組織工程組織血管化的研究進展

賈智明　郭海林　陳方

組織工程技術(shù)近年來取得了巨大的進步，但是組織工程組織植入體內(nèi)后產(chǎn)生的血管化不足，成為阻礙其臨床應(yīng)用的主要瓶頸之一[1]。血管發(fā)生（Vasculogenesis）和/或血管新生（Angiogenesis）機制，是使構(gòu)建的工程組織和器官內(nèi)及時形成密集有序的血管網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)，是確保其在體內(nèi)存活并發(fā)揮功能的必要條件[2]。由于目前組織工程組織血管化策略的不同，我們將分別進行綜述，并探討今后可能的發(fā)展趨勢。

1　將支架材料特殊處理以促進血管化

將支架材料經(jīng)過特殊處理后，可刺激周圍組織或種子細胞分泌血管生成因子，并募集內(nèi)皮細胞等，以發(fā)揮促血管化的功能[3]。

1.1　人工合成聚合物復(fù)合活性材料以促進血管化

Zhao等[4]發(fā)現(xiàn)，復(fù)合3.0%CuO的硼酸鹽生物活性玻璃微纖維可促進內(nèi)皮細胞遷移、組裝血管和分泌VEGF，并上調(diào)成纖維細胞內(nèi)血管形成相關(guān)基因的表達水平；體內(nèi)實驗證實，這種支架材料可促進全層皮膚缺損的修復(fù)。Qin等[5]將復(fù)合了1%鍶的聚磷酸鈣支架與人牙髓細胞共培養(yǎng)，以聚磷酸鈣支架和羥基磷灰石支架作為對照，發(fā)現(xiàn)實驗組不但可促進牙髓細胞增殖，還可顯著刺激細胞分泌更多的VEGF和bFGF，提示復(fù)合1%鍶的聚磷酸鈣支架在誘導(dǎo)牙齒組織血管化方面具有一定的潛能。由于目前制造技術(shù)和材料本身的限制，如炎癥反應(yīng)、降解產(chǎn)物毒性，人工合成聚合物支架與種子細胞或機體相互作用仍不足，體外尚不能構(gòu)建成熟穩(wěn)定的血管網(wǎng)絡(luò)，需要進一步優(yōu)化。

1.2　改進天然生物材料以促進血管化

天然生物材料有著親近的側(cè)鏈和良好的生物相容性，易與宿主血管網(wǎng)絡(luò)整合。Wang等[6]使用脂肪酸對玉米蛋白多孔支架進行改性處理，體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)其生物相容性較佳，與未處理組相比在支架內(nèi)形成了更為密集的微血管網(wǎng)絡(luò)，纖維化程度輕微。Chan等[7]使用Ⅰ型牛膠原蛋白制作成80μm孔徑的膠原支架，將其環(huán)繞于股動脈周圍，結(jié)果顯示此支架生物相容性較佳，可改善移植細胞的存活率，且支架內(nèi)充滿股動脈分支小血管。有研究發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白和Ⅰ型膠原復(fù)合物的組成比例、硬度和機械刺激可影響血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建[8]。天然生物材料應(yīng)用于組織工程血管化領(lǐng)域存在著自身的局限性，如膠原機械性能較差；纖連蛋白成本太高，機械應(yīng)力過大不利于血管網(wǎng)絡(luò)形成[3]。目前的研究多致力于對天然生物材料進行改良、復(fù)合，或探索新的天然生物材料等，對促進工程組織血管化的影響[9-10]。

1.3　制備人工/天然材料復(fù)合物以促進血管化

大部分人工合成聚合物屬于生物惰性材料，但機械強度較大，重復(fù)性較好；天然生物材料具有良好的生物相容性，為血管形成提供了接近機體的微環(huán)境，但多缺乏機械強度。由兩者復(fù)合形成的支架材料能夠綜合各自的優(yōu)勢并彌補不足，從而更好地促進血管化。Quinlan等[11]將生物活性玻璃/膠原-黏多糖支架用于骨組織工程，體外實驗顯示，生物活性玻璃顆粒直徑為100μm時，可顯著促進支架內(nèi)的內(nèi)皮細胞分泌VEGF，并促進內(nèi)皮細胞成管；同時，該支架可促進成骨細胞的增殖和成骨作用。Koc等[12]以殼聚糖/羥基磷灰石復(fù)合支架構(gòu)建組織工程化骨組織，同樣取得了不錯的效果。

1.4　使用脫細胞基質(zhì)促進血管化

脫細胞基質(zhì)含有組織特異性的血管網(wǎng)絡(luò)骨架和活性細胞因子，通過內(nèi)皮細胞再覆蓋可形成功能性的血管通道。Gálvez-Montón等[13]將人心包來源的脫細胞基質(zhì)覆蓋于梗死心肌上方，30 d后脫細胞基質(zhì)內(nèi)可見微血管網(wǎng)絡(luò)和神經(jīng)纖維新生，同時左心室射血分數(shù)和心輸出量等心功能指標顯著改善，梗死面積顯著縮小。Iyyanki等[14]將復(fù)合脂肪干細胞的脫細胞真皮基質(zhì)用于修補大鼠腹壁疝，術(shù)后4周時復(fù)合脂肪干細胞可顯著增加微血管密度和機械強度。脫細胞基質(zhì)可在全器官組織工程領(lǐng)域發(fā)揮其獨特的優(yōu)勢，值得進一步研究[15]。

1.5　應(yīng)用3D打印技術(shù)構(gòu)建含血管通道的特殊支架

3D打印技術(shù)是在斷層掃描的基礎(chǔ)上，通過計算機模擬出立體形態(tài)，并最終完成立體形態(tài)重建的新興技術(shù)。使用3D打印技術(shù)可精確地、個性化地定制靶組織或器官、含有血管通道的支架，以促進工程組織的血管化。Li等[16]使用3D打印技術(shù)構(gòu)建磷酸鈣骨水泥復(fù)合介孔二氧化硅支架，具有特定的孔隙結(jié)構(gòu)，可優(yōu)化硅離子的釋放，在植入體內(nèi)早期可促進周圍血管的長入。Bertassoni等[17]以瓊脂糖為基本結(jié)構(gòu)，使用異丁烯酸酯凝膠、聚乙二醇酯和二甲基丙烯酸構(gòu)建了一種含有微血管通道的支架，微血管通道可完成細胞物質(zhì)交換，提供細胞生長空間，支持內(nèi)皮細胞的黏附、增殖等。但是，由于原材料的選擇有限、制作時間較長、打印分辨率較低等原因，目前使用3D打印制作的支架和血管通道在生物相容性、血管支撐力、血管樹形成等方面尚不盡如人意，需要進一步改進。

2　添加血管生成相關(guān)細胞以促進血管化

血管生成相關(guān)細胞包括：①直接相關(guān)細胞，包括內(nèi)皮細胞、周細胞和血管平滑肌細胞等；②間接相關(guān)細胞，包括內(nèi)皮祖細胞（Endothelial progenitor cell，EPC）、間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cell，MSC）和誘導(dǎo)多能干細胞（Induced pluripotent stem cell，iPSC）等，此類細胞可通過旁分泌促血管生成因子或直接分化為內(nèi)皮細胞的方式促進血管化。為促進工程組織血管化，將支架材料復(fù)合血管生成相關(guān)細胞是一種可行的策略[18-19]。Buitinga等[20]將胰島細胞復(fù)合hBMSC和臍靜脈內(nèi)皮細胞植入裸鼠皮下，與不含內(nèi)皮細胞的對照組相比，其形成的組織微血管密度更高，可能是hBMSC和內(nèi)皮細胞相互作用，而分泌了大量VEGF、bFGF等血管生成因子。因為內(nèi)皮細胞來源較為局限，多取材于大動脈或者臍靜脈，增殖能力較差，且有研究發(fā)現(xiàn)單用內(nèi)皮細胞在體內(nèi)并不能形成成熟穩(wěn)定的血管網(wǎng)絡(luò)。另外，由于干細胞分化為成熟內(nèi)皮細胞的技術(shù)尚不成熟，EPC被認為是替代內(nèi)皮細胞的理想選擇[21]。Zigdon-Giladi等[22]將復(fù)合人外周血EPC的β-磷酸鈣材料植入顱蓋骨再生裸鼠模型，發(fā)現(xiàn)形成的新生骨組織血管密度高于單純β-磷酸鈣材料組7.5倍。人外周血EPC可分化為成熟的內(nèi)皮細胞，并形成微血管網(wǎng)絡(luò)與周圍的宿主血管相連接。脂肪微血管片段（Microvascular fragment）的發(fā)現(xiàn)也為組織工程血管化提供了新的細胞來源[23]，微血管片段不僅可釋放血管生成因子（A ngiogenic factor，AF），而且含有許多脂肪干細胞和EPC，其中的脂肪干細胞相對于使用傳統(tǒng)方法得到的脂肪干細胞具有更強的分化和促血管生成能力[24]。微血管片段具有正常的血管形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，含有中央腔，周圍包繞有內(nèi)皮細胞和壁細胞，僅需要相互連接便可形成微血管網(wǎng)絡(luò)，可大大縮短血管化所需時間[23]。有研究將微血管片段應(yīng)用于肌肉和骨組織工程，取得了較好的血管化效果[25-26]。工程組織血管化需要多種細胞參與，最近的研究發(fā)現(xiàn)，周細胞、血管平滑肌細胞對于新生血管的穩(wěn)定和功能化非常重要，且不同動、靜脈或者不同組織器官的內(nèi)皮細胞存在形態(tài)學(xué)和功能學(xué)差異，應(yīng)在后續(xù)研究中加以注意[3]。

3　添加血管生成因子或采用基因修飾方法以促進血管化

應(yīng)用AF包被，或與支架材料共價結(jié)合，是促進工程組織血管化的常用策略。Kim等[27]將VEGF包被于介孔二氧化硅納米微粒，然后將其融合于Ⅰ型膠原海綿構(gòu)建復(fù)合支架，體外檢測VEGF可持續(xù)釋放超過28 d。雞胚絨毛尿囊膜實驗顯示，該復(fù)合支架與未添加VEGF的支架相比，可誘導(dǎo)更多的血管生成。然而，單一的AF通常并不能有效誘導(dǎo)形成成熟的血管網(wǎng)絡(luò)，可能會導(dǎo)致血管瘺、出血等并發(fā)癥。血管生成是一系列血管生成因子復(fù)雜調(diào)控的動態(tài)過程，且不同的AF在血管生成過程中的作用及作用靶點不同，因此聯(lián)合有序地應(yīng)用多種AF非常關(guān)鍵[28-30]。Jiang等[31]將包被有VEGF和bFGF納米微球的膀胱脫細胞基質(zhì)用于膀胱缺損修補，結(jié)果顯示實驗組可顯著改善新生膀胱組織攣縮現(xiàn)象，且新生組織的尿路上皮細胞、肌細胞排列情況，以及微血管密度和成熟度均優(yōu)于單獨應(yīng)用VEGF或bFGF組。由于不同AF的藥物釋放動力學(xué)不盡相同，為了達到最佳的促血管化效果，目前AF的釋放方式有待精細調(diào)控。此外，尚不清楚不同AF組合應(yīng)用，對促血管化的效果，有待進一步的研究探討。

基因修飾有利于促血管生成相關(guān)基因的長期穩(wěn)定表達。Zhang等[32]將編碼Hif-1的腺病毒載體復(fù)合明膠海綿，治療牙槽骨缺損大鼠模型，體外檢測Hif-1可持續(xù)釋放21 d，與對照組相比，可顯著誘導(dǎo)新生骨形成和血管生成。Zeng等[33]將轉(zhuǎn)染miRNA-210的慢病毒載體立體定位注射至小鼠大腦，與未轉(zhuǎn)染組小鼠相比，實驗組內(nèi)皮細胞增殖速度、新形成的微血管數(shù)目顯著增加。通過基因修飾進行血管生成因子的時間和空間調(diào)控是一個非常具有前景的血管化策略，但可能存在致癌風(fēng)險，需要細胞篩選和精細調(diào)控，以使得釋放的AF維持在理想水平，且需要長期隨訪，觀察血管生成之后AF的繼續(xù)釋放對新生血管的影響[2]。

4　預(yù)血管化方法以促進工程組織的血管化

預(yù)血管化是在上述三種血管化策略基礎(chǔ)上，在移植靶位置之前存在特定的體外或體內(nèi)孵育血管網(wǎng)絡(luò)的階段。預(yù)血管化策略包括體外和體內(nèi)兩種途徑。體外途徑主要指在體外培養(yǎng)血管生成相關(guān)細胞，形成微血管網(wǎng)絡(luò)后進行體內(nèi)移植。體內(nèi)途徑指將構(gòu)建的工程組織先植入宿主體內(nèi)血管豐富的部位，使得周圍血管長入組織，然后再將組織移植靶位置。

4.1　體外構(gòu)建預(yù)血管化的工程組織

在體內(nèi)移植之前，將內(nèi)皮細胞等血管生成相關(guān)細胞植入支架材料，然后在特定的體外環(huán)境下孵育微血管網(wǎng)絡(luò)，以縮短工程組織移植體內(nèi)后血管網(wǎng)絡(luò)形成的時間[21]。有研究將內(nèi)皮細胞與其他細胞共培養(yǎng)構(gòu)建細胞微球，經(jīng)短期體外孵育即可形成含有密集微血管網(wǎng)絡(luò)的工程組織[34]。與單細胞相比，細胞微球含有更為緊密的細胞間聯(lián)系和細胞-細胞外基質(zhì)聯(lián)系，具有更強的分化潛能，更能耐受缺氧環(huán)境，并具有更強的促血管化能力[21]。Sakaguchi等[35]將3層心肌細胞-內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)細胞片反復(fù)疊加于灌注有培養(yǎng)基的微通道膠原凝膠上方，其中的內(nèi)皮細胞可組裝成微血管并向膠原凝膠內(nèi)遷移，與膠原凝膠內(nèi)的微通道建立連接，肉眼可見通過疊加細胞片構(gòu)建的工程心肌組織同步收縮。Zhang等[36]利用微通道技術(shù)，構(gòu)建含有可灌注微血管的心肌組織，并可與大鼠股動靜脈通過手術(shù)吻合。近年來，隨著微流控、大規(guī)模生物反應(yīng)器等新技術(shù)的迅速發(fā)展，在體外構(gòu)建復(fù)雜有序的微血管網(wǎng)絡(luò)正逐漸變成可能[37]。

4.2　體內(nèi)構(gòu)建含軸心血管的工程組織

體內(nèi)預(yù)血管化以往常采用的方法是將支架置入體內(nèi)血供豐富和容易操作的位置，如皮下或者肌肉“口袋”。盡管上述方法可使構(gòu)建的組織血管化，但其移植到靶位置后仍需要較長時間與宿主血管連通，可能會造成細胞缺血死亡。因此，新的體內(nèi)預(yù)血管化策略相繼出現(xiàn)，如動靜脈環(huán)路、含軸心血管的組織瓣技術(shù)等[21]。Tatara等[38]將聚甲基丙烯酸甲酯小室固定于肋骨膜上，室內(nèi)填充成骨材料；在小室內(nèi)骨組織新生的同時，骨膜血管網(wǎng)通過出芽方式長入新生骨組織內(nèi)，從而獲得血管化的骨組織。由于肋骨膜血管網(wǎng)與鄰近的肋間動靜脈相互連通，從而構(gòu)建出以肋間動靜脈為軸心血管的游離骨組織瓣，并成功地以此進行了下頜骨缺損修復(fù)。上述策略可使工程組織血管與靶點附近血管吻合，移植后可立即形成血流灌注。Kaempfen等[39]將種植有B MSC的脫細胞骨基質(zhì)分別以3種方式修補兔節(jié)段性肱骨缺損模型：①直接原位移植；②被以腋動脈分支血管為軸心血管的肌肉瓣包裹后島狀移植至缺損處；③被以腋動脈分支為軸心血管的肌肉瓣包裹并體內(nèi)孵育6周，然后再島狀移植至缺損處。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用第3種方式構(gòu)建的工程骨組織血管密度明顯高于另兩種。體內(nèi)預(yù)血管化需較長時間才能實現(xiàn)最初的血管化，并可能導(dǎo)致機體創(chuàng)傷，微創(chuàng)、簡便、有效地體內(nèi)預(yù)血管化是將來的研究方向。

5　展望

組織工程組織血管化已經(jīng)取得了積極的進展，但對于較厚的復(fù)雜組織器官，血管化不足仍是亟待解決的難題。為實現(xiàn)工程組織及器官的充分血管化，單純地依賴一種血管化策略效果較差，根據(jù)不同的靶向器官組織，個性化地聯(lián)合應(yīng)用多種血管化策略可能是今后的發(fā)展趨勢[3，21，40]。此外，今后還需通過長期觀察以探討新生血管的轉(zhuǎn)歸，從而驗證其有效性和安全性。iPSC、脂肪微血管片段、細胞片技術(shù)、微流控技術(shù)等的應(yīng)用，為工程化組織的血管化研究提供了新的工具[21]。非編碼RNA、炎癥反應(yīng)和血管生成主調(diào)控因子（如低氧誘導(dǎo)因子-1的調(diào)控）可能是影響工程組織血管化的主要機制，為組織工程血管化提供了理論基礎(chǔ)[41]。血管化的基礎(chǔ)是內(nèi)皮細胞、壁細胞等血管生成細胞的組裝成管、穩(wěn)定成熟，關(guān)鍵是細胞因子等微環(huán)境因素的調(diào)控。由于目前工程技術(shù)和細胞技術(shù)的限制，尚無理想的解決辦法，借助于體內(nèi)軸心血管、利用體內(nèi)微環(huán)境孵育血管化，或許是目前最佳的解決辦法。隨著工程學(xué)、生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等的密切合作和血管化策略的不斷進展，相信不久組織工程血管化不足的難題將會得到解決。

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