曾 立，耿 歡，邢更彥

骨質(zhì)疏松癥是一種由于骨形成和骨吸收的負(fù)相平衡導(dǎo)致骨骼脆弱，以骨量減少與骨的微觀結(jié)構(gòu)破壞為特點(diǎn)并增加了骨折風(fēng)險(xiǎn)為特征的疾病[1]。中國已進(jìn)入老齡社會(huì)，隨著老年人口比例的增加和人均壽命的延長，骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率逐年提升。骨質(zhì)疏松性骨折是骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的后果，也是導(dǎo)致中老年人殘疾并喪失自理能力最常見的原因之一[2]。

骨質(zhì)疏松癥與破骨細(xì)胞數(shù)量增多和骨吸收活性的增強(qiáng)有密切聯(lián)系[3]，破骨細(xì)胞是骨組織中由單核巨噬細(xì)胞分化來的、特殊的，且唯一具有吞噬骨組織功能的多核巨細(xì)胞[4,5]，因此，對(duì)破骨細(xì)胞的研究非常重要。簡捷快速獲取破骨細(xì)胞是進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)的前提，然而，破骨細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞，無法傳代，在體外存活時(shí)間短，獲取相對(duì)困難[6]。目前，科研人員主要用RAW 264.7細(xì)胞與骨髓源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs）來誘導(dǎo)破骨細(xì)胞。RAW 264.7細(xì)胞是小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞，BMMs是骨髓來源的巨噬細(xì)胞[7]，RAW 264.7是較BMMs更晚期分化階段的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞[8]，兩者誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的效率與誘導(dǎo)出破骨細(xì)胞的功能是否有差異還需深入研究。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7與BMMs在核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）的誘導(dǎo)下生成破骨細(xì)胞數(shù)量與骨吸收功能的差異，以研究RAW 264.7細(xì)胞是否可替代BMMs用于誘導(dǎo)破骨細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 α-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（Sigma公司，美國）；CD11b抗體（Abcam，英國）；RANKL、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colonystimulating factor，M-CSF）（R&D公司，美國）；鬼筆環(huán)肽染色液（Invitrogen，美國）；25 cm2培養(yǎng)瓶、24孔骨細(xì)胞培養(yǎng)板（康寧，美國）；紅細(xì)胞裂解液（上海碧云天）；熒光倒置顯微鏡（奧林巴斯，日本）；4周雄性C57BL/6小鼠（購自北京維通利華）；RAW 264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞（購自北京協(xié)和細(xì)胞庫）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠BMMs的提取與培養(yǎng) 4周雄性C57BL/6小鼠麻醉后脫臼處死，75%乙醇浸泡5 min，于超凈臺(tái)中取出股骨與脛骨，剪去干骺端，用5 ml注射器抽取無菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗骨髓腔，動(dòng)作輕柔，直至沖出的PBS由淡紅色變?yōu)橥噶恋陌咨Ｊ占瘺_洗液離心（200×g，3 min），棄上清；沉淀加入5倍體積紅細(xì)胞裂解液，于冰上裂解10 min，離心（200×g，3 min），棄上清；沉淀用α-MEM培養(yǎng)基重懸，離心（200×g，3 min），棄上清；5 mlα-MEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青鏈霉素）重懸沉淀；接種至25 cm2培養(yǎng)瓶，每毫升α-MEM完全培養(yǎng)基加入30 ng M-CSF，置于CO2培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)[9]，3 d后對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 小鼠單核細(xì)胞的CD11b免疫熒光鑒定 將上步所得貼壁細(xì)胞懸液接種至激光共聚焦培養(yǎng)皿；加入1 ml含有30 ng/ml M-CSF的α-MEM完全培養(yǎng)基，第2天細(xì)胞貼壁良好后，去除培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗2遍，0.1% Triton-100通透10 min，PBS漂洗2遍，3%牛血白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉1 h，PBS漂洗2遍，陽性組加入500 μl稀釋好的CD11b抗體，陰性對(duì)照組加入500 μl正常兔IgG抗體。4 ℃孵育過夜后PBS漂洗3遍，10 min/次，加入500 μl綠色熒光二抗室溫孵育2 h，PBS洗3遍，10 min/次，加入500 μl Hoechst染色10 min后，激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖片。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 破骨細(xì)胞的誘導(dǎo) BMMs細(xì)胞懸液（5×103/cm2）接種至48孔板中，每孔加入500 μlα-MEM完全培養(yǎng)基（含M-CSF，20 ng/ml；RANKL，20 ng/ml）誘導(dǎo)，每2 d換液，4 d后可見破骨細(xì)胞。以5×103/cm2的密度將RAW 264.7細(xì)胞接種于48孔板中，每孔加入500 μl DMEM高糖完全培養(yǎng)基（含RANKL，20 ng/ml）誘導(dǎo)，每2 d換液，4 d后進(jìn)行TRAP染色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 破骨細(xì)胞的TRAP染色 BMMs及RAW 264.7細(xì)胞用上述方法誘導(dǎo)后，兩種細(xì)胞分別設(shè)立對(duì)照組與誘導(dǎo)組，對(duì)照組不加RANKL。誘導(dǎo)4 d后，去除原培養(yǎng)基，PBS漂洗2遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗2遍，0.1%Triton-100通透10 min，PBS漂洗2次，加入TRAP染色液；避光37℃孵育1 h，PBS洗2遍，肉眼可見孔內(nèi)細(xì)胞被染為酒紅色，顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 破骨細(xì)胞纖維肌動(dòng)蛋白環(huán)的熒光染色 BMMs及RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)RANKL誘導(dǎo)4 d后，去除原培養(yǎng)基，PBS漂洗2次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS漂洗2遍，0.1% Triton-100通透10 min，PBS漂洗2次，鬼筆環(huán)肽染色20 min，PBS漂洗2遍，Hoechst染色10 min，PBS漂洗2遍，熒光顯微鏡下采集照片。

1.2.6 破骨細(xì)胞骨吸收功能檢測 BMMs及RAW 264.7細(xì)胞以5×103/cm2的密度接種于24孔骨細(xì)胞培養(yǎng)板，均設(shè)對(duì)照組與誘導(dǎo)組，用上述方法誘導(dǎo)，對(duì)照組不加RANKL。每2 d換液，4 d后移除培養(yǎng)液，用去離子水漂洗2遍，加入4%次氯酸鈉漂洗5 min；去離子水漂洗2遍，室溫晾干，普通倒置顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMMs表面抗原CD11b的鑒定 骨髓原始細(xì)胞經(jīng)M-CSF刺激培養(yǎng)后，表面CD11b抗體檢測顯示：陽性組幾乎所有的細(xì)胞均被染成了綠色，藍(lán)色為細(xì)胞核，陰性對(duì)照組未被染上綠色，證實(shí)原始細(xì)胞經(jīng)M-CSF刺激后所得的細(xì)胞是BMMs，見圖1。

圖1 CD11b在BMMs中的表達(dá)（標(biāo)尺=10 μm）

2.2 破骨細(xì)胞的TRAP染色結(jié)果 RAW 264.7細(xì)胞與BMMs誘導(dǎo)4 d后出現(xiàn)大量圓形、橢圓形體積巨大細(xì)胞，行TRAP染色可見為酒紅色（TRAP陽性）的多核巨細(xì)胞，有的核可達(dá)上百個(gè)，對(duì)照組未見TRAP陽性的多核巨細(xì)胞，見圖2。即RAW 264.7細(xì)胞與BMMs均可誘導(dǎo)出大量TRAP陽性的破骨細(xì)胞，結(jié)果顯示，BMMs與RAW 264.7細(xì)胞誘導(dǎo)出的破骨細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 RAW 264.7細(xì)胞與BMMsTRAP染色（標(biāo)尺 =100 μm）

2.3 破骨細(xì)胞纖維肌動(dòng)蛋白環(huán)的熒光染色 誘導(dǎo)4 d后紅色鬼筆環(huán)肽染色顯示，RAW 264.7細(xì)胞與BMMs經(jīng)過誘導(dǎo)均出現(xiàn)形成纖維肌動(dòng)蛋白環(huán)的成熟破骨細(xì)胞，復(fù)染Hoechst可見細(xì)胞內(nèi)有大量的藍(lán)色細(xì)胞核，有的可達(dá)上百個(gè)，統(tǒng)計(jì)分析后兩種細(xì)胞誘導(dǎo)出的具有纖維肌動(dòng)蛋白環(huán)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖3 RAW 264.7細(xì)胞與BMMs紅色鬼筆環(huán)肽染色（標(biāo)尺 =100 μm）

2.4 破骨細(xì)胞的骨板吸收結(jié)果 RAW 264.7細(xì)胞與BMMs在24孔骨細(xì)胞培養(yǎng)板中誘導(dǎo)4 d后，可見大量圓形、橢圓形、不規(guī)則形的白色吸收瘢痕，對(duì)照組未見吸收瘢痕；RAW 264.7細(xì)胞與BMMs誘導(dǎo)出的破骨細(xì)胞在骨細(xì)胞培養(yǎng)板上的吸收瘢痕差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

3 討 論

圖4 RAW 264.7細(xì)胞與BMMs經(jīng)RANKL誘導(dǎo)后的骨吸收結(jié)果（標(biāo)尺=100 μm）

長期以來多數(shù)研究人員認(rèn)為骨的生理平衡主要是通過內(nèi)分泌系統(tǒng)來調(diào)節(jié)的，但研究表明，免疫系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)在骨生理平衡的調(diào)節(jié)過程中起著重要作用[10,11]。成骨細(xì)胞的骨形成與破骨細(xì)胞的骨吸收維持著骨組織的穩(wěn)態(tài)，打破這種穩(wěn)態(tài)會(huì)導(dǎo)致骨代謝性紊亂疾病如骨質(zhì)疏松癥[12]、骨硬化病等。破骨細(xì)胞是由單核巨噬細(xì)胞融合而來[13]，是骨組織中唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞，研究破骨細(xì)胞對(duì)發(fā)現(xiàn)藥物的新靶點(diǎn)具有重要意義。M-CSF與RANKL是破骨細(xì)胞分化與成熟過程中最重要的兩個(gè)細(xì)胞因子[4]，用M-CSF與RANKL可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞[14]。M-CSF促進(jìn)單核細(xì)胞的增殖與細(xì)胞骨架的形成，RANKL是破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，其與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞上RANK受體結(jié)合后，募集下游的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6結(jié)合到RANK在胞內(nèi)的特殊結(jié)構(gòu)域[14,15]，激活向破骨細(xì)胞分化的信號(hào)通路，如MAPKs與NF-κB信號(hào)通路[16]，激活轉(zhuǎn)錄因子NFATC1，最終引起破骨細(xì)胞分化[17]。

BMMs是骨髓源巨噬細(xì)胞，CD11b是巨噬細(xì)胞的特殊表面標(biāo)記[18]，表達(dá)CD11b的巨噬細(xì)胞可經(jīng)RANKL誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞[7]，通過CD11b免疫熒光鑒定骨髓原始細(xì)胞經(jīng)M-CSF刺激獲得的貼壁細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。研究證實(shí)，BMMs可經(jīng)M-CSF與RANKL誘導(dǎo)為成熟的破骨細(xì)胞[15]，而RAW 264.7細(xì)胞是小鼠單核巨噬細(xì)胞系，只需RANKL刺激即可分化為破骨細(xì)胞[3]。二者是體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的主要細(xì)胞來源，但在破骨分化的效率及破骨細(xì)胞的活性差異方面研究較少。

RAW 264.7細(xì)胞與BMMs誘導(dǎo)破骨細(xì)胞需要4 d[19]，且在誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的過程中，影響其生成效率的最關(guān)鍵因素不是RANKL的濃度，而是破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的接種密度[13,19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RAW 264.7細(xì)胞與BMMs經(jīng)20 ng/ml RANKL誘導(dǎo)4 d后均出現(xiàn)TRAP陽性與纖維肌動(dòng)蛋白環(huán)形成的成熟多核破骨細(xì)胞，同時(shí)兩種細(xì)胞誘導(dǎo)出的破骨細(xì)胞骨吸收活性均較好。RAW 264.7細(xì)胞與BMMs誘導(dǎo)破骨細(xì)胞效率與時(shí)間無差異，且破骨細(xì)胞的骨吸收能力也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但BMMs獲取繁瑣，純化困難且需M-CSF刺激，耗時(shí)費(fèi)力，RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)簡單且只需要RANKL就可誘導(dǎo)出大量的破骨細(xì)胞。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)RAW 264.7細(xì)胞與BMMs向破骨細(xì)胞分化的特性無明顯差異，但鑒于RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)簡單且易于誘導(dǎo)出大量破骨細(xì)胞，筆者認(rèn)為可以用其替代BMMs誘導(dǎo)破骨細(xì)胞。

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