霉菌和酵母菌檢測技術(shù)的研究進展

劉 桐，劉 爽，司 南，苑 帥，任大勇，陳 萍

（吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，長春，吉林 130118）

0 引言

霉菌和酵母菌計數(shù)用來測定食品被污染的程度，是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量必不可少的指標[1]。霉菌和酵母菌的污染會導致食品營養(yǎng)價值下降、腐敗變質(zhì)。若食用被霉菌、酵母菌污染的食品，會造成腸胃不適，引起疾病發(fā)生。霉菌對于食品的最大風險能產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物——霉菌毒素，引起各種急、慢性中毒，并可能致癌。因此，人們愈來愈重視食品中霉菌和酵母菌污染對人體造成的危害。在我國飲料、堅果制品、米面制品、糕點類等食品中，把霉菌和酵母菌作為食品污染的指示菌進行監(jiān)測，被列入國標GB 4789系列食品安全微生物常規(guī)檢測項目之一[2]。目前國內(nèi)對霉菌和酵母菌的計數(shù)檢測仍采用國標的平板檢測法，雖然檢測結(jié)果準確，但程序復雜、檢測周期過長。對當前國內(nèi)外霉菌和酵母菌的檢測技術(shù)現(xiàn)狀進行綜述，以期為研究出更高效的霉菌和酵母菌檢測技術(shù)研究提供參考。

1 霉菌和酵母菌概述

霉菌和酵母菌都是真菌，與人們?nèi)粘Ｉ盥?lián)系十分密切。霉菌不僅應用于傳統(tǒng)的釀酒制醬和發(fā)酵食品中，在農(nóng)業(yè)、紡織、食品、醫(yī)藥和皮革制造等領(lǐng)域都起著極為重要的作用。但是，有些霉菌（黃曲霉、灰綠曲霉、綠青霉等）能在食品谷物上生長并產(chǎn)生真菌毒素。其中，黃曲霉毒素有明顯的致癌作用，嚴重危害消費者的身體健康[3]。常見的霉菌有毛霉菌、根霉菌、曲霉、青霉等9類?，F(xiàn)今發(fā)現(xiàn)對糧食造成污染的霉菌有150多種，檢測糧食中的霉菌，對于指導糧食儲備、保護人類和動物飲食安全意義重大[4]。酵母菌在釀造、食品、醫(yī)藥工業(yè)等方面占有重要地位。酵母菌有1 000多種，與食品有關(guān)的酵母菌主要有假絲酵母、啤酒酵母、面包酵母等[5]。致病性的酵母菌含量過高會引起深部真菌感染。因此，對食品中霉菌和酵母菌數(shù)量的監(jiān)測是十分必要的。

2 霉菌和酵母菌檢測技術(shù)的現(xiàn)狀

國內(nèi)外目前對霉菌、酵母菌的檢測方法主要有平板檢測法、顯色培養(yǎng)基計數(shù)法、WKJ-Ⅱ型微生物快速檢測系統(tǒng)、流式細胞儀計數(shù)法和測試片法。根據(jù)GB 4789.15—2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)采用平板計數(shù)法，平板計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當稀釋之后，取一定量的稀釋液接種到平板上，培養(yǎng)基為孟加拉紅或馬鈴薯葡萄糖瓊脂，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)，檢測結(jié)果準確[6]。但平板法也有很多缺點，如需要培養(yǎng)時間長，霉菌前期生長緩慢，后期菌絲過度生長蔓延影響計數(shù)。

顯色培養(yǎng)基計數(shù)法是利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應顯色底物顯色的原理來檢測微生物的新型培養(yǎng)基，利用顯色培養(yǎng)基進行微生物的篩選和分離。Zhao L等人[7]用顯色培養(yǎng)基Candi Select 4對非白假絲酵母念珠菌屬物種進行鑒別，該顯色培養(yǎng)基特異性高，其中白色念珠菌特異性為100%，而克柔念珠菌為100%，熱帶假絲酵母99.8%，光滑假絲酵母95.7%。Ghelardia E等人[8]用CCA顯色培養(yǎng)基對521株酵母菌進行分離鑒定，培養(yǎng)基的敏感性和特異性均超過99.4%。Yucesoy M等人[9]用Chromogenic Candida Agar，BiGGY瓊脂和白色念珠菌ID2瓊脂3種顯色培養(yǎng)基推定鑒定215酵母菌株，敏感性和特異性分別為100%和100%，91%和92.7%，99.2%和92.7%。張志強等人[10]應用科瑪嘉顯色培養(yǎng)基對120份婦科門診病人分泌物標本進行念珠菌的分離培養(yǎng)，與常用的沙氏培養(yǎng)基比較。以沙氏培養(yǎng)基為參照，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基的靈敏度87.5%，特異度89%，符合率88.3%，2種培養(yǎng)基具有相同的檢出率（χ2=0.07，p＞0.05），有很好的特異度和符合率。胡錫池等人[11]應用科馬嘉顯色培養(yǎng)基對250份樣本進行酵母菌鑒定時經(jīng)VITEKYBC卡確認后總的符合率94.6%。顯色培養(yǎng)基雖然改進了傳統(tǒng)培養(yǎng)基在生化鑒定方面的不足，但仍需要樣品前處理和滅菌等過程，培養(yǎng)時間長。

WKJ-Ⅱ型微生物快速檢測系統(tǒng)以計算機處理系統(tǒng)為核心，結(jié)合生物制片技術(shù)、光學顯微鏡、圖像采集裝置，用分類器進行模式識別檢測出目標微生物的數(shù)量，并進行自動計數(shù)。鄭東輝[12]用孔徑為3 μm的混合纖維素微孔濾膜對酸奶中的霉菌和酵母菌進行富集，滴加次甲基藍染色液染色，制成涂片后在微生物快速檢測儀中進行檢測。此方法檢測酵母菌的檢測范圍為2～1×106CFU/mL，霉菌的檢測范圍為2～1×105CFU/mL，此方法與國標法檢測結(jié)果無差異顯著性。這2種方法檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，二者具有良好的相關(guān)性。雖然此方法檢測時間短，但對操作人員要求高，后期處理復雜，成本高。

流式細胞儀是一種對細胞或生物粒子的結(jié)構(gòu)、功能及相互間作用進行多參數(shù)分析的儀器檢測技術(shù)。該技術(shù)無需增菌，直接對食品中的活菌數(shù)進行檢測，可檢測出1個活的微生物或活細胞，并在90～100min內(nèi)出檢測結(jié)果，已廣泛應用于水、液態(tài)加工食品、飲料等行業(yè)。劉道亮等人[13]采用流式細胞技術(shù)檢測飲料中的霉菌和酵母菌，流式細胞儀檢測果汁樣品中霉菌、酵母菌的檢出限為10 CFU/mL。流式細胞儀檢測霉菌和酵母菌計數(shù)與平板計數(shù)線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 7，0.999 9，有很好的符合性。但此方法只用于液體食品的檢測，有一定的局限性。

測試片是指以滅菌濾紙、無紡布或冷水可溶凝膠等吸收培養(yǎng)基作為載體，將特定的培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)附著在載體上面，通過微生物在其上面的生長、顯色情況來測定食品中微生物的一種產(chǎn)品[14]。在戴昌芳等人[15]的研究中將順德萬家康科技實業(yè)公司生產(chǎn)的霉菌和酵母菌計數(shù)測試紙片與國標法檢測效果進行比較，2種方法檢測樣品的符合率高達99.47%，統(tǒng)計學無顯著性差異 （χ2=1，p＞0.05）。余淑冰等人[16]將銳朗霉菌和酵母菌計數(shù)測試片與國標法檢測結(jié)果進行比較，霉菌和酵母菌檢出結(jié)果差異無顯著性（p＞0.05），總符合率96.20%。張建明等人將其實驗室自主研發(fā)的測試片與3M霉菌和酵母菌計數(shù)測試片的檢測效果進行了評價，2種紙片的生長率差異無統(tǒng)計學意義（p=0.399），2種測試片和霉菌、酵母菌的生長率均達到 0.9以上。Teramura H等人[17]將 SkYM（Sanita-kun R公司的霉菌和酵母測試片）、DRBC（NISSUI制藥有限公司的孟加拉紅培養(yǎng)基）、PYM（3M公司的霉菌和酵母菌測試片）、CDYM（NISSUI制藥有限公司的霉菌和酵母測試片） 4種產(chǎn)品用于100種自然污染食品中霉菌和酵母菌的檢測。SkYM（48 h） 與DRBC，PYM，CDYM的線性相關(guān)系數(shù)分別是 0.921，0.929和 0.947，而 SkYM（72 h） 和DRBC，SkYM，CDYM之間的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.948，0.877和0.911。測試片法雖然成本低、檢測性能好，但霉菌菌絲的蔓延和顯色效果的不穩(wěn)定性影響計數(shù)準確性，也需進一步研究解決這些問題。

3 霉菌和酵母菌顯色計數(shù)測試片的研究

測試片是一項微生物快速檢測新方法，它由上下2層薄膜組成，下層的聚乙烯薄膜上印有網(wǎng)格并且覆蓋有微生物生產(chǎn)所需的培養(yǎng)基，其中加入染色劑、顯色劑，增強菌落的目視效果；上層是聚丙烯薄膜并加入冷水可溶凝膠。使用方法簡單方便，檢樣直接接種測試片，適宜溫度培養(yǎng)后計數(shù)。

霉菌和酵母菌測試片研究的關(guān)鍵是對霉菌和酵母菌特異選擇培養(yǎng)基中顯色劑的研究。霉菌和酵母菌有復雜的酶系統(tǒng)和代謝過程，有多種的顯色原理與顯色底物可以研究來實現(xiàn)對霉菌和酵母菌顯色計數(shù)測試片的研究。微生物具有復雜多樣的酶系統(tǒng)，胞內(nèi)酶的種類及反應條件可作為微生物分類鑒定的重要依據(jù)。根據(jù)酶的特征設(shè)計對微生物進行快速檢測的一種方法，基本原理是：在分離培養(yǎng)基中加入檢測某些菌種的特異性酶底物，該底物為人工合成，由產(chǎn)色基團和微生物可代謝物質(zhì)組成，通常為無色，但在特異性酶作用下游離出發(fā)色基團并顯示一定顏色，直接觀察菌落顏色即可對菌種做出鑒定，這種顯色底物就是顯色劑。食品中霉菌和酵母菌的計數(shù)PetrifilmTM測試片法中添加5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸為指示劑。SkYM測試片中添加2-（2-甲氧基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基四氮唑為顯色劑，使霉菌和酵母菌生成紅色菌落[17]。吳清平等人也做了相關(guān)研究。在Albicans ID瓊脂平板上，該顯色培養(yǎng)基加入特異性顯色底物己糖胺，白假絲酵母呈現(xiàn)光滑的藍色菌落。CDA顯色培養(yǎng)基，加入顯色底物VLPA-GLcNAC 0.32 g/L。檢測原理是以菌株產(chǎn)生的葡糖胺酶催化特異性的底物VLPAGLcNAC水解而顯色。王則宇自制念珠菌顯色培養(yǎng)基中的顯色劑為N-甲吲哚-N-乙酰-β-D-氨基己糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚-吡咯磷酸脂和甘氨酸-L-精氨酸-L-精氨酸-對硝基萘胺。通過這3種顯色底物的聯(lián)合使用，可以有效地對念珠菌直接鑒別。趙貴明研制的一種新型念珠菌顯色培養(yǎng)基中使用的顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷，可以將都柏林念珠菌與白色念珠菌區(qū)分開。念珠菌顯色培養(yǎng)基CCA中加入5-溴-4-氯-3-吲哚基/N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷和5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸對甲苯胺鹽作為顯色底物[8]。而霉菌與酵母菌顯色計數(shù)測試片的研究還需解決酵母菌生長顯色所需時間長、顯色劑不能指示所有的霉菌和酵母菌菌落導致漏計等問題。

4 結(jié)語

霉菌和酵母菌的檢測技術(shù)還有很大的提升空間。我國食品安全國家標準，食品微生物學檢驗，霉菌和酵母計數(shù)中的方法也只是平板計數(shù)。雖然國內(nèi)外都建立了很多霉菌和酵母菌的檢測方法，但都存在很多問題。最關(guān)鍵的問題是霉菌菌絲過度蔓延生長影響計數(shù)、檢測周期長，這是當今和未來研究需要解決的問題。在未來是試驗研究中需要不斷地探索和努力來研究出更方便快捷的檢測技術(shù)，才會讓人類吃上安全、健康的食品，這對人類社會的發(fā)展是至關(guān)重要的。

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