累與生物量增加是不成比例的，在生物量快速增加達到90%時，僅有一半人參皂苷被檢測到，另一半皂苷在生物量緩慢增長階段被積累。Narges等通過誘導元參愈傷組織及建立細胞懸浮體系，在體外生產(chǎn)阿克替苷。選取MS+NAA 0.5mg/L+BA 2.0m/L誘導愈傷組織，且誘導率達到100%，生長最好愈傷組織中阿克替苷鮮重含量達到1.6μg/g。選取松散的、生長較好的愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，在培養(yǎng)17天后阿克替苷達到最大鮮重含量為14.25μg，g。Latiporn等進行野葛根細胞懸浮培養(yǎng)獲取葛雌素、脫氧微雌醇及異黃酮，選取莖段愈傷組織在MS+TDZ 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L+BA 1.0m/L中進行試驗，檢測色烯和異黃酮干重含量分別為184.83±20.09μg，9、20.72±2.38mg/g。同時對不同碳源進行研究，發(fā)現(xiàn)在野葛根細胞懸浮培養(yǎng)中選取蔗糖有利于生物量積累，而果糖有利于脫氧微雌酮和異黃酮分泌。

此外，一定程度誘導也有助于次生代謝物增加。陶興魁等對不同濃度EMS溶液對半夏懸浮細胞系進行誘變處理，及耐高溫突變體篩選表明，半夏試管苗在高溫脅迫下，葉片內(nèi)游離脯氨酸含量升高，積累速度和積累量明顯高于對照組，可以把脯氨酸含量作為半夏抗高溫的生理指標之一。卞愛華等發(fā)現(xiàn)在甘草細胞懸浮培養(yǎng)中，添加水楊酸、酵母提取物、水解酪蛋白、高糖、高鹽、超聲等誘導子有助于提高甘草酸含量。

2.3生物學研究

對于大多數(shù)塊莖類植物而言，直接提取次生代謝物含量較低。隨著離體培養(yǎng)技術(shù)愈發(fā)成熟，近年來利用植物細胞懸浮培養(yǎng)進行生物學研究也取得一定成效。Eng等采用MS+2，4-D 2mg/L+NAA 1mg/L+BAP 1mg/L進行凹唇姜細胞懸浮培養(yǎng)，采取蛋白質(zhì)組學分析經(jīng)苯丙氨酸誘導的提取物，發(fā)現(xiàn)了黃酮類化合物及苯丙素類的生物合成方式。同時許多研究者進行動物試驗方面報道，Man～n等通過甘草懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生的黃酮類化合物及少量三萜烯，與栽種甘草中活性成分對二甲苯誘導小鼠水腫的抗炎效果對比，發(fā)現(xiàn)抗炎效果相差無幾。Tanatorn等研究茉莉酸甲酯對野葛根細胞懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生異黃酮和抗氧化物酶的影響，表明茉莉酸甲酯濃度為1.0μg/mL時，異黃酮含量最高，同時超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過氧化物酶在細胞中活動水平均增強，而過氧化物酶減弱。因此野葛根細胞有抵御超氧化物和過氧化氫壓力的機制。Tanatornm 等選取細胞懸浮培養(yǎng)（PMC）和塊莖根（PMT）獲取野葛根黃酮類化合物，結(jié)果表明：切除卵巢的老鼠試驗，PMT刺激雌激素活動強于PMC；體外抑制破骨細胞試驗，PMT和PMC提取物均能抑制抗破骨細胞活動；DPPH法測定IC50值，PMT低于PMC。

2.4其他

塊根塊莖類植物細胞培養(yǎng)中含有多種特殊的代謝產(chǎn)物，如黃酮類、皂苷、多糖、生物堿及香精等活性成分。利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥物和活性成分已成為當代生物技術(shù)的一個重要領(lǐng)域，特別是培養(yǎng)人參、何首烏等藥用植物細胞直接生產(chǎn)天然藥物研究已成為熱點。

3展望

利用現(xiàn)代細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)研究和獲取植物代謝產(chǎn)物，能夠克服傳統(tǒng)上從天然植物中直接提取代謝產(chǎn)物存在的一些不足。目前盡管在懸浮培養(yǎng)調(diào)控培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、光質(zhì)、誘導子等影響次生代謝物積累方面的研究已經(jīng)取得了很大的進展，然而只有人參皂苷、紫草寧等少數(shù)植物懸浮細胞培養(yǎng)實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)。其主要原因在于，高產(chǎn)而又穩(wěn)定的細胞系難以篩選；植物細胞生長周期過長，污染和褐化問題難以徹底解決；植物細胞要求復雜，生物細胞反應(yīng)器工藝難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求；植物細胞培養(yǎng)成本高，代謝產(chǎn)物含量不穩(wěn)定，調(diào)控難度大。因此，利用植物細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)獲取次生代謝物還有待系統(tǒng)和深入研究。

隨著生物轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，植物細胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合生物技術(shù)獲取次生代謝物展現(xiàn)出誘人的發(fā)展前景。要實現(xiàn)植物細胞培養(yǎng)工業(yè)化，需要重點開展以下4個方面的研究：①獲取和篩選高產(chǎn)、穩(wěn)定的細胞系；②探索并掌握植物細胞次生代謝信號調(diào)控機制，合理、準確地調(diào)控懸浮細胞生長和代謝；③改善植物生物反應(yīng)器的工藝和技術(shù)，提供植物細胞培養(yǎng)的最適環(huán)境；④利用基因工程技術(shù)，對次生代謝中的關(guān)鍵酶基因進行修飾和改造，提高次生代謝物的產(chǎn)量。