王芳軍 高 昳 劉兵團 王文平 劉鵬飛

東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院消化內(nèi)科(214400)

·論 著·

慢病毒介導(dǎo)RNAi下調(diào)LMP2A基因表達抑制EB病毒相關(guān)胃癌細胞的體外生長*

王芳軍#高 昳 劉兵團 王文平 劉鵬飛&

東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院消化內(nèi)科(214400)

EB病毒(EBV)與多種人類腫瘤，如Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌、胃癌等上皮性腫瘤相關(guān)。病毒編碼的潛伏膜蛋白2A(LMP2A)存在于部分EBV相關(guān)胃癌(EBVaGC)中，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目的應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制LMP2A基因表達，探討下調(diào)LMP2A對EBVaGC細胞體外生長的影響。方法構(gòu)建慢病毒載體pGCSIL-LMP2A-shRNA-LV和陰性對照載體并轉(zhuǎn)染EBVaGC細胞株GT38，以real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測慢病毒載體的抑制效率，CCK-8實驗、克隆形成實驗和流式細胞術(shù)檢測GT38細胞的細胞生長、細胞周期和細胞凋亡。結(jié)果GT38細胞轉(zhuǎn)染LMP2A-shRNA-LV后，LMP2A mRNA和蛋白表達分別下調(diào)65.4%和50.8%，進而導(dǎo)致細胞體外增殖受抑，克隆形成能力降低，G0/G1期細胞比例增加，細胞凋亡率增高，與轉(zhuǎn)染陰性對照慢病毒載體和未予轉(zhuǎn)染慢病毒的GT38細胞相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)能高效抑制LMP2A基因表達，進而抑制EBVaGC細胞的體外生長，誘導(dǎo)G0/G1期阻滯，促進細胞凋亡。LMP2A可作為EBVaGC基因治療的潛在靶點。

潛伏膜蛋白2A； EB病毒感染； 胃腫瘤； RNA干擾； 慢病毒感染； 細胞增殖； 細胞凋亡

EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)為人類γ皰疹病毒，可長期存在于人體細胞內(nèi)但不產(chǎn)生任何癥狀[1]。據(jù)文獻報道，EBV與多種人類腫瘤相關(guān)，如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌[2-3]。EBV相關(guān)胃癌(EBV-associated gastric carcinoma, EBVaGC)約占全世界胃癌發(fā)病率的10%[3-5]，此類胃癌很難通過外科手術(shù)、放療、化療等方法完全消除，尋找新的抑制腫瘤細胞生長的方法對于其治療至關(guān)重要。

潛伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A, LMP2A)是一種由EBV編碼的潛伏蛋白，對于維持病毒在感染B淋巴細胞內(nèi)潛伏具有重要作用，廣泛表達于EBV感染細胞以及EBV相關(guān)上皮性腫瘤如鼻咽癌和胃癌。研究發(fā)現(xiàn)約40%的EBVaGC細胞LMP2A蛋白表達陽性，并與低生存率密切相關(guān)[3]。LMP2A蛋白的胞質(zhì)區(qū)氨基端具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[6]，可通過調(diào)控PI3K/Akt、Syk、β-catenin、ERK、NF-κB、Notch等諸多信號通路，在上皮細胞中發(fā)揮多種功能，包括介導(dǎo)細胞生長、轉(zhuǎn)化、存活、遷移、侵襲以及抑制細胞凋亡、分化、促進化療耐藥等[7-16]，并可通過激活STAT3信號通路上調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)表達而促進抑癌基因DNA甲基化、抑制抑癌基因表達[5]，從而參與EBV相關(guān)上皮性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此，LMP2A可能作為EBVaGC的潛在基因治療靶點。

RNA干擾(RNAi)技術(shù)可特異性沉默目的基因表達并誘導(dǎo)功能缺失表型[17]，慢病毒載體則可實現(xiàn)有效的基因體外導(dǎo)入[18]。本研究應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)抑制LMP2A基因表達，探討下調(diào)LMP2A對EBVaGC細胞體外生長的影響。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

EBV陽性胃癌細胞株GT38(ATCC)；含有綠色熒光蛋白(GFP)報告基因的pGCSIL-GFP載體(吉凱基因)；Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzolTM試劑、SuperScript?Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶、PlatinumTMSYBRTMGreen qPCR SuperMix-UDG w/ROX(Thermo Fisher Scientific)；大鼠EBV LMP2A單克隆抗體[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]；CCK-8試劑盒(同仁化學(xué)研究所)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(上海圓創(chuàng)生物科技有限公司)。

二、方法

1. 細胞培養(yǎng)：GT38細胞培養(yǎng)使用含10% FBS、50 U/mL 青霉素G、50 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)基，4～5 d進行細胞傳代。

2. 慢病毒載體構(gòu)建：所構(gòu)建慢病毒載體表達的RNAi可特異性識別LMP2A基因。使用上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司的RNAi設(shè)計程序確定人LMP2A基因shRNA序列(CTC CCA ATA TCC ATC TGC T)，同時構(gòu)建與人LMP2A基因無同源性的序列(TTC TCC GAA CGT GTC ACG T)作為陰性對照序列?；瘜W(xué)合成攜帶靶序列的寡核苷酸，退火，AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后以T4 DNA連接酶插入表達載體。將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌DH5α細胞，通過限制性內(nèi)切酶和DNA測序篩選正確的轉(zhuǎn)化株。將序列克隆至pGCSIL-GFP載體以形成慢病毒載體。將表達載體以Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染293T細胞，48 h后收獲細胞上清液，以過濾器除去上清液中的細胞后分別收獲pGCSIL-LMP2A-shRNA-LV和pGCSIL-neg-shRNA-LV(陰性對照)。以超速離心法濃縮慢病毒，293T細胞轉(zhuǎn)染實驗測定病毒滴度。

3. 慢病毒轉(zhuǎn)染：收集對數(shù)生長期GT38細胞，按5×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)過夜。將慢病毒以0.2 mL含聚凝胺(10 μg/mL)的完全培養(yǎng)基稀釋后加至上述96孔板中，37 ℃轉(zhuǎn)染12 h，更換新鮮培養(yǎng)基。Olympus IX53熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后細胞，根據(jù)GFP陽性細胞百分率確定轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染5 d后測定LMP2A表達以及細胞生長和凋亡情況。實驗設(shè)3個組別：CON組(空白對照，細胞未予轉(zhuǎn)染)、NC組(陰性對照，細胞轉(zhuǎn)染pGCSIL-neg-shRNA-LV)和KD組(細胞轉(zhuǎn)染pGCSIL-LMP2A-shRNA-LV)。

4. Real-time PCR：以TRIzolTM試劑提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行real-time PCR擴增。PCR引物序列見表1，操作步驟參照試劑盒說明書。以2-ΔΔCt法計算LMP2A mRNA相對表達量。

表1 PCR引物序列

5. 蛋白質(zhì)印跡法：細胞冰上裂解，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品(10 μg/樣品)變性后上樣，15% SDS-PAGE凝膠分離，PVDF膜100 V轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉封閉，加入LMP2A抗體(1∶1 000)，室溫孵育 1 h，PBST洗3次，加入二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，PBST洗3次，顯影，ImageJ軟件分析灰度值。

6. CCK-8實驗：細胞接種于96孔板，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育1 h，使用Bio-Rad Model 680酶標(biāo)儀測定490 nm波長處吸光度值(A值)，根據(jù)實驗結(jié)果繪制生長曲線。

7. 克隆形成實驗：取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化并吹打成單個細胞，懸浮于培養(yǎng)基中備用。梯度稀釋細胞懸液至800個/mL，按800個/皿接種于6 cm培養(yǎng)皿。14 d后去除培養(yǎng)基，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，Giemsa染液染色20 min，ddH2O洗 2次，肉眼觀察、計數(shù)克隆數(shù)。

8. 細胞周期檢測：0.25%胰酶消化并收獲細胞，70%乙醇固定30 min，離心除去乙醇，PBS洗2次，20 mg/mL PI染色，避光孵育30 min，BD FACSCaliburTM流式細胞儀檢測細胞周期。

9. 細胞凋亡檢測：收集1×106個細胞，冰PBS洗2次，流式緩沖液重懸，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育15 min，上機前5 min加入5 μL PI，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、LMP2A-RNAi慢病毒載體的構(gòu)建

本研究應(yīng)用來源于HIV-1的慢病毒載體，通過表達針對LMP2A基因的shRNA下調(diào)LMP2A表達。攜帶GFP報告基因的pGCSIL-LMP2A-shRNA-LV和pGCSIL-neg-shRNA-LV構(gòu)建成功。GT38細胞轉(zhuǎn)染慢病毒72 h后，約95%的細胞表達GFP(圖1)，證明所構(gòu)建的慢病毒載體高效、穩(wěn)定。

二、LMP2A-shRNA-LV下調(diào)GT38細胞LMP2A表達

圖1 GT38細胞轉(zhuǎn)染慢病毒后72 h白光和熒光觀察(×100)

Real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，GT38細胞轉(zhuǎn)染慢病毒后，KD組LMP2A mRNA和蛋白相對表達量均明顯低于NC組，降幅分別為65.4%和50.8%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(n=6,P<0.05)，CON組與NC組間差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖 2)，表明轉(zhuǎn)染LMP2A-shRNA-LV可明顯下調(diào)GT38細胞的LMP2A表達水平。

1 Da=0.992 1 u

三、下調(diào)LMP2A抑制GT38細胞生長

為確定下調(diào)LMP2A基因表達對GT38細胞體外生長的影響，分別采用CCK-8實驗和克隆形成實驗檢測細胞活力，結(jié)果顯示與CON組和NC組相比，KD組GT38細胞增殖明顯受抑，克隆形成能力降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(n=6,P<0.05)(圖3)，提示下調(diào)LMP2A可引起GT38細胞生長抑制。

四、下調(diào)LMP2A誘導(dǎo)GT38細胞G0/G1期阻滯

以流式細胞術(shù)分析下調(diào)LMP2A基因表達對GT38細胞周期的影響，結(jié)果顯示與CON組和NC組相比，KD組GT38細胞G0/G1期細胞比例明顯增加，S期細胞比例明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(n=6，P<0.05)(圖4)，提示下調(diào)LMP2A可使GT38細胞發(fā)生細胞周期G0/G1期阻滯。

五、下調(diào)LMP2A誘導(dǎo)GT38細胞凋亡

以流式細胞術(shù)分析下調(diào)LMP2A基因表達對GT38細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示與CON組和NC組相比，KD組GT38細胞凋亡率顯著增高(29.89%±0.48%對15.89%±0.41%和17.15%±0.39%,n=6,P<0.05)(圖5)，提示下調(diào)LMP2A可誘導(dǎo)GT38細胞發(fā)生細胞凋亡。

*與CON組和NC組比較，P<0.05

*與CON組和NC組比較，P<0.05

圖5 下調(diào)LMP2A誘導(dǎo)GT38細胞凋亡(Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞分析)

討 論

據(jù)文獻報道，EBVaGC約占胃癌發(fā)病率的10%，患者生存率相對較低[3-5]。近半數(shù)EBVaGC中存在EBV潛伏蛋白基因——LMP2A基因表達。既往研究顯示LMP2A在上皮細胞中起有重要作用，參與細胞轉(zhuǎn)化、存活、遷移、侵襲并能抑制細胞凋亡、分化，誘導(dǎo)非錨定依賴性細胞生長，上述功能與LMP2A對PI3K/Akt、Syk、β-catenin、ERK、NF-κB、Notch等信號通路的調(diào)控有關(guān)[7-16]。此外，LMP2A還可誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、調(diào)節(jié)腫瘤干細胞的增殖和自我更新[19]，以及通過誘導(dǎo)DNA甲基化抑制抑癌基因表達[5]。上述研究發(fā)現(xiàn)均提示LMP2A有潛力成為EBVaGC的基因治療靶點。對于下調(diào)LMP2A抑制EBVaGC細胞生長的具體機制，目前尚不清楚。

本研究構(gòu)建的慢病毒載體可表達特異性針對LMP2A基因的RNAi，慢病毒轉(zhuǎn)染EBVaGC細胞株GT38后，可有效抑制LMP2A基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達。采用CCK-8實驗、克隆形成實驗和流式細胞術(shù)分析下調(diào)LMP2A對GT38細胞生長、細胞周期和細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示LMP2A下調(diào)后，GT38細胞增殖顯著受抑，克隆形成能力降低，細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，細胞凋亡增多。盡管LMP2A下調(diào)導(dǎo)致GT38細胞生長抑制和細胞凋亡的機制仍不清楚，但與既往研究發(fā)現(xiàn)的LMP2A可通過調(diào)控多種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，主要是細胞周期和細胞凋亡相關(guān)信號通路參與EBV相關(guān)上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化相符[20]。因此，LMP2A可作為EBVaGC基因治療的潛在靶點。

RNAi因其基因功能分析能力，已成為分子生物學(xué)研究的有力工具，并可作為包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病的潛在治療手段，特別是RNAi與慢病毒組合，被認(rèn)為是癌癥基因治療的新方法。本研究成功構(gòu)建了高效、穩(wěn)定的慢病毒載體系統(tǒng)，可有效抑制EBVaGC細胞株GT38的LMP2A基因表達，以慢病毒介導(dǎo)RNAi下調(diào)LMP2A表達后，GT38細胞的生長能力受到顯著抑制，該方法可能成為治療人類EBVaGC的新策略。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示由慢病毒介導(dǎo)的RNAi 技術(shù)能高效抑制LMP2A基因表達，進而抑制EBVaGC細胞的體外生長，誘導(dǎo)細胞周期G0/G1期阻滯，促進細胞凋亡。上述發(fā)現(xiàn)為人類EBV相關(guān)上皮性腫瘤的基因靶向治療提供了實驗依據(jù)。后續(xù)研究擬對LMP2A影響GT38細胞生物學(xué)行為的具體機制作進一步探索。

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SilencingofLMP2AbyLentivirus-mediatedRNAiInhibitsGrowthofEpstein-BarrVirus-associatedGastricCarcinomaCellsinvitro

WANGFangjun,GAOYi,LIUBingtuan,WANGWenping,LIUPengfei.

DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedJiangyinHospitalofSoutheastUniversityMedicalCollege,Jiangyin,JiangsuProvince(214400)

LIU Pengfei, Email: pengfeimd@163.com

Background: Epstein-Barr virus (EBV) is associated with various human lymphoid and epithelial malignancies such as Burkitt’s lymphoma, nasopharyngeal carcinoma and gastric carcinoma. LMP2A, a virus-encoded latent membrane protein is expressed in a portion of EBV-associated gastric carcinoma (EBVaGC) and has been shown to be related with the tumorigenesis and progression of EBVaGC.AimsTo explore the effect of LMP2A silencing on growth of EBVaGC cellsinvitroby using a lentivirus-mediated RNA interference (RNAi) to inhibit LMP2A gene expression.MethodsA lentivirus vector pGCSIL-LMP2A-shRNA-LV and a negative control vector were constructed and transfected into the EBVaGC cell line GT38. Real-time PCR and Western blotting were used to determine the inhibitory effect of the lentivirus vector; CCK-8 assay, colony formation assay and flow cytometry were employed to assess the cell growth, cell cycle and apoptosis of GT38 cells.ResultsIn GT38 cells transfected with LMP2A-shRNA-LV, the expression level of LMP2A mRNA was decreased by 65.4%, and that of LMP2A protein was reduced by 50.8%; the cell proliferation was inhibited, the colony formation ability was suppressed, the percentage of cells in G0/G1 phase and apoptotic rate were increased when compared with those transfected with negative control vector or without transfection (P<0.05).ConclusionsLentivirus-mediated RNAi is effective for silencing LMP2A gene expression, subsequently inhibiting the growth of EBVaGC cells, inducing G0/G1 phase arrest and enhancing cell apoptosisinvitro. LMP2A is supposed to be a potential target for gene therapy of EBVaGC.

Latent Membrane Protein 2A; Epstein-Barr Virus Infections; Stomach Neoplasms; RNA Interference;

Lentivirus Infection; Cell Proliferation; Apoptosis

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.12.002

國家自然科學(xué)基金面上項目(31670857)；江蘇省自然科學(xué)基金面上項目(BK20161152)；無錫市衛(wèi)生計生委重大科研項目(Z201509)；江蘇省青年醫(yī)學(xué)人才項目(QNRC2016136)

#Email: timeswang@163.com

&本文通信作者，Email: pengfeimd@163.com

(2017-06-20收稿；2017-08-20修回)