劉 琳 ， 姜曉文 ， 于文會(huì) ， 辛 秀 ， 喬 路

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江省 哈爾濱 150030)

血竭、乳香、沒藥、白芨和三七等是臨床上治療創(chuàng)傷愈合的常用藥。近年來(lái)此類藥的研究越來(lái)越深入。血竭專入血分，具有活血化瘀、祛腐生肌、止血止痛的作用，是中醫(yī)學(xué)治療皮膚創(chuàng)傷的常用藥物。李丹[1]等研究表明，通過(guò)氯仿、95%乙醇、乙酸乙酯等對(duì)血竭進(jìn)行提純，得到的乙酸乙酯提取物經(jīng)一系列的研究證明，它能促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的增殖，具有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合中再上皮化的作用。賀選玲[2]等通過(guò)龍血竭對(duì)糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)龍血竭外用對(duì)創(chuàng)面愈合的效果要優(yōu)于胰島素外用，同時(shí)可以下調(diào) Smad3、Smad4 的表達(dá)水平。乳香具有活血、止痛、生肌的作用。《本草綱目》中指出，乳香活血，沒藥散血，能增強(qiáng)活血止痛的功效。兩者化學(xué)成分也非常相似，主要含有揮發(fā)油、樹脂和樹膠等。其中，揮發(fā)油具有鎮(zhèn)痛的作用。乳香提取物對(duì)雪旺細(xì)胞增殖起到一定的促進(jìn)作用，更好的發(fā)揮了雪旺細(xì)胞在創(chuàng)傷愈合中神經(jīng)修復(fù)方面的作用[3]。鄭杭生[4]等研究了乳香和沒藥的提取工藝和提取物的鎮(zhèn)痛作用，發(fā)現(xiàn)醇提后增加了揮發(fā)油的鎮(zhèn)痛效果。陳德利[5]等研究白芨、地榆、乳香、沒藥等活血化瘀藥對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞游走的影響，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沒藥在一定濃度時(shí)對(duì)角質(zhì)細(xì)胞的游走有一定的影響，但是乳香對(duì)角質(zhì)細(xì)胞游走的影響不顯著。

當(dāng)皮膚發(fā)生損傷時(shí)，自身會(huì)通過(guò)一系列生物反應(yīng)實(shí)現(xiàn)自我恢復(fù)，該過(guò)程主要包括止血、肉芽組織再生和組織重建3個(gè)步驟[6]，在這個(gè)過(guò)程中有很多細(xì)胞以及細(xì)胞活性因子參與，其中成纖維細(xì)胞在此過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，在早期的傷口愈合過(guò)程中，成纖維細(xì)胞在創(chuàng)口處大量增殖和轉(zhuǎn)移，同時(shí)成纖維細(xì)胞合成和分泌大量的膠原纖維和基質(zhì)成分，與毛細(xì)血管共同形成肉芽組織，填補(bǔ)傷口組織缺損，為表皮細(xì)胞的覆蓋創(chuàng)造條件[7-8]。本次試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)防腐生肌膏對(duì)大鼠皮膚傷口愈合的影響，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 防腐生肌膏的制備 防腐生肌膏由中藥血竭、乳香、沒藥、三七、紫草、黃柏、冰片等組成。具體制備方法如下。首先將血竭和冰片研磨成細(xì)粉，過(guò) 120 目篩。隨后把除血竭、冰片外的其他中藥放入麻油內(nèi)浸泡 48 h。再把浸泡好的藥料倒入鍋加熱至沸，同時(shí)不斷攪拌，改用文火將藥料炸枯，至藥料表面呈現(xiàn)深褐色，內(nèi)部焦黃為止，用紗布將藥渣過(guò)濾，濾液備用。然后將準(zhǔn)備好的凡士林加入濾液中攪拌，待溫度降至 60 ℃，把血竭和冰片的細(xì)粉加入并不斷攪拌，至冷凝為止，滅菌后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動(dòng)物皮膚缺損模型的制備 健康的SD大鼠50只，雌雄各半，體重約200±20 g，常規(guī)飼養(yǎng)一周后開始造模。造模前先用10%犬眠寶麻醉大鼠，然后將麻醉后的大鼠俯臥固定，在其背部正中左右兩側(cè)距脊柱1.5 cm處各選擇一塊 5×5 cm 的完整皮膚，用10%硫化鈉脫毛，生理鹽水洗凈擦干局部消毒，采用自體對(duì)照法，在大鼠背部設(shè)定皮膚右側(cè)為防腐生肌膏組；左側(cè)為空白對(duì)照組，用組織剪在脫毛處剪成一直徑為 2×2 cm 的傷口，深達(dá)肌筋膜，為防止大鼠互相舔蹭、撕咬，動(dòng)物分籠進(jìn)行飼養(yǎng)，并給以充足的水和食物。防腐生肌膏組的創(chuàng)面每天進(jìn)行常規(guī)消毒，涂抹防腐生肌膏，厚度約2 mm；空白對(duì)照組的創(chuàng)面每日常規(guī)消毒，涂抹2%碘酊。

1.3 樣本采集 分別于造模后的第3、7、10、14天，隨機(jī)選取每組各10只大鼠取樣，乙醚麻醉大鼠，用剪刀剪取各組大鼠創(chuàng)面中心至創(chuàng)緣正常皮膚間的新生的肉芽組織，約0.5 cm2，置于-80 ℃冰箱中備用，另取部分同樣的組織置于4%多聚甲醛中固定備用。

1.4 計(jì)算創(chuàng)面愈合率 造模后分別于第3、7、10、14天，觀察創(chuàng)面愈合情況，分別拍照，用ADOBE photoshopcs4計(jì)算出創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-殘余創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%

1.5 計(jì)算創(chuàng)面愈合時(shí)間 分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期觀察，記錄創(chuàng)面愈合時(shí)間。創(chuàng)面愈合時(shí)間是以肉芽完全覆蓋創(chuàng)面為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于達(dá)到創(chuàng)面愈合標(biāo)準(zhǔn)的時(shí)間即為創(chuàng)面愈合時(shí)間。

1.6 計(jì)算創(chuàng)面愈后瘢痕面積 造模后第30天，對(duì)各組大鼠剪毛，對(duì)愈后創(chuàng)面拍照，用ADOBE photoshopcs4計(jì)算創(chuàng)面愈后瘢痕面積。

1.7 創(chuàng)面肉芽組織學(xué)觀察 將上述采集的樣本置于4%多聚甲醛中，進(jìn)行常規(guī)修塊，流水沖洗過(guò)夜，脫水透明后，用石蠟包埋，連續(xù)切片，其中部分用于H.E.染色，另外一部分烘干后保存?zhèn)溆谩＿M(jìn)行脫蠟放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ 10 min；進(jìn)入濃度分別為95%、80%、70%酒精中，輕輕上下進(jìn)出5～6次；用流水沖洗5 min；蒸餾水沖洗5 min，放入蘇木素20 min，自來(lái)水沖洗片刻；1%鹽酸酒精中不斷搖動(dòng)只切片變色后迅速放入流水中10～20 min；放入 0.5%伊紅中10 min，水洗片刻；放入濃度分別為70%、80%、95%酒精中，各5 min；放入無(wú)水酒精Ⅰ、Ⅱ 10 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ 5 min；用樹膠封片進(jìn)行H.E.染色，用普通光鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 防腐生肌膏加速創(chuàng)面愈合 創(chuàng)傷后第3天，大鼠背部?jī)蓚?cè)創(chuàng)面均已開始結(jié)痂，收縮不明顯。創(chuàng)傷后第7天，防腐生肌膏側(cè)創(chuàng)面愈合程度明顯好于對(duì)照側(cè)，創(chuàng)面平整。創(chuàng)傷后第10天，防腐生肌膏側(cè)部分結(jié)痂已經(jīng)完全脫落，并且創(chuàng)緣周圍已有被毛覆蓋。創(chuàng)傷后第14天，大鼠背部?jī)蓚?cè)創(chuàng)口已被新生表皮覆蓋，創(chuàng)口收縮明顯，防腐生肌膏側(cè)創(chuàng)面面積明顯小于對(duì)照側(cè)，說(shuō)明防腐生肌膏能顯著促進(jìn)創(chuàng)面愈合，結(jié)果見表1。

表1 兩側(cè)對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合率的影響 (%)

注：右上角標(biāo)的不同數(shù)字，1)代表差異極顯著(P<0.01);2)代表差異顯著(P<0.05)，下表同

2.2 防腐生肌膏對(duì)創(chuàng)面愈合時(shí)間的影響 防腐生肌膏側(cè)的平均創(chuàng)面愈合時(shí)間極顯著低于空白對(duì)照側(cè)，說(shuō)明防腐生肌膏能極顯著的縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間(P<0.01)，加快創(chuàng)傷愈合，結(jié)果見表2。

表2 兩側(cè)對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間的影響

圖1 兩側(cè)創(chuàng)面組織學(xué)切片圖 (H.E.染色×100)

(A1):對(duì)照側(cè)第1天創(chuàng)面肉芽組織觀察； (A2):防腐生肌膏側(cè)第1天創(chuàng)面肉芽組織觀察； (B1):對(duì)照側(cè)第3天創(chuàng)面肉芽組織觀察； (B2):防腐生肌膏側(cè)第3天創(chuàng)面肉芽組織觀察； (C1):對(duì)照側(cè)第7天創(chuàng)面肉芽組織觀察； (C2):防腐生肌膏側(cè)第7天創(chuàng)面肉芽組織觀察； (D1):對(duì)照側(cè)第10天創(chuàng)面肉芽組織觀察； (D2):防腐生肌膏側(cè)第10天創(chuàng)面肉芽組織觀察； (E1):對(duì)照側(cè)第14天創(chuàng)面肉芽組織觀察； (E2):防腐生肌膏側(cè)第14天創(chuàng)面肉芽組織觀察

2.3 防腐生肌膏對(duì)創(chuàng)傷愈合后的瘢痕面積的影響

防腐生肌膏側(cè)愈后瘢痕面積極顯著小于空白對(duì)照側(cè)愈后瘢痕面積(P<0.01)，說(shuō)明防腐生肌膏能極顯著減小愈后瘢痕面積，結(jié)果見表3。

表3兩側(cè)對(duì)大鼠預(yù)后瘢痕面積的影響

組別預(yù)后瘢痕面積/cm2防腐生肌膏側(cè)0.1123±0.02641)空白對(duì)照側(cè)0.1878±0.0240

2.4 創(chuàng)面肉芽組織學(xué)觀察 圖1中H.E.染色結(jié)果顯示，創(chuàng)傷后第1天，炎癥反應(yīng)明顯，對(duì)照側(cè)和防腐生肌膏側(cè)創(chuàng)面表皮缺失，真皮水腫，內(nèi)有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死組織及出血，毛囊水腫(見圖A1和A2)；創(chuàng)傷后第3天，對(duì)照側(cè)可見有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及出血(見圖B1)。防腐生肌膏側(cè)創(chuàng)面局部表皮下輕度出血，皮下組織和筋膜內(nèi)有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí)可見成纖維細(xì)胞增生，炎性細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照側(cè)少(見圖B2)；創(chuàng)傷后第7天，對(duì)照側(cè)創(chuàng)面有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少量血管和成纖維細(xì)胞增生(見圖C1)。防腐生肌膏側(cè)創(chuàng)面可見真皮內(nèi)成纖維細(xì)胞和小血管大量增生，并有大量嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷部位表皮開始結(jié)痂(見圖C2)；創(chuàng)傷后第10天，對(duì)照側(cè)創(chuàng)面可看到肌成纖維細(xì)胞變性壞死，少量成纖維細(xì)胞和小血管增生(見圖D1)。防腐生肌膏側(cè)創(chuàng)面可見大量成纖維細(xì)胞和小血管增生，嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肉芽組織大量生長(zhǎng)，痂皮開始脫落(見圖D2)；創(chuàng)傷后第14天，對(duì)照側(cè)創(chuàng)面可看到有少量肉芽組織生長(zhǎng)(見圖E1)。防腐生肌膏側(cè)創(chuàng)面真皮內(nèi)膠原纖維消失，成纖維細(xì)胞和小血管大量增生(見圖E2)。結(jié)果見圖1。

3 討論

皮膚愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括了大量的細(xì)胞活動(dòng)和分子活動(dòng)，最初的炎癥階段再到表皮成纖維細(xì)胞增殖和遷移，最后組織進(jìn)行重建[9]。創(chuàng)面愈合率和愈合時(shí)間往往是評(píng)價(jià)創(chuàng)口愈合效果的直接標(biāo)準(zhǔn)。在我們的研究中，應(yīng)用防腐生肌膏后的創(chuàng)口愈合率顯著高于對(duì)照側(cè)，而且在自體對(duì)照中，防腐生肌膏側(cè)在用藥18 d后創(chuàng)口已經(jīng)痊愈，愈合速度遠(yuǎn)快于對(duì)照組，具有顯著性差異。在創(chuàng)傷早期的炎性浸潤(rùn)階段，大量的嗜中性粒細(xì)胞會(huì)向創(chuàng)面遷移，在H.E.染色結(jié)果中顯示，創(chuàng)傷初期都有大量的炎性細(xì)胞，當(dāng)用藥一段時(shí)間后，創(chuàng)面處炎性細(xì)胞明顯減少，而且伴隨更多血管以及肉芽組織的形成。在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中,毛細(xì)血管新生是皮膚創(chuàng)傷愈合的重要條件[10]。因?yàn)槊?xì)血管系統(tǒng)是維持動(dòng)物機(jī)體正常代謝的最基本結(jié)構(gòu),每根毛細(xì)血管供給其周圍一定范圍內(nèi)組織細(xì)胞代謝所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣,并帶走組織的代謝產(chǎn)物,如乳酸。肉芽組織是皮膚創(chuàng)傷纖維修復(fù)的主要組織成分，主要由細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及新生毛細(xì)血管組成[11]。創(chuàng)面肉芽組織的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)歸與創(chuàng)面的愈合有著緊密的聯(lián)系[12]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)證明了防腐生肌膏可以促進(jìn)傷口愈合，并且減少炎癥反應(yīng)。這為臨床上創(chuàng)傷的治療提供了參考和依據(jù)。

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