劉 群 ， 管政兵 ， 蔡宇杰 ， 廖祥儒 *

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

纖維素是自然界含量最多、分布最廣的一種多糖，也是天然的可再生能源物質(zhì)，在醫(yī)藥、食品、工業(yè)、農(nóng)業(yè)中有著重要的作用。纖維素酶是降解纖維素形成葡萄糖的一組復(fù)合酶的總稱，主要包括由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成。其中，β-葡萄糖苷酶 （β-glucosidase，EC3.2.1.21）又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，是一種能催化水解β-葡萄糖苷鍵生成葡萄糖的酶，是纖維素酶系中一類重要的酶[1]。纖維素酶在外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶作用下水解成纖維二糖，纖維二糖在β-葡萄糖苷酶的作用下水解為葡萄糖[2]。β-葡萄糖苷酶的研究可以追溯到1837年，Liebig等[3]首次在苦杏仁汁中發(fā)現(xiàn)了該酶。纖維素酶的最適pH值一般在4.5～6.5，少數(shù)在偏堿性pH范圍內(nèi)發(fā)揮作用的纖維素酶稱為堿性纖維素酶。隨著現(xiàn)代工業(yè)的不斷發(fā)展，對(duì)堿性纖維素酶的需求量越來(lái)越大，它主要應(yīng)用于洗滌行業(yè)[4-6]、造紙行業(yè)、紡織行業(yè)以及醫(yī)藥食品當(dāng)中。

上世紀(jì)70年代初日本生物學(xué)家從芽孢桿菌中首先發(fā)現(xiàn)堿性纖維素酶[7]，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的堿性纖維素酶基因被發(fā)現(xiàn)，包括堿性β-葡萄糖苷酶。由于植物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶酶活比微生物來(lái)源的低的多，所以目前研究的對(duì)象主要集中于微生物中[8]。微生物來(lái)源的堿性β-葡萄糖苷酶可以應(yīng)用于紡織行業(yè)，因?yàn)棣?葡萄糖苷酶在堿性條件下時(shí)更有利于形成聚合物[9]。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)堿性β-葡萄糖苷酶在微生物循環(huán)、生產(chǎn)工業(yè)燃料、減少工業(yè)生產(chǎn)中的環(huán)境污染等方面有重大應(yīng)用。Meng等[10-11]發(fā)現(xiàn)海洋微生物中能產(chǎn)生耐堿性強(qiáng)的β-葡萄糖苷酶及β-葡聚糖酶。但目前海洋微生物在工業(yè)中的應(yīng)用還有一定難度。Kaur等人[12]報(bào)道了青霉菌能產(chǎn)生高濃度的β-葡萄糖苷酶，并且在堿性條件下表現(xiàn)出明顯的活性和較好的熱穩(wěn)定性但并未提及具體酶活大小。Mao等人[13]采用大腸桿菌E.coli BL21（DE3）進(jìn)行β-葡萄糖苷酶的異源表達(dá)，所得重組酶的最適pH值為8.0，但當(dāng)pH值上升到9.0時(shí)剩余酶活在不到40%，且在堿性條件下穩(wěn)定性較差。

1989年，Gonzalez首次將β-葡萄糖苷酶基因克隆出來(lái)并成功表達(dá)，但限于當(dāng)時(shí)技術(shù)，表達(dá)活力并不高，粗酶液的酶活力只有0.364 U/mL[14]。朱寶龍[15]構(gòu)建的畢赤酵母工程菌所表達(dá)的重組β-葡萄糖苷酶酶活可達(dá)38 U/mL。然而，目前國(guó)內(nèi)對(duì)堿性β-葡萄糖苷酶的研究?jī)H僅停留在探索階段，對(duì)酶活大小以及發(fā)酵產(chǎn)酶水平報(bào)道較少。因此通過(guò)基因克隆技術(shù)，構(gòu)建堿性β-葡萄糖苷酶的基因工程菌是當(dāng)前實(shí)現(xiàn)堿性β-葡萄糖苷酶量產(chǎn)的關(guān)鍵步驟。

針對(duì)以上問(wèn)題，作者從蜂蜜中篩選出一株來(lái)源安全并在堿性環(huán)境中生長(zhǎng)良好的高地芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4，通過(guò)對(duì)該芽孢桿菌中的β-葡萄糖苷酶基因bglA克隆表達(dá)，獲得了耐堿性好、熱穩(wěn)定較好的重組β-葡萄糖苷酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 所用菌株是從實(shí)驗(yàn)室已有的蜂蜜中篩選，經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rRNA基因序列分析鑒定為芽孢桿菌屬 （Bacillus），命名為 Bacillus altitudinis SYBC hb4[16]。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒和DNA膠回收試劑盒：購(gòu)自上海生工公司；對(duì)硝基苯基β-D-葡萄糖苷：購(gòu)于Sigma（St.Louis，MO）公司；大腸桿菌 JM109 感受態(tài)細(xì)胞、16S rRNA基因測(cè)序引物、應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、氨芐青霉素 （Amp）、Taq酶、pColdII載體：購(gòu)自TaKaRa公司；其他常規(guī)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基 （g/L）：胰蛋白胨10，NaCl 10， 酵母粉 5；pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌 20 min。固體培養(yǎng)基再額外添加2 g/dL的瓊脂。

LB-Amp培養(yǎng)基 （g/L）：LB固體培養(yǎng)基滅菌至40～50℃后加入Amp，終質(zhì)量濃度為0.1 mg/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4總DNA的提取 應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒按照其操作提取Bacillus altitudinis SYBC hb4菌體基因組總DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其質(zhì)量和純度，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。

1.2.2 β-葡萄糖苷酶基因的PCR擴(kuò)增 根據(jù)芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4全基因組測(cè)序的序列設(shè)計(jì)上下游引物g1和g2（如表1所示）。兩條引物的5’端分別含有單一的BamI和PstI（表1中下劃線所示）限制性酶切位點(diǎn)。以上述芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4基因組為模板，以上述g1和g2為特異性引物，擴(kuò)增出芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4中β-葡萄糖苷酶基因（bglA）全長(zhǎng)編碼框序列（1 419 bp）。PCR反應(yīng)條件為：以基因組DNA為模板，在50 μL反應(yīng)體系中，加入5 μL 10 ×ExTaqBuffer、2 μL 25 mmol/LMgCl2、4 μL 2.5 mmol/LdNTP混合物、以及20 μmol/L上下游引物各1μL、Ex Taq 酶 （Takara 公司）1 μL 及 DNA 模板 1 μL、補(bǔ)水至50 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min，再進(jìn)行30個(gè)循環(huán) （98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min），最后于72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用割膠回收試劑盒回收1 419 bp的DNA條帶，置4℃冰箱中保存。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table 1 Sequences of the PCR primers

1.2.3 β-葡萄糖苷酶的基因克隆與序列分析 目的片段經(jīng)過(guò)割膠回收后，分別用BamHI和PstI對(duì)膠回收產(chǎn)物以及pColdII質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。雙酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，將pColdII質(zhì)粒與目的基因片段16℃連接過(guò)夜。將20 μL的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有Amp的平板上篩選，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。經(jīng)BamHI和PstI雙酶切驗(yàn)證陽(yáng)性質(zhì)粒，并由上海尼桑生物科技有限公司完成測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。

以bglA基因?yàn)槟０澹肗CBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast在線工具進(jìn)行序列同源性分析。

1.2.4 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá) 按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量將培養(yǎng)過(guò)夜重組大腸桿菌接種于50 mL含有Amp的LB培養(yǎng)基中，置于37℃、轉(zhuǎn)速220 r/min培養(yǎng)至OD600值約為0.4，15℃靜置30 min，添加IPTG到終濃度0.5 mmol/L培養(yǎng)約24 h。培養(yǎng)完成后收集細(xì)胞，超聲破碎，破碎液4℃、8 000 r/min離心20 min，收集上清液即粗酶液，測(cè)定酶活驗(yàn)證有無(wú)活性，進(jìn)一步SDS-PAGE驗(yàn)證相對(duì)分子質(zhì)量大小。

1.2.5 酶活測(cè)定方法 取0.5 mL粗酶液，加入0.5 mL 30 mmol/L對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷。將此反應(yīng)混合液在60℃水浴鍋反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，立即加入2.5 mL 1 mol/L的Na2CO3終止液終止反應(yīng)，冷卻至室溫后在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。另外，取相同條件下粗酶液在沸水中煮沸5 min后再加入底物中，混合反應(yīng)液在60℃水浴鍋反應(yīng)1 h，作為空白對(duì)照組。

酶活力單位定義：1 mL酶液每分鐘釋放出1 μmol對(duì)硝基苯酚的酶量定義為一個(gè)酶活力單位[17]。

1.2.6 重組β-葡萄糖苷酶的分離純化 將重組菌體經(jīng)破碎離心后，收集的上清液過(guò)孔徑0.22 μm的濾膜，選擇使用1 mL HisTrap HP組氨酸標(biāo)簽親和層析柱 （鎳柱）進(jìn)行分離純化。純化開(kāi)始時(shí)先用Blinding buffer（2 mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L咪唑）梯度洗脫結(jié)合上的蛋白質(zhì)，收集穿透液以及洗脫峰的蛋白質(zhì)。測(cè)定有無(wú)酶活，進(jìn)一步SDS-PAGE蛋白質(zhì)條帶是否單一，分析分離純化情況。

1.2.7 重組β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究 以對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物，與不同pH的緩沖液在60℃下水浴反應(yīng)1 h，測(cè)定酶活，確定重組β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH。然后在最適pH下值在， 在 30、40、50、60、70、80、90 ℃下水浴反應(yīng) 1 h，測(cè)定酶活，確定重組β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度。以反應(yīng)液的最高酶活為100%計(jì)算相對(duì)酶活。

以對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物研究重組β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。用pH值為7.0的酶液在60℃水浴保溫不同時(shí)間后測(cè)定酶活，并以該條件下未經(jīng)保溫處理的酶液酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。作出酶活在60℃時(shí)隨時(shí)間的變化曲線。將相同量的酶液分別在不同pH值（pH 3.0～8.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH 8.0～9.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液，pH 9.0～10.0碳酸鈉-碳酸氫鈉）下30℃水浴保溫1 h后于60℃測(cè)定剩余酶活。以各自的初始酶活作為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.2.8 金屬離子對(duì)重組β-葡萄糖苷酶酶活的影響將相同量的酶液加入到終濃度為0.5 mmol/L和5 mmol/L的不同金屬離子溶液中，以對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物測(cè)定酶活，以未經(jīng)任何處理的酶液的酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。比較不同濃度不同金屬離子對(duì)重組β-葡萄糖苷酶酶活的影響

2 結(jié)果與討論

2.1 β-葡萄糖苷酶基因的克隆、鑒定及表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1 基因bglA序列聚類分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，以bglA基因的核苷酸序列為模板利用Blast在線工具序列對(duì)比進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，其核苷酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的β-葡萄糖苷酶Bacillus pumilus W3同源性達(dá)98%。

2.1.2 β-葡萄糖苷酶基因的PCR擴(kuò)增 根據(jù)bglA的基因序列，設(shè)計(jì)了上下游引物。通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法以芽孢桿菌Bacillus altitudinis SYBC hb4的全基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳驗(yàn)證得到大小1 419 bp的目的片段（圖1）。將片段測(cè)序后，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增得到了β-葡萄糖苷酶基因片段。

圖1 Bacillus sp.SYBC hb4的bglA基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of bglA of Bacillus sp.SYBC hb4 by PCR

2.1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用BamHI和PstI將PCR回收的目的片段進(jìn)行雙酶切然后與經(jīng)過(guò)相同限制性內(nèi)切酶雙酶切過(guò)的質(zhì)粒pColdII 16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中，挑選陽(yáng)性克隆的轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒就行雙酶切驗(yàn)證（圖2）。所得重組質(zhì)粒pColdII-bglA（圖3）經(jīng)測(cè)序結(jié)果與目的基因的堿基序列一致，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pColdⅡ-bglA的酶切驗(yàn)證Fig.2 Identification of recombinant plasmid pColdⅡ-bglA

圖3 重組質(zhì)粒pColdⅡ-bglA圖譜Fig.3 Map of recombinant plasmid pColdⅡ-bglA

2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

2.2.1 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒 pColdII-bglA轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，將呈陽(yáng)性克隆的重組菌保存后按照1.2.4中的方法加IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)24 h后收集菌體進(jìn)行超聲破碎，破碎后低溫離心收集上清液即粗酶液測(cè)定酶活和SDS-PAGE驗(yàn)證蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小。通過(guò)軟件計(jì)算bglA的蛋白質(zhì)大小為53.92×103，以不加IPTG誘導(dǎo)為對(duì)照，如圖4可以看出SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，在相對(duì)分子量53×103附近出現(xiàn)了明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶。

2.2.2 重組蛋白bglA的分離純化 粗酶液使用1 mL HisTrap HP組氨酸標(biāo)簽親和層析柱（鎳柱）進(jìn)行分離純化，純化結(jié)果如圖5所示。本實(shí)驗(yàn)中所選用的質(zhì)粒pColdII帶有組氨酸標(biāo)簽，經(jīng)鎳柱純化的蛋白質(zhì)，具有組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)可以跟鎳結(jié)合，不帶有組氨酸標(biāo)簽的雜蛋白質(zhì)被去除，得到的蛋白質(zhì)相對(duì)較純。經(jīng)鎳柱純化后重組β-葡萄糖苷酶經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證后，通過(guò)圖5可以看出，與粗酶液相比，純化后的蛋白質(zhì)在53×103處有一條明顯的單一條帶，但是也有幾條雜帶，說(shuō)明純化后蛋白質(zhì)還需進(jìn)一步純化。各步純化結(jié)果如表2所示，最后所得蛋白質(zhì)的純化倍數(shù)為2.70，回收率達(dá)到85.32%。

圖4 重組表達(dá)bglA蛋白的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE anslysis of the recombinant bglA

圖5 純化后重組β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE anslysis of the purified recombinant β-glucosidase

表2 重組β-葡萄糖苷酶的分離純化水平Table 2 Level of recombinant β-glucosidase be purified

2.3 重組β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.3.1 重組β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性的研究 以對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物，研究不同溫度對(duì)底物反應(yīng)的影響，從而找到酶的最適反應(yīng)溫度。如圖6（a）可以看出重組的β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，在該溫度下酶活最高。當(dāng)溫度過(guò)低時(shí)，底物分子的運(yùn)動(dòng)速率較慢，其與酶的結(jié)合率低，所以在較低的溫度下酶活比較低；當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，蛋白容易變性，酶比較容易失去活性，因此溫度過(guò)高，酶活也不高。

將重組β-葡萄糖苷酶在pH 7.0、溫度60℃時(shí)水浴保溫不同時(shí)間測(cè)定剩余酶活，考察重組β-葡萄糖苷酶的溫度穩(wěn)定性。如圖6（b）所示，隨著時(shí)間的增加，酶活越來(lái)越低，重組β-葡萄糖苷酶的半衰期大約在150 min，在保溫300 min后仍然有10%的剩余酶活，說(shuō)明該重組β-葡萄糖苷酶有較好的溫度穩(wěn)定性。目前報(bào)道的大腸桿菌重組β-葡萄糖苷酶溫度穩(wěn)定性一般都比較好，如Wolosowska所表達(dá)重組β-葡萄糖苷酶在80℃保溫5 h后剩余酶活仍高達(dá)67%[18]。

圖6 溫度對(duì)重組β-葡萄糖苷酶活性和穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperatureon the activityand stability of recombinant β-glucosidase

2.3.2 重組β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性的研究 酶促反應(yīng)對(duì)pH值的要求很高，不同的pH值對(duì)底物與酶的結(jié)合率有很大影響，它既影響著底物的解離狀態(tài)，又影響酶分子尤其是活性中心的解離狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中研究了不同pH對(duì)重組β-葡萄糖苷酶的影響，如圖7（a）所示，重組β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH約在pH 8.0。在偏酸性條件時(shí)，pH 3.0～5.0之間，酶活較低，說(shuō)明該重組β-葡萄糖苷酶在酸性環(huán)境下較為敏感，隨著酸性增強(qiáng)相對(duì)酶活下降較快。在pH 6.0～9.0之間時(shí)酶活力保持在40%以上，綜上所示，該重組β-葡萄糖苷酶在堿性的環(huán)境下酶活力較高。

將相同酶量的酶液在不同pH條件下水浴保溫1 h后，以對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物，在溫度60℃、pH 8.0條件下測(cè)定重組β-葡萄糖苷酶的酶活，研究該重組β-葡萄糖苷酶在不同pH條件下的穩(wěn)定性。以相對(duì)酶活作出變化曲線，如圖7（b）所示，發(fā)現(xiàn)重組β-葡萄糖苷酶在pH 6.0～9.5之間時(shí)較為穩(wěn)定，剩余酶活在70%以上。在pH 7.0、8.0、8.5、9.0、9.5緩沖液放置1 h后剩余酶活均在90%以上，pH 3.0～5.0時(shí)，剩余酶活在40%以下。說(shuō)明該重組β-葡萄糖苷酶在偏酸性條件下時(shí)不太穩(wěn)定，在中性偏堿性條件下時(shí)有非常好的穩(wěn)定。Mao等人[13]采用大腸桿菌重組表達(dá)β-葡萄糖苷酶雖然最適pH值為8.0，但當(dāng)pH值上升到9.0時(shí)，剩余酶活不到40%，且在堿性條件下穩(wěn)定性較差。作者所構(gòu)建工程菌表達(dá)β-葡萄糖苷酶在堿性條件下的穩(wěn)定性更好。

圖7 pH對(duì)重組β-葡萄糖苷酶活性和穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effectof pH on the activity and stability ofrecombinant β-glucosidase

2.3.3 離子濃度對(duì)重組β-葡萄糖苷酶酶活的影響將相同量的酶液加入到終濃度為0.5 mmol/L和5 mmol/L的不同金屬離子溶液中，以對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物測(cè)定酶活。測(cè)定不同離子濃度的影響時(shí)，以不加任何金屬離子的酶液為對(duì)照組。作出不同濃度不同金屬離子對(duì)酶活的影響，如圖8所示。結(jié)果表明，低濃度的金屬離子對(duì)重組β-葡萄糖苷酶酶活力的影響并不是太大，只有Ni2+抑制了40%左右。當(dāng)用5 mmol/L的金屬離子處理時(shí)，Cu2+、Fe3+、Zn2+分別抑制了84%、83%和87%的酶活。Mg2+和Mn2+對(duì)酶活有促進(jìn)作用，高濃度的Fe2+、Ca2+對(duì)酶活有抑制作用。不同來(lái)源的菌株所產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶，金屬離子濃度對(duì)酶活的影響差異較大。如深海細(xì)菌 Martelella mediterranea[13]，Cu2+和 Zn2+對(duì)酶活有強(qiáng)烈的抑制作用，處理后的剩余酶活不到30%，Mg2+和Mn2+對(duì)酶活有輕微的抑制作用，K+和Na+作用下可以提高酶活。

圖8 金屬離子對(duì)重組β-葡萄糖苷酶酶活的影響Fig.8 Effect of metal ions on the activity of recombinant β-glucosidas

3 結(jié) 語(yǔ)

堿性β-葡萄糖苷酶是堿性纖維素酶的重要組成部分，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，但由于國(guó)內(nèi)對(duì)其的研究報(bào)道較少，產(chǎn)酶水平較低，作者通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建異源表達(dá)載體 E.coli BL21（DE3）/pColdII-bglA實(shí)現(xiàn)堿性β-葡萄糖苷酶的高效表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE結(jié)果分析，低溫誘導(dǎo)24 h后，重組β-葡萄糖苷酶主要以可溶性蛋白存在于破碎后的上清液中，粗酶液酶活可達(dá)到12.40 U/mL。通過(guò)對(duì)重組β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究，結(jié)果表明該β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH值 8.0， 該重組酶在 pH 7.0、8.0、8.5、9.0、9.5 緩沖液放置1 h后剩余酶活均在90%以上，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Mg2+和Mn2+對(duì)酶活有促進(jìn)作用，5 mmol/L的Mg2+能提高約50%的相對(duì)酶活。5 mmol/L的Fe2+、Ca2+對(duì)酶活有抑制作用。

綜上所述，通過(guò)對(duì)所得重組β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究，說(shuō)明該重組β-葡萄糖苷酶在堿性條件下有較好的穩(wěn)定性，具有重大研究前景。

由于此堿性β-葡萄糖苷酶的克隆表達(dá)尚屬早期研究，相較目前β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)酶水平，此重組堿性β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量有待進(jìn)一步提高。對(duì)于實(shí)現(xiàn)堿性β-葡萄糖苷酶在紡織業(yè)、治理環(huán)境污染等方面的應(yīng)用還有待于進(jìn)一步研究。

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