徐 晶，程文健，金 紅，陳麗嬌，梁 鵬

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002）

0 引言

膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的一種結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于動物的皮、軟骨，肌腱、韌帶和其他結(jié)締組織中。天然膠原蛋白由于其不溶于水，因此難以用于制備膠原蛋白膜，制備膠原蛋白膜的通常是天然膠原的酸溶、堿溶或酶提取的可溶膠原蛋白[1]。與許多生物大分子一樣，膠原蛋白具有良好的成膜能力，所形成的膠原蛋白膜因為具有良好的生物相容性、低抗原性、易降解性、較好的機械性能和一定阻隔性等功能特性而廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日用化妝品等領(lǐng)域[2]。如在食品行業(yè)可用作香腸腸衣和各種食品的可食用包裝袋，在醫(yī)藥行業(yè)則可作為敷料，促進傷口愈合，也可以用作藥物的載體等。此外，還可以作為重要的保濕成分添加到各種化妝品中[3]。與利用石化產(chǎn)品的人工合成膜相比，膠原蛋白膜也存在一定的缺陷，如抗拉強度低等，其中最突出的問題是其熱穩(wěn)定性差、親水性強，容易因為環(huán)境溫度、濕度的變化導(dǎo)致膜的機械性能、阻濕性和透氣性發(fā)生改變。導(dǎo)致膜的物理化學(xué)和生物學(xué)功能特性變差，這成為限制膠原蛋白膜應(yīng)用的最大障礙[1，4]。

對膠原蛋白膜改性是提高膠原蛋白膜性能的最主要手段，通過改性可以增強膠原蛋白膜材料某些特定性能，使其滿足不同應(yīng)用的需要，拓寬其應(yīng)用范圍。綜合國內(nèi)外近年來在膠原蛋白膜材料性能改善的研究報道，針對主要的物理改性、化學(xué)改性和酶法改性方法及其效果手段進行闡述。

1 物理改性

膠原蛋白膜的物理改性方法主要有熱處理、紫外線照射和γ-射線輻照處理等。

1.1 熱處理

膠原成膜溶液進行一定程度的熱處理可以改善膠原蛋白膜的性能。郭興鳳等人[5]用酶法制備的膠原配制成鑄膜液，考查了熱處理溫度對膠原蛋白膜力學(xué)性能的影響，發(fā)現(xiàn)在30～50℃時，隨著溫度的升高，所得膠原蛋白膜的抗張強度不斷升高，斷裂伸長率也有所提高。當(dāng)溫度超過50℃，由于膠原蛋白變性不利于形成均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，膠原蛋白膜的抗張強度開始下降。張琳琳等人[6]在42℃條件下對羅非魚皮酸溶性膠原溶液進行熱處理。結(jié)果表明，隨著熱處理時間的延長，膠原蛋白膜的抗拉伸強度從30.81 MPa增加至41.33 MPa，斷裂延伸率從8.95%增加至11.59%，透明度值從2.42增加至3.33，這可能是由于天然膠原受熱變性后，膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則線圈狀，在成膜時更容易纏繞在一起形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的緣故。從以上研究可以看出熱處理雖然提高了膜的機械強度，但也導(dǎo)致膠原蛋白的變性和二級結(jié)構(gòu)的改變，因此可能導(dǎo)致某些功能的喪失，如生物相容性。

1.2 紫外線照射

紫外線照射是膠原改性的一種常用方法，紫外線可以被蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸殘基（主要是色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）所吸收，導(dǎo)致這些氨基酸殘基被光電離產(chǎn)生溶劑化電子，溶劑化電子可以與游離的巰基和具有雙鍵的基團反應(yīng)，形成分子內(nèi)與分子間的共價交聯(lián)[7]。梁志紅等人[8]將質(zhì)量濃度為0.4 g/L的I型膠原蛋白溶液鋪展成膜，用波長為254 nm的紫外線照射處理3 h后用原子力顯微鏡觀察了膠原蛋白液膜中膠原分子的形貌，發(fā)現(xiàn)在此質(zhì)量濃度下，膠原分子自組裝形成的膠原纖維交聯(lián)度明顯增加，形成更粗的膠原纖維且互相交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表明了紫外線照射確實可以導(dǎo)致膠原分子之間的相互交聯(lián)。Wenhang Wang等人[9]分析了紫外照射處理膠原蛋白膜的物理特性，發(fā)現(xiàn)用波長為365 nm的紫外光照射處理后，膠原蛋白膜的抗拉強度、抗溶脹性和熱穩(wěn)定性均有所提高，但膜的斷裂伸長率降低。紫外照射處理可以一定程度提高膠原蛋白膜的力學(xué)性能，降低其溶脹性，提高熱穩(wěn)定性，拓展其應(yīng)用范圍。值得注意的是，也有研究報道發(fā)現(xiàn)[10-11]，紫外照射處理可以破壞維持膠原分子三股螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵，導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)改變，反而使得膠原蛋白膜的力學(xué)性能出現(xiàn)一定程度的降低?？赡芘c接受紫外照射處理的膠原來源、紫外線波長、照射劑量、照射時間等因素有關(guān)。因此，合適的紫外照射處理條件對獲得具有特定性能的膠原蛋白膜具有重要意義。

1.3 γ-射線輻照

γ-射線輻照是利用高能射線產(chǎn)生大量的自由基，引發(fā)聚合物分子一系列的化學(xué)反應(yīng)，使得高分子聚合物的內(nèi)部形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，用以增強材料的性能。膠原蛋白分子中的苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸等氨基酸被自由基氧化，氧化產(chǎn)物與臨近的氨基酸可形成穩(wěn)定的共價交聯(lián)[12]。林曉艷等人[13]將新鮮小牛皮和牛跟腱胃蛋白酶酶解的膠原成膜后在冷凍條件下，分別接受15，25，35 kGy的60Co源γ-射線輻照處理，紅外光譜分析表明，輻照處理使膠原蛋白膜發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，膜結(jié)構(gòu)更加有序化，膜的溶脹度顯著減少，抗酶解能力顯著增加。但同時也發(fā)現(xiàn)牛皮膠原蛋白膜接受35 kGy輻照處理后，出現(xiàn)了部分有序的膠原螺旋結(jié)構(gòu)向無序化或無規(guī)線團結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象。Magda J等人[14]的研究也表明適當(dāng)劑量的γ-射線輻照可以顯著提高濕態(tài)膠原蛋白膜的交聯(lián)度，對結(jié)構(gòu)的破壞很少，但是對干態(tài)樣品，則會引起膠原蛋白的變性和有序結(jié)構(gòu)的破壞。

2 化學(xué)改性

膠原蛋白膜的化學(xué)改性是在膠原分子中引入功能性基團，使其與膠原蛋白分子側(cè)鏈中的活性基團如氨基、羧基和羥基或膠原分子中的酰胺鍵作用，通過在膠原分子內(nèi)和分子間形成氫鍵、離子鍵、疏水作用等次級鍵和共價鍵改變膜結(jié)構(gòu)，從而改善膠原蛋白膜的機械性能、熱穩(wěn)定性、溶脹性等物理化學(xué)特性。

2.1 傳統(tǒng)化學(xué)改性方法

傳統(tǒng)的膠原蛋白膜化學(xué)改性方法是使用醛類（如甲醛和戊二醛等）、碳化二亞胺類、環(huán)氧類等有機化學(xué)交聯(lián)劑劑，其中廣泛使用的是醛類交聯(lián)劑。醛類交聯(lián)劑可與蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團中的氨基之間交聯(lián)形成Schiff堿，形成穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在所有醛類中戊二醛與膠原蛋白的交聯(lián)效果最好，其交聯(lián)作用是不可逆的，形成的膠原蛋白膜有很好的力學(xué)性能、物理化學(xué)穩(wěn)定性和抗酶解能力[1，15]。雖然這些化學(xué)交聯(lián)劑的交聯(lián)效果明顯，可以顯著改善膠原蛋白膜的性能，但一般的化學(xué)交聯(lián)劑有一定的毒性[16]，因此這些化學(xué)交聯(lián)劑改性的膠原蛋白膜材料在醫(yī)藥行業(yè)，特別是在食品包裝領(lǐng)域的應(yīng)用受到了極大的限制。

2.2 新型化學(xué)改性方法

近年來，許多研究者致力于尋找毒性更低或無毒的交聯(lián)劑用于膠原蛋白膜改性，其中雙醛淀粉、氧化海藻酸鈉等天然高分子化合物的衍生物和來源于植物的天然多酚類化合物等毒性很低或基本無毒，可以作為食品或藥品的原輔料應(yīng)用于醫(yī)藥制造和食品加工領(lǐng)域，而且這些化合物存在可與蛋白質(zhì)交聯(lián)的活性基團。因此，近年來，研究者開始嘗試將這些交聯(lián)劑應(yīng)用于膠原蛋白膜的改性。

雙醛淀粉是由高碘酸鹽與淀粉反應(yīng)制得[17]。雙醛淀粉中由于活潑的醛基官能團含量豐富，因此具有許多優(yōu)秀的物化生化特性，如堿溶性、易糊化性、易交聯(lián)性等，被廣泛應(yīng)用于造紙、食品、醫(yī)藥、皮革、日用化工等領(lǐng)域[18-19]。與傳統(tǒng)的醛類交聯(lián)劑如戊二醛類似，雙醛淀粉由于含有大量活性醛基，它可與膠原蛋白分子中的賴氨酸和羥賴氨酸等氨基酸側(cè)鏈上的ε-氨基反應(yīng)生成Schiff堿的穩(wěn)定化學(xué)結(jié)構(gòu)從而實現(xiàn)膠原蛋白的相互交聯(lián)[20]。眾多研究表明，在膠原或膠原水解物明膠中添加一定量的雙醛淀粉，可以顯著提高膠原蛋白膜的機械強度、耐熱性、阻濕性和耐水性，很好地改善膠原蛋白膜材料在各種應(yīng)用環(huán)境中的性能穩(wěn)定性[21]。膠原與雙醛淀粉的交聯(lián)作用提高了膠原蛋白膜材料強度和穩(wěn)定性，擴大了材料的應(yīng)用范圍。

和雙醛淀粉相似，氧化海藻酸鈉是另一種由天然生物大分子——海藻酸鈉，與高碘酸鹽反應(yīng)生成的一種新型低毒性交聯(lián)劑，由于其分子中含有活性醛基，因此其與膠原等蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)原理和雙醛淀粉是一樣的，膠原蛋白與氧化海藻酸鈉交聯(lián)后，并不改變膠原分子中的三螺旋結(jié)構(gòu)，交聯(lián)后的膠原蛋白能夠形成更為致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顯著提高膠原蛋白膜的機械強度、熱穩(wěn)定性和親水性，同時形成的膠原蛋白膜具有很好的細胞相容性[22-23]。另有研究表明，氧化海藻酸鈉的分子量對膠原的理化特性有著決定性作用，小分子量的氧化海藻酸鈉更有利于提高膠原的熱穩(wěn)定等性能[24]。此外，還有研究將氧化海藻酸鈉用于提高膠原-殼聚糖共混膜和明膠膜的材料性能，也取得了很好的效果[25-26]。

多酚類化合物是指植物成分中分子結(jié)構(gòu)上有若干個酚羥基的化學(xué)物質(zhì)的總稱，包括黃酮類、單寧類、酚酸類、花色苷類等。由于多酚類物質(zhì)含有帶負電荷的活性酚羥基，且該羥基可被氧化成醌或半醌，因此多酚與蛋白質(zhì)之間可以通過非共價作用（如氫鍵、疏水作用力、離子鍵等）或共價作用形成蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物[27-28]。因此，利用多酚的這種特性，有研究者嘗試將多酚類化合物應(yīng)用于膠原蛋白膜的改性，取得了較好的效果。鄧依等人[29]用不同濃度單寧酸對膠原蛋白膜進行改性研究，結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)，隨著單寧酸濃度的增加，膜的機械強度顯著改善，膜的耐酶解性能增強，熱穩(wěn)定也有所提高。紅外光譜顯示單寧酸的酚羥基與膠原分子發(fā)生了多點氫鍵結(jié)合，膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)保持完整。Lirong He等人[30]用另一種多酚類化合物——原花青素，對膠原蛋白膜進行改性也取得了類似的效果。

3 膠原蛋白膜的酶法改性

酶法交聯(lián)具有催化效率高、反應(yīng)條件溫和的特點，一類蛋白酶可以催化蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈基團的脫除、轉(zhuǎn)移和鍵和，從而發(fā)生共價交聯(lián)，實現(xiàn)膠原改性，這類蛋白酶的代表是谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Transglutaminase，TG）。而一類蛋白酶則可以催化小分子交聯(lián)劑形成易于與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈基團交聯(lián)的活性基團，從而通過小分子交聯(lián)劑的橋接實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分子間和分子內(nèi)交聯(lián)，這類蛋白酶的主要是多酚氧化酶類（polyphenol oxidase，PPO）。

3.1 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶催化改性

TGase可通過氨基的導(dǎo)入、交聯(lián)及脫氨基3種途徑促進蛋白交聯(lián)用來改善成膜性能。如TGase能催化轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)，形成ε-（γ-谷氨酰胺基） 賴氨酸結(jié)構(gòu)，從而蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間發(fā)生共價交聯(lián)形成聚合物，有利于形成致密的的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1]。Ray-Neng Chen等人[31]用TGase作為交聯(lián)劑用于豬皮膠原蛋白的交聯(lián)。結(jié)果顯示，經(jīng)過TGase交聯(lián)反應(yīng)后，膠原溶液的黏度增加，該膠原溶液澆鑄成膜后膜的抗拉強度顯著增加，熱穩(wěn)定性提高，同時通過MTT檢測，該膠原蛋白膜沒有細胞毒性，具有很好的生物相容性。結(jié)果表明，TGase在pH值3～4的酸性條件下進行交聯(lián)反應(yīng)所得到膠原蛋白膜的性能更好。

3.2 多酚氧化酶催化改性

多酚氧化酶是一類含銅的氧化還原酶。PPO可以催化蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基，與蛋白質(zhì)通過非肽鍵相連的酚類化合物氧化，引起蛋白質(zhì)交聯(lián)。因此，多酚氧化酶也可以用來改變蛋白膜的材料性能。SJus等人[32]的研究表明漆酶和酪氨酸酶可以催化兒茶素的氧化產(chǎn)物與膠原分子交聯(lián)，顯著提高膠原蛋白膜的抗拉強度和抗膠原蛋白水解酶的酶解能力。

4 結(jié)語

從近十幾年的研究報道可以看出，不同的改性方法均可一定程度改善膠原蛋白膜材料性能，其中物理改性方法交聯(lián)作用弱，不均勻且不易控制，因此其通常是作為改性輔助手段使用。傳統(tǒng)的化學(xué)改性方法由于所使用的交聯(lián)劑存在毒性問題也逐漸被淘汰。而綠色、天然、高效、安全和可控的化學(xué)改性劑和改性酶制劑的開發(fā)和應(yīng)用則成為現(xiàn)在及將來改善膠原蛋白膜材料性能研究熱點，該領(lǐng)域的研究將對推動膠原蛋白膜在醫(yī)藥、食品、日用化工產(chǎn)品中的應(yīng)用及擴大其應(yīng)用范圍產(chǎn)生積極而深遠的影響。

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