賓冬梅, 黃河清濤, 易 誠(chéng), 伍渡清, 饒力群

(1.衡陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421008;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128;3.燕京啤酒(衡陽(yáng))有限公司，湖南 衡陽(yáng) 421008)

啤酒糟是啤酒生產(chǎn)的殘留物質(zhì)，主要含有纖維素、淀粉及蛋白質(zhì)[1]等，因含有大量水分則容易產(chǎn)生變質(zhì).目前啤酒企業(yè)絕大部分作為粗飼料銷售，而因?yàn)槔w維含量過(guò)高[2,3]、適口性明顯較差，[4]不能完全被養(yǎng)殖戶接收，很多企業(yè)當(dāng)作廢棄物處置，浪費(fèi)了資源，還污染了環(huán)境[6].為了能夠更高效利用啤酒糟，優(yōu)選出產(chǎn)生纖維素酶的最佳發(fā)酵配伍方案，選定發(fā)酵菌種.

目前，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用于生產(chǎn)纖維素酶的菌種主要有木霉、曲酶等[7-9]，全球纖維素酶市場(chǎng)中的20%是來(lái)自曲霉屬和木霉屬[10-12].該文以一次發(fā)酵的黑曲霉和木霉雙菌發(fā)酵，以料水比為1∶0.5，黑曲霉比木霉接種量為5∶5的混菌接種20%， 32℃下培養(yǎng)3 d的啤酒糟為原料，以粗蛋白含量為考察指標(biāo)，使用酵母菌和枯草芽孢桿菌進(jìn)行第二次混菌發(fā)酵，并通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到啤酒糟第二次發(fā)酵的最佳工藝，生產(chǎn)蛋白啤酒糟飼料，達(dá)到立體開發(fā)啤酒糟的目的.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料

新鮮啤酒糟(燕京啤酒(衡陽(yáng))有限公司提供)

1.1.2 菌種

飼料酵母AS2.1180(Candida utilis)由湖南輕工研究院提供，枯草芽孢桿菌NO.1(Bacillus subtilis)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面(平板)培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基.

種子培養(yǎng)基：酵母菌使用麥芽汁培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(1 L蒸餾水+20 g葡萄糖+15 g蛋白胨+5 g氯化鈉+0.5 g牛肉膏+20 g瓊脂).

發(fā)酵培養(yǎng)基：啤酒槽與麩皮的比例為8∶2.

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

硫酸銨、鹽酸、氫氧化鈉、蛋白胨、瓊脂、硫酸銅、尿素、無(wú)水乙醇，均為分析純

1.1.5 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋、電熱恒溫水槽、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、電子天平、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、電熱恒溫水浴鍋、凱氏定氮儀、冷凍高速離心機(jī)、粗纖維測(cè)定儀、恒溫培養(yǎng)搖床、超凈工作臺(tái)、光照培養(yǎng)箱、高壓滅菌器等.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

斜面孢子的培養(yǎng)：將菌株轉(zhuǎn)接到新鮮的斜面試管，于30℃培養(yǎng)3 d.

種子制備：往250 mL三角瓶中倒入150 mL種子培養(yǎng)基，設(shè)置115℃滅菌16 min，等待冷卻后接入新鮮成熟菌種斜面孢子一環(huán)，在搖床中30℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)3 d.

發(fā)酵培養(yǎng)：取發(fā)酵培養(yǎng)基30 g加入到250 mL的燒杯中，在115℃滅菌15 min后，培養(yǎng)條件為含水量2倍，混菌接種20%，其中黑曲霉比木霉接種量為6∶4，在30℃下培養(yǎng)3 d后，再接種一定量酵母菌和枯草芽孢桿菌，在一定溫度下培養(yǎng)若干天.

1.2.2 蛋白質(zhì)測(cè)定

粗蛋白含量的檢測(cè)，使用飼料中粗蛋白的測(cè)定方法(GB/T 6432-94).[11]

將帶有消化液的管子插入蒸餾裝置，其末端要浸入錐形瓶的吸收液內(nèi)，吸收液用25 mL硼酸，加入2滴混合指示劑，消煮管中加入50 mL氫氧化鈉溶液蒸餾至吸收液體積達(dá)到100 mL，取出錐形瓶，冷凝管末端的蒸餾水沖洗液流入錐形瓶?jī)?nèi).

吸收液的滴定：0.1 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛壹t色.

稱0.5 g蔗糖代替試樣進(jìn)行空白測(cè)定，消耗滴定液(0.1 mol/L鹽酸)的體積不能超過(guò)0.2 mL.

計(jì)算公式：

式中，V2為滴定試樣所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積，mL；V1為滴定空白所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積，mL；C為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；m為試樣質(zhì)量，g；V為試樣分解液總體積，mL；V3為試樣分解液蒸餾用體積，mL；0.0140為每毫克當(dāng)量氮的克數(shù)；6.25為換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù).

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方法

Plackett-Burman設(shè)計(jì)：在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇可能對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)產(chǎn)生的影響因素，包括菌種比、硫酸銨、時(shí)間、尿素、接種量、溫度.為了對(duì)這6個(gè)因素進(jìn)行全面考察，以粗蛋白質(zhì)含量作為響應(yīng)值Y，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)，觀察各因素的主效應(yīng)和交互作用見(jiàn)表1.

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素及水平Tab.1 Design of factors and levels for RSM

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選主要的發(fā)酵影響因素

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，各因素影響的主效益分析見(jiàn)表3.

六股河各河段水質(zhì)差別較大，在53km河段評(píng)價(jià)中，①上游河段水質(zhì)最好，可達(dá)到Ⅱ類水質(zhì)；②中游段一般為Ⅲ、Ⅳ類水質(zhì)；③下游段受工農(nóng)業(yè)及生活污水影響較大，水質(zhì)為Ⅴ類。其中，Ⅱ、Ⅲ類水質(zhì)占評(píng)價(jià)河長(zhǎng)的45%，Ⅳ類水質(zhì)占評(píng)價(jià)河長(zhǎng)的38%，Ⅴ類水質(zhì)占評(píng)價(jià)河長(zhǎng)的17%［3］。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experimental design and result of n=12 Plackett-Burman

表3 各因素影響的主效應(yīng)分析Tab.3 Main effect of factors

從表中可以看出，影響粗蛋白質(zhì)含量的主要因子是溫度、硫酸銨、接種量，三者在α=0.05水平以下，P<0.05，表明對(duì)釀酒酵母和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵啤酒糟的粗蛋白質(zhì)含量有顯著影響(置信度>95%，)，其他因素在α=0.05水平上，P>0.05，表明對(duì)產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量影響不顯著.所以以溫度、硫酸銨、接種量進(jìn)入下一步的響應(yīng)面分析試驗(yàn)[12].

2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面分析：根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選的3個(gè)主要影響因素，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各主要因素的取值水平見(jiàn)表4.

表4 主要影響因素及水平Tab.4 Design of factors and levels for RSM

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以粗蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5.

表5 粗蛋白含量響應(yīng)值的試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Test results of response value of crude protein content

2.3 回歸方程的方差分析

根據(jù)表5的試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò) Minitab軟件處理將各因素回歸擬合后得到回歸方程.回歸方程方差分析見(jiàn)表6.

表6 回歸方程各項(xiàng)的方差分析Tab.6 Anova analysis

2.4 響應(yīng)面直觀分析

從實(shí)驗(yàn)所得特定的響應(yīng)值Y和對(duì)應(yīng)的因素接種量，硫酸銨添加量和溫度構(gòu)成的響應(yīng)面分析圖(見(jiàn)圖1).

圖 1 接種量、硫酸銨添加量和溫度對(duì)啤酒糟發(fā)酵產(chǎn)蛋白含量影響的響應(yīng)面Fig.1 Response surface and contour plots for Inoculation quantity,ammonium sulfate and temperature

選用實(shí)驗(yàn)得到的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)得到的平均粗蛋白含量為43.46%，與理論值相差小于1%，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合很好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性.其對(duì)應(yīng)的最佳條件為溫度33.73℃，接種量16.51%，酵母菌和枯草芽孢桿菌接種量比為5∶1，添加硫酸銨5.00%，尿素添加量2.00%，發(fā)酵時(shí)間4 d，理論粗蛋白質(zhì)含量43.38%.

2.5 各影響因素分析

2.5.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)蛋白質(zhì)的影響

在第二次發(fā)酵中，使培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量增高的是酵母菌的增殖，在前期發(fā)酵中，酵母菌以木霉、曲霉等一次發(fā)酵產(chǎn)生的還原糖類作為碳源，進(jìn)行孢子的萌發(fā)、菌絲的生長(zhǎng)；隨著發(fā)酵的持續(xù)進(jìn)行，培養(yǎng)基中木霉、曲霉等一次發(fā)酵產(chǎn)生的還原糖類逐漸減少，同時(shí)隨著酵母菌體生物量逐漸增加，在發(fā)酵后期由于菌種的老化，反而會(huì)影響啤酒糟中的蛋白質(zhì)含量.

2.5.2 菌液的接種量對(duì)產(chǎn)蛋白質(zhì)的影響

顯然，接種量會(huì)直接影響產(chǎn)酶結(jié)果，接種量過(guò)少，菌種生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間較長(zhǎng)，糖原的消耗增加，后期供酵母發(fā)酵的糖原不足，導(dǎo)致生產(chǎn)效率低； 接種量過(guò)多，前期糖原消耗急劇增加，會(huì)導(dǎo)致后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供不應(yīng)求.

2.5.3 溫度對(duì)產(chǎn)蛋白質(zhì)的影響

溫度是微生物生長(zhǎng)的最重要的影響因素之一.各種菌種都有其最相適宜的生長(zhǎng)溫度.在 0℃以下，菌體生長(zhǎng)緩慢甚至處于休眠狀態(tài)，溫度過(guò)高可能使其生長(zhǎng)繁殖受抑制甚至死亡.混菌發(fā)酵中存在多種菌種，每種菌生長(zhǎng)發(fā)酵的適宜溫度又不盡相同.選擇合適的溫度，使各菌種之間互相補(bǔ)充互相促進(jìn)，既有利于代謝產(chǎn)物的大量累積，又不會(huì)影響微生物自身的生長(zhǎng)代謝.但發(fā)酵溫度過(guò)高，易造成雜菌的感染而影響發(fā)酵.

2.5.4 硫酸銨的添加量對(duì)產(chǎn)蛋白質(zhì)的影響

微生物生長(zhǎng)需要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)， 主要的有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、水分等.從實(shí)驗(yàn)來(lái)看，酵母菌以木霉、曲霉等一次發(fā)酵產(chǎn)生的還原糖類作為碳源，能滿足酵母及枯草芽孢桿菌的孢子的萌發(fā)、菌絲的生長(zhǎng)及發(fā)酵的需要，而氮原明顯不足，因此添加的硫酸銨氮源對(duì)發(fā)酵具有顯著的影響.

2.5.5 不同菌種對(duì)產(chǎn)蛋白質(zhì)的影響

實(shí)驗(yàn)中，使用了兩種不同的酵母菌來(lái)對(duì)啤酒糟進(jìn)行第二次發(fā)酵，啤酒酵母是實(shí)驗(yàn)室優(yōu)選菌種，飼料酵母是在湖南輕工研究院購(gòu)買的優(yōu)質(zhì)菌種，在通過(guò)二次發(fā)酵的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)法后，得到了它們各自的最佳發(fā)酵工藝，從結(jié)果上看，飼料酵母發(fā)酵后，產(chǎn)品粗蛋白含量最高，所以最終實(shí)驗(yàn)采用飼料酵母.

3 結(jié) 論

在以黑曲霉和木霉雙菌一次發(fā)酵的啤酒糟中，分別添加啤酒酵母與枯草芽孢桿菌、飼料酵母與枯草芽孢桿菌進(jìn)行二次混菌發(fā)酵，并利用響應(yīng)面進(jìn)行發(fā)酵條件分析優(yōu)化，結(jié)果表明：以飼料酵母和枯草芽孢桿菌進(jìn)行二次混菌發(fā)酵，其對(duì)應(yīng)的最佳條件為溫度33.73℃，接種量16.51%，酵母菌和枯草芽孢桿菌接種量比為5∶1，添加硫酸銨5.00%，尿素添加量2.00%，發(fā)酵時(shí)間4 d，理論粗蛋白質(zhì)含量43.38%,表明通過(guò)二次混菌發(fā)酵能顯著提高啤酒糟粗蛋白含量.

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