郝姍

摘 要 與其他植物相比，茶樹的組織培養(yǎng)起步較遲，但在當今組織培養(yǎng)迅速發(fā)展的階段，其發(fā)展速度較快。因為可重復性差、外植體褐化、完整植株獲得困難等情況的存在，茶樹組織培養(yǎng)至今仍未建立完善的高頻再生體系?；诖?，總結了茶樹組培過程中，前人對外植體、培養(yǎng)條件選擇的研究結果，并從次生代謝產物生產、種植資源保存和良種繁育推廣、加強基礎研究、與新的育種方法相結合四個方面對茶樹組織培養(yǎng)的研究工作提出展望。

關鍵詞 茶樹；組織培養(yǎng)；外植體

中圖分類號：S571.1 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.33.068

1 茶樹組織培養(yǎng)的意義

農業(yè)現代化是當前農業(yè)工作的重中之重。茶樹是我國傳統(tǒng)的特色經濟作物，近年來隨著產業(yè)的不斷發(fā)展，對優(yōu)良茶樹新品種的需求越來越迫切。傳統(tǒng)育種方法已培育出了一些產量高和品質優(yōu)的品種，但生產上仍缺乏一些符合特定人群消費需求的優(yōu)良品種，這主要是因為茶樹基因具有高度的雜合性，傳統(tǒng)的育種方法在改良茶樹品種方面難度較大。為更好地為茶農創(chuàng)造較好經濟效益，提升茶樹育種科技含量，將植物生物技術與茶常規(guī)育種技術相結合非常必要。生物技術在育種中的需要建立高頻率的遺傳轉化體系，高頻率的遺傳轉化體系則依賴于高頻率再生體系。茶樹組織培養(yǎng)快繁技術能夠在短時間內用較少的植物材料進行快速培育，生產出較多植株。茶樹組織培養(yǎng)具有生產周期短、繁殖系數高、易繼承親本的優(yōu)良性狀等特點。在茶樹實際生產中，對于優(yōu)良無性系品種快速繁殖體系的建立，加快茶新優(yōu)品種的推廣種植具有重大的實踐意義。

組織培養(yǎng)由于具有繁殖迅速、去除病毒等優(yōu)點而在茶樹繁殖上得以利用。但茶樹組培過程中的一些問題，如愈傷組織易褐化、難以分化、基因不能按序表達等制約了茶樹組織培養(yǎng)的進程。目前，要獲得經過多次繼代培養(yǎng)的完整植株，同時保證植株在大田中存活仍有較大的難度，使組織培養(yǎng)在茶樹無性快繁、保存種質資源、建立外源基因轉化的受體系統(tǒng)等育種中的應用還有較大距離。

2 茶樹組織培養(yǎng)研究進展

2.1 外植體選擇

20世紀60年代末，英國劍橋大學首次進行了茶樹莖培養(yǎng)，用以研究咖啡堿的合成途徑[1]。日本的勝尾清等在同一時期開展茶樹花藥培養(yǎng)試驗[2]。20世紀70年代以來，我國茶樹組織培養(yǎng)開始得到廣泛研究[1]。通過子葉柄和茶籽下胚軸的培養(yǎng)，直接分化出芽，得到了植株。廖利民[3]等通過葉柄的培養(yǎng)獲得了愈傷組織。嚴學成[4]等通過茶樹葉片培養(yǎng)的器官發(fā)生途徑得到了正常的互生葉小植株，并稱有效克服了組織培養(yǎng)中的褐化現象。黃亞輝[5]也通過茶樹莖尖培養(yǎng)得到了愈傷組織。

不同外植體的離體反應能力有很大差異，愈傷組織啟動時間均不相同。葉片愈傷組織誘導率高于嫩莖，嫩莖誘導率又明顯高于根尖[6]。外植體的大小和起始培養(yǎng)物的幼嫩程度也影響愈傷組織產生和器官發(fā)生能力，一般幼嫩組織比老葉老莖更易誘導出愈傷組織[7]，不同茶樹品種的差異也會對芽的誘導和增殖有影響[8]。

目前，茶樹已經從莖尖、腋芽、莖段、葉片、子葉、下胚軸、胚和花藥等成熟或未成熟組織中通過愈傷組織或直接產生不定芽的方式成功地進行器官發(fā)生和植株再生[9]，但是以營養(yǎng)器官為外植體的成功報道依然較少。

2.2 培養(yǎng)條件選擇

由于茶樹組培中選擇外植體種類的不同，所選擇的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件也會有所差異。一般認為，茶樹的組培使用MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基較好，而溫度通?？刂圃冢?5±2）℃，光照為1 500～2 000 lx，光照時間為12～16 h，培養(yǎng)基pH為5.0～6.0。

岳川[10]等通過用茶樹的腋芽進行芽的誘導分化實驗認為，CH的加入可明顯促進芽的誘導，但細胞分裂素KT對促進芽分化效果不如BA，在增殖階段用無生長素的培養(yǎng)基都可得到較好的增殖倍數。王云[11]認為，葉片、莖段都能產生愈傷組織，但莖段的愈傷組織誘導率較高，葉片的愈傷組織誘導率較低。王毅軍等[12]以茶樹葉片為外植體，以MS培養(yǎng)基附加4 mg/L 6-BA、2 mg/L IAA、

3 mg/L GA以及0.2%～0.3%活性炭誘導出了愈傷組織和胚狀體并形成小植株。張建華[2]以茶樹新梢腋芽、莖段為試驗材料發(fā)現，外植體在培養(yǎng)基MS+BA4+NAA0.1中可誘導出愈傷組織并能分化出芽，但在繼代培養(yǎng)中以培養(yǎng)基ER+BA3+NAA0.1表現較好。彭正云[13]等對根為材料的研究中則認為愈傷組織如不及時轉置新培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以后生長十分緩慢，甚至停止生長。而將愈傷組織輪換交叉置于不同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，其生長比同一組分培養(yǎng)基培養(yǎng)的旺盛。周健[14]等認為，茶樹幼胚的萌發(fā)需要有一定量的生長素的刺激作用，但較強烈的細胞分裂素的作用對茶樹幼胚的萌發(fā)有抑制作用。張廣輝[15]等認為，若要進行農桿菌介導，共培養(yǎng)基使用添加100 mmol/LAS的YMB培養(yǎng)基好于MS或MSOH培養(yǎng)基，可能是由于MS和MSOH培養(yǎng)基的高鹽濃度和低有機物質含量對農桿菌的生長和侵染有抑制作用。

劉德華[16]等以茶樹全胚、具有子葉柄的子葉為材料，研究500 lx、1 500 lx、黑暗3種光照條件對植株再生的影響。結果表明，子葉片隆起發(fā)生率隨光照度增加而降低；子葉柄的胚狀體、不定芽分化率隨光照度下降而下降；連續(xù)在黑暗下培養(yǎng)，子葉片的畸形胚發(fā)生率高，且數量多。在相同光照度下培養(yǎng)，全胚的總分化率低于子葉。N.V.Zagoskina[17]等的研究表明，UV-B（280～320nm）對于茶樹多酚類物質的累積有強烈的促進作用。同時研究中指出，該作用可能與愈傷組織光合細胞中的PSⅡ系統(tǒng)有關[18]。同時楊娟[19]等研究了LED光源不同光質在植物組培方面的研究，并展望其在茶樹組培研究上的應用。

3 目前存在的問題

3.1 可重復性差endprint

由于茶樹的組培成功率與外植體來源的苗齡和部位關系密切，導致其可重復性差。一般來說，外植體取材類型、部位、季節(jié)、時間、葉位、是否留葉等因素的良好組合，將使外植體有優(yōu)良的萌發(fā)潛力和生長表現。陳志輝[20]等在外植體性質對茶腋芽組培快繁的影響試驗中發(fā)現，不同品種對培養(yǎng)基組分適應性有較大差異。除品種因素外，外植體所處生長發(fā)育的生理狀態(tài)也有重要的作用。

3.2 外植體褐化

由于茶樹植株體內多酚類物質含量很高，導致了外植體褐化現象嚴重，并成為影響茶樹組織培養(yǎng)成功率的關鍵因素。此外，即使選用茶樹多酚含量較低的器官如幼根作為外植體，一旦形成愈傷組織又將產生大量多酚，造成愈傷組織發(fā)根和出芽困難，甚至褐化死亡。

楊亞萍[21]的實驗表明，MS標準鐵鹽的0.5倍條件下外植體褐化率較低，而且生長表現良好，外植體先用自來水沖洗過夜，再用45 ℃溫水浸泡15 min，能有效降低褐化率。鄔秀宏[22]認為，在試驗中將葉片的面積盡量切小，避免操作過程中外植體受損均能夠減少褐化面積。

3.3 完整植株獲得困難

研究發(fā)現，茶樹組織培養(yǎng)過程中愈傷組織的產生，苗和根的分化遵循普遍原則：激動素/生長素比例高時形成苗，比例低時形成根。但是目前完整植株的獲得帶有一定的隨機性。主要是因為誘導苗和根形成的激素濃度范圍往往較狹窄，而且不同的茶樹品種，不同的外植體所需的激素種類及濃度均不同。張廣輝[15]等認為，茶樹在誘導發(fā)根成功后易再生出芽，因此可以建立完善的發(fā)根誘導體系，但目前尚缺乏進一步的報道。

3.4 營養(yǎng)器官組織培養(yǎng)研究有待進一步深入

目前，以茶樹生殖器官為外植體組培成功的案例較多，但以茶樹營養(yǎng)器官尤其是莖段作為外植體的報道較少。以子葉等作為外植體易誘導出愈傷組織，但子葉體胚遺傳背景與母體的差別很大，因此應進一步加強與母體遺傳背景一致的營養(yǎng)器官作為外植體的研究。

4 研究展望

4.1 次生代謝產物生產

茶樹富含多酚、咖啡堿、茶氨酸等次級代謝產物，組織培養(yǎng)在形成愈傷組織之后這些次級代謝產物開始在體內堆積，因此組織培養(yǎng)對于研究次生代謝產物的合成機制有重要的意義。同時優(yōu)化茶樹次生代謝產物生產的組培條件和分離提純方法能能夠有效降低其生產成本，彌補天然資源的不足。

4.2 種植資源保存和良種繁育推廣

目前，我國的很多茶樹品種都逐漸被無性系良種所取代，所以可望通過組織培養(yǎng)或細胞培養(yǎng)進行茶樹種質資源的保存，特別是不育或敗育率很高的品種，這對節(jié)約空間、時間及維持我國茶樹品種的多樣性不可或缺。茶樹組織培養(yǎng)技術只需要很少的植物組織就可以獲得大量的植株，不受季節(jié)、氣候的限制，是加快茶樹繁殖速度，有利于良種繁育推廣的重要手段。

4.3 基礎研究進一步加強

目前，茶樹組織培養(yǎng)技術雖然發(fā)展迅速，但是相對于其他植物的組織培養(yǎng)而言由于起步較遲，基礎研究仍然相對薄弱，如環(huán)境對于組培過程和內含物質積累的影響研究還有待進一步加強。此外，抑制褐化和激素配比等問題也需要更進一步的研究。

4.4 與新的育種方法相結合

利用植物生物技術與常規(guī)的育種技術相結合，互相取長補短、縮短育種時間、提高效率。在茶樹育種中，應用單倍體培育、原生質體融合體細胞雜交、胚培養(yǎng)、轉基因技術等能夠較快地獲得穩(wěn)定的具有某些優(yōu)良性狀品種，培育出新一代的茶樹優(yōu)質品種，才能有更高產量、更好品質的茶產品的收獲，但這些育種方式最終都需要組織培養(yǎng)來獲得目的植株。因此，加快建立完善茶樹組培再生體系并與新型育種方法相結合對于茶樹新品種培育具有重要的意義。

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（責任編輯：趙中正）endprint